Valutazione della Meccanica Respiratoria sistema nei topi utilizzando la tecnica delle oscillazioni forzate

Riepilogo

Il presente protocollo fornisce una dettagliata descrizione passo-passo le procedure necessarie per eseguire le misurazioni della meccanica del sistema respiratorio, nonché la valutazione della reattività delle vie aeree alla metacolina inalata nei topi usando la tecnica delle oscillazioni forzate (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canada).

Abstract

La tecnica delle oscillazioni forzate (FOT) è un potente strumento, integrativo e traslazionale permettere la valutazione sperimentale della funzione polmonare nei topi in modo completo, dettagliato, preciso e riproducibile. Esso fornisce misurazioni della meccanica del sistema respiratorio attraverso l'analisi dei segnali di pressione e di volume acquisite in reazione ad predefinito, piccola ampiezza, forme d'onda oscillatoria flusso d'aria, che sono tipicamente applicati in apertura delle vie aeree del soggetto. Il presente protocollo dettagli i passaggi necessari per eseguire in modo adeguato le misure oscillazioni forzate nel topo, utilizzando un ventilatore a pistone controllato dal computer (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, QC, Canada). La descrizione è suddivisa in quattro parti: fasi preparatorie, la ventilazione meccanica, misure di funzione polmonare e l'analisi dei dati. Esso comprende anche informazioni su come valutare la reattività delle vie aeree alla metacolina inalata in topi anestetizzati, una comune applicazione di questo technique che si estende anche ad altri esiti e le varie patologie polmonari. Le misurazioni ottenute in topi naive come pure da un modello guidato stress ossidativo di danno delle vie aeree vengono presentati per illustrare come questo strumento possa contribuire ad una migliore caratterizzazione e la comprensione dei cambiamenti fisiologici studiati o modelli di malattie nonché per applicazioni in nuove aree di ricerca.

Introduzione

Caratterizzazione adeguata delle proprietà meccaniche dei polmoni nei piccoli animali è diventato essenziale in quanto la rapida crescita di modelli murini nella scienza respiratoria. Quando è eseguita utilizzando la tecnica delle oscillazioni forzate (FOT), una tecnica utilizzata anche in soggetti umani, queste misurazioni forniscono un approccio potente, integrativo e traslazionale per studiare i cambiamenti fisiologici significativi. UFT misurazioni sono tipicamente ottenuti analizzando i segnali di pressione e di volume acquisite in reazione ad un predefinito, piccola ampiezza, forma d'onda oscillatoria flusso d'aria (indicato anche come perturbazione o segnale di ingresso) applicata in apertura delle vie aeree del soggetto ^1. Nella sua forma più semplice, una perturbazione UFT sarebbe una singola forma d'onda sinusoidale ad una frequenza ben definita. Perturbazioni più complessi consistono tipicamente di una sovrapposizione di una selezione di specifica (primi fra) le forme d'onda di frequenza che copre un ampio spettro. La decomposizione del multifrequenzasegnali di ingresso e uscita nei loro componenti utilizzando la trasformata di Fourier permette il calcolo della impedenza di ingresso del sistema respiratorio (ZRS), cioè la funzione di trasferimento tra l'ingresso e di uscita, ad ogni frequenza compresa nel perturbazione ^2. Pertanto, UFT consente la valutazione simultanea meccanica respiratoria su una gamma di frequenze in una sola manovra ^2. Montaggio modelli matematici avanzati (ad esempio il modello di fase costante ³⁾ ai dati di impedenza quindi permettono una suddivisione della risposta nelle vie aeree (centrale e periferico) e parametri dipendenti del tessuto del parenchima polmonare ^{1, 3.} Poiché molti fattori che influenzano la risposta fisiologica (ad esempio frequenza respiratoria, volume corrente, volume polmonare, delle vie aeree superiori, gli sforzi respiratori spontanei, i tempi delle misurazioni) sono controllati e standardizzati dal sistema di misurazione e procedure sperimentali, ¹ la tecnica è tappoin grado di generare misurazioni precise e riproducibili a condizione che sia eseguita correttamente. L'obiettivo di questo articolo è di fornire una dettagliata descrizione cronologica della procedura necessario per eseguire tali misurazioni nei topi. Il protocollo si compone di quattro parti: fasi preparatorie (reagenti, attrezzature e soggetti), la ventilazione meccanica, misure di funzione polmonare e l'analisi dei dati. Esempi di risultati rappresentativi della meccanica del sistema respiratorio generati utilizzando un ventilatore a pistone controllato dal computer (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, QC, Canada) sono forniti. Questi sono stati ottenuti da topi naive nonché da un modello guidato stress ossidativo di danno delle vie aeree caratterizzata da infiammazione delle vie aeree, i danni delle cellule epiteliali e una maggiore reattività delle vie aeree alla metacolina inalata per aerosol ^4. Anche se questo protocollo è spesso usato per valutare la reattività delle vie aeree alla metacolina inalata, si estende ad altri esiti e various patologie comprese asma, malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD), enfisema, fibrosi polmonare, danno polmonare nonché di modelli di topi transgenici di patologie simili alla malattia umana. I risultati della ricerca che utilizzano questo strumento può contribuire ad una migliore caratterizzazione e la comprensione dei cambiamenti fisiologici o modelli di malattia e per l'espansione in nuove aree di ricerca.

Protocollo

Le procedure descritte qui di seguito sono stati approvati dal Comitato Università Animal Care McGill in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care (CCAC).

1. Operazioni preliminari

1. Soluzioni:
   1. Metacolina: Preparare una soluzione madre a 50 mg / ml e fare diluizioni seriali (1:1) in base alle concentrazioni da testare ^5. Lasciare le soluzioni a temperatura ambiente prima di nebulizzazione ^5.
   2. Anestetici: diversi regimi sono stati riportati in letteratura in vari ceppi di topi (Tabella 1). Nota: Regimen 1 è stato utilizzato ai sensi del presente protocollo.
2. Equipaggiamento: Il presente protocollo si applica a uno dei due generazioni flexiVent supportati dal software flexiWare 7. Le funzioni del software sono raggruppati in tre moduli: Definizione e Pianificazione Studio, sperimentazione Session e Review e Reporting.
   1. Accendere il sistema (solo flexiVent FX) e / o avviare il software.
   2. Alla prima sessione di sperimentazione o in qualsiasi momento prima di esso, aprire la definizione Study & modulo Pianificazione di predefinire la struttura studio.
   3. Fare clic sul pulsante Crea un nuovo studio e seguire la procedura guidata per creare uno studio, delineare il protocollo e definire i gruppi sperimentali e soggetti da studiare.
   4. Avviare una sessione di sperimentazione aprendo il modulo di sessione Sperimentazione e seguendo la sequenza di avvio per lo studio e la selezione del modello.
   5. Assegnare un soggetto al sito di misura e confermare il suo peso.
   6. Procedere con la calibrazione del sistema seguendo la procedura descritta nel software operativo. Verrà chiesto a un certo punto per fissare la cannula da utilizzare (passo 1.3.3) per la Y-tubo per la calibrazione.
   7. Passaggio fondamentale. Ripetert passo 1.2.6 se i valori di taratura ottenuti sono al di fuori del range accettabile. (Fare riferimento alla flexiVent FX o flexiWare 7 Manuale utente per il modulo di specifici intervalli accettabili di valori di calibrazione).
   8. Annullare la richiesta per avviare la ventilazione e la registrazione dei dati a meno pronto per iniziare l'esperimento. Questi possono essere avviate in un momento successivo.
3. Soggetti:
   1. Anestetizzare il soggetto usando dosi appropriate di agenti anestetici (Tabella 1).
   2. Verificare che il soggetto ha raggiunto un livello chirurgico di anestesia. Il soggetto dovrebbe mostrare alcuna reazione a un pizzico punta e la sua respirazione deve essere regolare e non affannoso.
   3. Eseguire una tracheotomia e incannulare la trachea.
      1. Mettere l'animale sulla sua schiena e di fornire una fonte di calore (ad esempio una coperta di riscaldamento a temperatura controllata o di una lampada con una lampadina da 60 watt situata a circa 45 cm dal mouse per evitare l'eccessivo riscaldamento).
      2. Clean Thzona della gola e con alcool ed esporre la trachea con una incisione cutanea e separare delicatamente la ghiandola sottomandibolare e lo strato muscolare che lo ricopre.
      3. Sollevare delicatamente la trachea usando un paio di micro-pinza e passare sutura sotto di esso.
      4. Tagliare tra due anelli di cartilagine più vicina la laringe per fare una piccola incisione nella trachea senza sezionamento essa.
      5. Inserire la cannula precedentemente tarato in incisione e avanzare delicatamente all'interno della trachea della lunghezza di circa 5 anelli. Nota: Gli attuali esperimenti sono stati condotti utilizzando un 1,2 cm di lunghezza in metallo 18 cannula calibro.
      6. Passaggio fondamentale. Fissare la cannula in posizione con la sutura. L'allegato deve formare una tenuta ermetica attorno alla cannula.

2. Ventilazione Meccanica

1. Portare l'animale vicino al ventilatore.
2. Avviare la ventilazione meccanica, selezionando un predefinitoo un profilo personalizzato di ventilazione nella finestra mobile di ventilazione.
3. Collegare l'animale al ventilatore tramite il Y-tubo.
4. Passo critico. Allineare l'animale al ventilatore e assicurarsi che la cannula tracheale è allo stesso livello del ventilatore per evitare una possibile occlusione cannula tracheale o torsione.
5. Passaggio fondamentale. Esegui una inflazione perturbazione profonda facendo doppio clic sul nome della perturbazione di verificare l'inserimento cannula e l'attaccamento. In assenza di una perdita, il sistema deve essere in grado di tenere una pressione di 30 cmH ₂ O per un periodo di 3 secondi senza eccessivo spostamento di volume (Figura 1). Il volume registrato e tracce di pressione dovrebbero essere liscia, senza segni di offset o deformazione in quanto potrebbero indicare una ostruzione cannula o smarrimento.
6. Se necessario, collegare segno vitale trasduttori per la frequenza cardiaca e controllo della temperatura corporea. La registrazione dei dati può essere avviata either manualmente o automaticamente tramite uno script.

3. Funzione polmonare Misure

Misurazioni o comandi (ad esempio attivazione nebulizzatore, marker di eventi) possono essere automatizzate utilizzando script predefiniti o personalizzati per un processo sperimentale altamente controllato e ripetibile (Figura 2). Sei famiglie di perturbazioni che danno luogo ad una serie di parametri possono essere usati per la descrizione dell'oggetto meccanica del sistema respiratorio al basale e successivo a un determinato sfida (Tabella 2).

1. Passaggio fondamentale. Quando si è pronti per iniziare a prendere le misure, eseguire una inflazione profonda per reclutare le aree polmonari chiuse e standardizzare la storia del volume polmonare.
2. Passaggio fondamentale. Verificare l'assenza di sforzi inspiratori spontanei eseguendo una misura sperimentale (ad esempio PVS-P o PV-V). Osservare le tracce dei segnali di pressione nella vista set di dati selezionato. Con graduali curve fotovoltaici,altipiani pressione deve essere ben definito, senza deviazioni verso il basso. Una oscillazione verso il basso in pressione indicherebbe uno sforzo inspiratorio dall'animale (Figura 3).
3. Avviare lo script selezionato facendo doppio clic sul suo titolo. Script utilizzati nel presente studio generalmente inclusi per le misure:
   • Una sequenza di misurazioni di base in triplicato.
   • Attivazione del nebulizzatore per la valutazione della reattività delle vie aeree alla metacolina inalata. Nota: Quando viene richiesto dal sistema, caricare circa 100 ml di soluzione fisiologica o di una soluzione di metacolina nel nebulizzatore. Nebulizzazione si avvia e arresta automaticamente.
   • Una sequenza di misure ravvicinati (ogni 10-15 secondi) per un periodo di circa 3 minuti dopo l'attivazione del nebulizzatore.
   • Un prompt per eseguire un'altra sfida e ripetere una sequenza di misure Nota:. Asciugatura l'interno del monte nebulizzatore con un tampone in bsfide ra possono aiutare a prevenire o goccioline di condensa edificio-up in linea inspiratoria.
4. Alla fine dell'esperimento, arrestare la ventilazione e staccare il soggetto.
5. Passare alla seguente argomento nel software operativo e confermare il suo peso.
6. Passaggio critico. Sciacquare e asciugare nebulizzatore, adattatore, Y-tubing, e cannula tra i soggetti.
7. Ripetere i passaggi da 1.2.6 a 3.6.
8. Alla fine della giornata, chiudere la sessione sperimentale. Ricordarsi di risciacquare e asciugare nebulizzatore, adattatore, Y-tubing, e cannula e per pulire la valvola di espirazione del sistema prima di lasciare il laboratorio, seguendo le istruzioni del produttore.

4. Analisi dei dati

Il software calcola e visualizza automaticamente i parametri associati a una perturbazione. Esso fornisce anche un coefficiente di determinazione (COD) che riflette l'adattamento del modello matematico per i dati. Ogni set di dati con un isolamentofficiente COD è etichettato come esclusi dal software. Rassegna di sessioni sperimentali, i dati ri-analisi e la creazione di scenari di esportazione sono fatto nel modulo Review & segnalazione del software.

1. Aprire il modulo Review & reporting e creare uno scenario di esportazione, avendo cura di includere solo set di dati che hanno una sufficiente COD.
2. Esporta come parametri necessari, curva di pressione o di flusso-volume, segnali di set di dati grezzi o le informazioni oggetto di un foglio di calcolo (cfr. tabella 3).
3. Misurazioni della durata media della linea di base per ciascun parametro e trama tutte le misure in funzione del tempo (vedi figura 4). Si può quindi scegliere di calcolare l'area sotto la curva, analizzare il profilo generale delle curve o eseguire una analisi statistica.
4. Per esprimere respiratorie risultati di risposta in funzione della concentrazione di metacolina, determinare per ogni soggetto, parametri e condizioni sperimentali sia una specificapunto (ad es picco) o un tempo specifico dopo ogni metacolina. Calcolare le medie di gruppo e la relazione o risultati trama per ogni condizione sperimentale (Tabella 4, Figura 5).
5. Si può anche prendere in considerazione il calcolo della concentrazione di produzione di un raddoppio di un dato valore di base del parametro (PC _200; Figura 5C), l'applicazione di una normalizzazione (ad esempio% al basale) o l'esecuzione di un'analisi statistica.

Risultati

Meccanica Respiratoria misure di sistema. Tabella 4 mostra i risultati tipici della naïve A / J topi ottenute al basale e seguenti broncocostrizione indotta da metacolina (12,5 mg / ml) utilizzando uno dei due generazioni flexiVent supportati dal software flexiWare 7. Tecnica del sistema respiratorio, cioè in condizioni di petto chiuse, sono state valutate da alternando perturbazioni della frequenza di oscillazione forzata singole famiglie e la banda larga in modo ravvicinati (SnapShot-150, Quick Prime-3, rispettivamente). Dal momento che la ventilazione è in pausa durante le misurazioni, la rapida Prime-3, che copre una gamma di frequenza simile a quella del Primo-8, ma ha una durata più breve (3 vs 8 sec), è stato selezionato al fine di ridurre il periodo di apnea, ridurre al minimo l'effetto di la perturbazione sui gas ematici e fornire una migliore risoluzione della risposta. Parametri associati a ogni perturbazione stati calcolati automatically dal software operativo. I risultati mostrano che le due generazioni del sistema flexiVent prodotte misure equivalenti di meccanica respiratoria.

Sito di risposta ai polmoni. Distinguere il sito della risposta polmonare permette al ricercatore di individuare ulteriori regioni colpite, nonché per identificare i potenziali punti di intervento farmacologico ^6. Ad esempio, naïve A / J topi mostrano un incremento di resistenza al basale, quando la pressione di fine espirazione contro cui sono fatte le misurazioni è aumentata 3-9 _cmH2O (Figura 6A, SnapShot-150). Nel presente esempio, l'utilizzo di misurazioni UFT banda larga (Quick Prime-3) fornito dettagli chiarire la base per il cambiamento di resistenza: La variazione di pressione espiratoria finale determinato una diminuzione della resistenza delle vie aeree (R _N) coerente con la effetti broncodilatatori di un volume polmonare più alto e il più grande stampa inflazioneure (Figura 6D) e un aumento smorzamento tessuto (G; Figura 6E), un parametro strettamente legato alla resistenza del tessuto che riflette viscoelasticità tessuto ed eventualmente la resistenza delle piccole vie aeree ^7. Quest'ultimo è noto per aumentare con l'aumento del volume polmonare.

Iperreattività delle vie aeree. Seguito a esposizione cloro gassoso, reattività delle vie aeree alla metacolina inalata aumenta rispetto all'esposizione aria in topi Balb / c come conseguenza di danno delle vie aeree ⁴ (figura 2). Cloro è noto per indurre stress ossidativo, che porta alla distruzione delle cellule strutturali delle vie aeree, in particolare le cellule epiteliali, e inducendo il reclutamento di cellule infiammatorie. Come rappresentato in figura 5, cambiamenti in tutti parametri che descrivono la meccanica del sistema respiratorio può essere visto in risposta alle crescenti sfide metacolina. Rispetto ai topi esposti aria, topi esposti a chlorine gas visualizzata maggiori risposte massime a tutti i parametri UFT (Figura 5A, 5B, 5D-5F) nonché un aumento statisticamente significativo spostamento verso sinistra della curva concentrazione-risposta esemplificato da una riduzione della concentrazione di metacolina necessaria per causare un raddoppio della resistenza e elastanza (PC _200; Figura 5C). Questi risultati illustrano, rispettivamente, iperreattività delle vie aeree e di ipersensibilità al via inalatoria metacolina seguito all'esposizione al gas di cloro.

Altre misure. Oltre alla UFT, il sistema flexiVent può essere utilizzato anche per raccogliere altri tipi di ^8-10 funzionalità polmonare o cardiovascolari ¹¹ misurazioni. Figura 7 mostra una graduale, dovuti a pressione curva pressione-volume rappresentativo in naive A / J topi in condizioni basali . La porzione superiore del lembo sgonfiamento della curva viene adattata alla Salazar-Knowles equazione ¹² sup> e parametri sono calcolati automaticamente dal software.

Tabella 1. Esempi di regimi anestetici usati in mouse. Clicca qui per visualizzare tavolo più grande .

Tabella 2. Perturbazioni utilizzati per misure di funzione polmonare nei topi. * Proroga necessaria per il sistema. Il soggetto ha anche bisogno di essere in una camera di pletismografo chiusa durante le misurazioni.lank "> Clicca qui per vedere tabella più grande.

Tabella 3. Esempio di parametri esportati dalla frequenza forzati famiglie singole e banda larga perturbazione oscillazione. Clicca qui per vedere tabella più grande .

Tabella 4. Sistema di comparazione. Confronto dei parametri meccanica polmonare raccolti con le due generazioni del sistema flexiVent gestite da software flexiWare 7. Risultati sono stati generati in naive A / J topi (n = 5 / gruppo) al basale e seguenti broncocostrizione indotta da metacolina (MCH 12,5 mg / ml). * I gruppi sono stati confrontati con una ANOVA a due vie per misure ripetute e il log ₁₀ di risposte individuali per l'omogeneità delle varianze (GraphPad Prism, versione 5.03; GraphPad Software, San Diego, Stati Uniti d'America).

Figura 1. Schermate di una inflazione polmone profondo. Il pannello superiore mostra il volume spostato dal pistone del ventilatore (traccia rossa) e il volume consegnato al soggetto (traccia grigio). Il pannello inferiore mostra la pressione del cilindro aumentando ad una pressione impostata di 30 cmH ₂ O su un periodo di 3 secondi e mantenuta costante per lo stesso periodo di tempo.

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Figura 2. Esempio di uno script tipico utilizzato per valutare la meccanica del sistema respiratorio al basale.

Figura 3. Sforzi inspiratori spontanei durante l'esecuzione di una curva pressione-volume stepwise.

Figura 4. Ora portate seguente risposta crescente sfide metacolina per via inalatoria. Risultati sono espressi come media (± deviazione standard) di un gruppo di 5 naïve spontaneamente hyperresponsive A / J topi. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5. Cambiamenti nella meccanica del sistema respiratorio a seguito crescenti sfide metacolina in cloro-e aria esposti topi BALB / c. Valore di picco è stato identificato per ogni parametro in ogni oggetto e condizione sperimentale. Medie di gruppo sono stati poi calcolati (media ± deviazione standard, n = 4-6). Le differenze tra i gruppi sono stati valutati mediante analisi della varianza utilizzando il registro di ₁₀ risposte individuali per l'omogeneità delle varianze. La concentrazione di metacolina produrre un raddoppio della linea di base (PC ₂₀₀₎ è stato ottenuto inserendo un secondo polinomio per singole curve dose-risposta e interpolazione della curva montato. I punti dati sono mancanti in D, E e F nei topi cloro-espostile due più alte concentrazioni metacolina causa sufficientemente elevati coefficienti di determinazione che riflette una scarsa vestibilità del modello matematico ai dati. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 6. Partizionamento della risposta respiratoria nelle vie aeree e la meccanica del tessuto polmonare. Traccia sperimentale da un ingenuo A / J topi illustrano singola frequenza (2,5 Hz) e la banda larga (1-20.5Hz) costretti misure di oscillazione di meccanica respiratoria, in triplice copia a due diverse pressioni di fine espirazione (3 e 9 cm H ₂ O). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 7. Curva pressione-volume in naïve A / J topi in condizioni basali. Curve pressione-volume sono stati generati utilizzando una perturbazione di pressione-driven graduale (PV-P) per assicurare che ogni polmoni del mouse sono stati gonfiati alla stessa pressione, indipendentemente dalla loro condizione. Salazar-Knowles parametri dell'equazione estratti dalle singole curve pressione-volume sono stati mediati e riportati in formato tabella. Risultati sono espressi come media ± deviazione standard (n = 6).

Discussione

Il continuo studio di disfunzione delle vie respiratorie come si riferisce ad asma e altri disturbi polmonari rimane fondamentale per la comprensione dei meccanismi alla base della malattia e lo sviluppo di opzioni di trattamento. L'uso del mouse per malattia delle vie aeree modello è stato essenziale nel guadagnare la comprensione in questi meccanismi di malattia. Quando si considera la valutazione disfunzione delle vie aeree in un oggetto piccolo come un topo, avere strumenti affidabili e precisi con cui misurare la funzione polmonare è un fattore critico. Inoltre, avere strumenti in grado di fornire approfondimenti sulla posizione di rotta erettile o l'effetto terapeutico è inestimabile. La tecnica UFT combina tutti questi attributi e fornisce un approccio potente, integrativo e traslazionale per valutare le variazioni fisiologiche.

Per avere successo con questo tipo di misura nei topi, particolare attenzione deve essere data a pochi passi, e cioè la calibrazione del sistema, la resistenza del endotracheale cannula, il tipo di nebulizzatore (così come le impostazioni di funzionamento) il posizionamento dell'animale e la standardizzazione della storia volume polmonare. Inoltre, è indispensabile per ottenere insiemi di dati validi che il sistema respiratorio del soggetto rimane passivo durante le misurazioni. Ciò può essere ottenuto mediante la somministrazione di un agente paralizzante muscolare, lavorando ad un piano profondo di anestesia o iperventilazione soggetto per indurre apnea (vedi Tabella 1). Gli investigatori possono iniziare padroneggiare il sistema e il suo software operativo, se lo si desidera, con carichi di prova, durante l'acquisizione delle competenze necessarie per le misure nei topi. Sarebbe quindi logico per generare risultati riproducibili in animali naïve prima di muoversi verso modelli di malattia o topi trattati. Dal momento che una percentuale importante di modelli di malattia nella ricerca delle vie respiratorie comporta esponendo gli animali ad agenti quali allergeni, tossine, sostanze inquinanti, fumo di sigaretta o gas, la variabilità nei risultati ottenuti con i measurement tecnica descritta in questo articolo potrebbe quindi essere influenzato dalla procedura esposizione utilizzato. Standardizzazione dei processi sperimentali chiave (ad esempio utilizzando l'esposizione controllato da computer e sistemi di misura ^{6, 13, 14)} potrebbe potenzialmente avere un impatto significativo nel ridurre la variabilità.

Gli esempi presentati in questo articolo rappresentano una selezione dei risultati tipici della naïve e cloro-topi esposti esperimenti, evidenziando i punti di forza e le limitazioni della tecnica. Come visibile ad esempio in figura 6, la tecnica è in grado di generare le misure di funzione polmonare riproducibili. Mentre sono stati segnalati analoghi valori di resistenza al basale tra i ceppi di topi, le differenze di elastanza sono stati tuttavia osservati ^15. Modifiche sostanziali sono inoltre da attendersi tra neonato e topi adulti ^16. Come per gli altri nella valutazione fisiologica vivo, risultati di alta precisione, come esimoose generato dal UFT, sono dotati di una concessione per lo stato naturale dei soggetti. Questo principio, che viene indicato come il principio di indeterminazione fenotipizzazione ^1, si applica al presente protocollo, nel senso che le misure devono essere fatte in anestetizzato, tracheotomizzato (o per via orale intubato) e ventilato meccanicamente soggetti. Un'altra limitazione della tecnica è osservabile in Figura 5D-5F in cui i dati non sono disponibili le concentrazioni più elevate per il gruppo cloro esposta perché l'adattamento del modello di fase costante ai dati è povera di sopra dei livelli moderati di broncocostrizione. Tuttavia, gli animali gravemente bronchoconstricted potrebbero essere valutati analizzando ZRS direttamente ^15, oppure utilizzando software di terze parti post analisi per adattarsi modelli matematici più complessi, per esempio tenendo conto della eterogeneità di funzione meccanica ^17. Dataset esclusi possono osservare anche se le vie aeree dell'animale non sono sufficientemente passive o se la resistenza della cannula è troppo alta. Come regola generale, la resistenza della cannula non deve superare la resistenza dell'animale al basale. Lavorare con una cannula di più grande diametro interno e / o più breve lunghezza contribuirà a ridurre la resistenza cannula. Infine, l'attuale dimostrazione di misurazioni UFT in mouse può essere percepita come una metodologia di tempo e quindi meno efficienti o meno applicabili a studi longitudinali rispetto alle tecniche meno invasive. Tuttavia questi ultimi sono associati a una grande incertezza sulla base dei loro risultati e sono visti da molti come imperfetto ^1. Misurazioni invasive ripetute sono possibili negli animali per via orale intubati, anche se tecnicamente più impegnativo ^17.

Dagli esempi forniti, i risultati hanno dimostrato l'equivalenza delle due generazioni del sistema flexiVent a produrre misurazioni della meccanica respiratoria, nonché vie respiratorie hyperreactività e ipersensibilità alla metacolina inalata dopo cloro-esposizione nei topi. Quando usato per caratterizzare o capire cambiamenti fisiologici o modelli di malattia, l'aspetto misura dettagliata collegati con la tecnica può contribuire ad estendere lo stato attuale delle conoscenze.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Acetyl-β-methylcholine chloride	Sigma-Aldrich	A-2251	Methacholine
Micro-Adson forceps, serrated 12 cm	Fine Science Tools	11018-12
Moria MC31 forceps, serrated-curved	Fine Science Tools	11370-31
Iris scissors-tough cut, straight 11.5 cm	Fine Science Tools	14058-11
Spring scissors-2.5 mm blades, straight	Fine Science Tools	15000-08
Non-sterile blunt needle (18g x ½")	Brico Medical Supplies Inc.	BN1805	Endotracheal cannula
Non-sterile 5-0 silk suture	Seraflex	IDI58000
Phosphate buffered solution	Gibco	14190-144
15 ml conical tubes	Starstedt	SS-4001
1 ml TB syringes	Becton Dickinson	309626
200 μl filter tips	Biosphere	70.760.211
EQUIPMENT
flexiVent FX	SCIREQ Inc.	sales@scireq.com	www.scireq.com
Aerogen Aeroneb nebulizer	SCIREQ Inc.	sales@scireq.com	www.scireq.com