Test di suscettibilità agli antibiotici indotti dallo stress su un chip

Riepilogo

Abbiamo sviluppato una piattaforma microfluidica per test di suscettibilità agli antibiotici rapidi. Il fluido viene passato ad alta velocità sui batteri immobilizzati sul fondo di un canale microfluidico. In presenza di stress e antibiotici, i ceppi sensibili di batteri muoiono rapidamente. Tuttavia, i batteri resistenti possono sopravvivere a queste condizioni stressanti.

Abstract

Abbiamo sviluppato un metodo microfluidico rapido per i test di suscettibilità agli antibiotici in un ambiente basato sullo stress. Il fluido viene passato ad alta velocità sui batteri immobilizzati sul fondo di un canale microfluidico. In presenza di stress e antibiotici, i ceppi sensibili di batteri muoiono rapidamente. Tuttavia, i batteri resistenti sopravvivono a queste condizioni stressanti. L'ipotesi alla base di questo metodo è nuova: l'attivazione dello stress delle vie biochimiche, che sono obiettivi di antibiotici, può accelerare i test di suscettibilità agli antibiotici. Rispetto ai metodi standard di test di suscettibilità agli antibiotici, il passaggio di limitazione del tasso - crescita batterica - viene omesso durante l'applicazione di antibiotici. L'implementazione tecnica del metodo è in una combinazione di tecniche standard e approcci innovativi. Le parti standard del metodo includono protocolli di coltura batterica, definendo canali microfluidici in polidimetilsassano (PDMS), monitoraggio della vitalità cellulare con fluorescenza e elaborazione delle immagini batch per il conteggio dei batteri. Parti innovative del metodo sono nell'uso del flusso dei mezzi di coltura per l'applicazione di sollecitazioni meccaniche, nell'uso di enzimi per danneggiare ma non uccidere i batteri e nell'uso di substrati microarray per l'attacco batterico. La piattaforma sviluppata può essere utilizzata nello sviluppo e nei test di farmaci correlati agli antibiotici e non antibiotici. Rispetto agli esperimenti standard di sospensione batterica, l'effetto del farmaco può essere acceso e disattivato ripetutamente durante i periodi di tempo controllati. L'osservazione ripetitiva della stessa popolazione batterica è possibile nel corso dello stesso esperimento.

Introduzione

L'aumento della resistenza batterica intensifica la necessità di test di suscettibilità agli antibiotici a base di fenotipo veloce al fine di salvaguardare i nostri farmaci di ultima istanza. I test di suscettibilità standard si basano sull'inibizione della crescita batterica in presenza di antibiotici che prendono più (8-24) ore per essere completati. Abbiamo sviluppato un nuovo test di suscettibilità agli antibiotici su una piattaforma microfluidica che si basa sull'attivazione dello stress delle vie biosintetiche per accelerare l'azione degli antibiotici.

I test di suscettibilità agli antibiotici su scala microfluidico comportano il vant....

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Protocollo

1. Creare il livello PDMS (Figura 1)

1. Mescolare vigorosamente PDMS e agente polimerizzante in un rapporto 10:1. Per rimuovere le bolle, degasare la miscela viscosa in una camera a vuoto per 1 ora a temperatura ambiente.
2. Su una scala, versare lentamente il PDMS sullo stampo in alluminio. Versare dal centro e mantenere livellato lo stampo. Assicurati di lasciare i perni scoperti. Smettere di versare una volta raggiunto il peso target.
   Il nostro stampo richiede 4 g di PDMS e 0,4 g di reagente di polimerizzazione.
3. Livellare lo stampo all'interno di un forno e polimerigliare a 37 °C durante la notte.
   I tempi di polimerizzazi....

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Risultati

I dati presentati nella figura 4 mostrano la risposta di un ceppo di Staphylococcus aureus sensibile nel tempo in un canale microfluidico contenente antibiotici. Le immagini di contrasto di fase acquisite a 1 minuto e alla fine dell'esperimento di 1 ora sono mostrate nelle figure 4A e B. I dati analizzati di 1 ora sono mostrati nella figura 4C con i batteri evidenziati in rosso (5.828 totali). Le corrispondenti immagini a fluorescenza .......

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Discussione

Il protocollo presentato è stato convalidato e ottimizzato in una serie di esperimenti con ceppi stafilococco aureo sensibili alla meticillina e resistenti alla meticillina¹⁰. Pertanto, questo protocollo senza modifiche dovrebbe essere direttamente applicabile ad altri ceppi di S. aureus e altri antibiotici con meccanismi d'azione che influenzano la biosintesi della parete cellulare batterica. Tipi di batteri diversi da S. aureus possono richiedere variazioni nei parametri di sollec.......

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYTOX Green	Invitrogen Corporation	S7020	Dead cell fluorescence stain
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, Inc	A9418-5G	Used for lysostaphin storage
Sodium Acetate	Sigma Aldrich, Inc	S8750-500G	Used for lysostaphin storage
Lysostaphin	Cell Sciences	CRL309A	Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml  lysostaphin for storage
Oxacillin salt	Sigma Aldrich, Inc	28221-1G	Antibiotic
Mueller Hinton Broth	Fisher Scientific	DF0757-17-6
Sodium chloride	Sigma Aldrixh	S3014-500G	2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving
1 ml, Luer-lock syringe	BD (Beckton, Dickinson and Comp.)	14-823-2F
2 oz, Luer-lock syringe	BD (Beckton, Dickinson and Comp.)	309653 - 60 mL	Overfill to ~65 ml
Microscope
Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70	Cambridge Scientific	9349
60X, Fluorescence/Phase contrast objective	Olympus Corp.	LCPlan F1 60x/0.70 Ph2
Retiga 12-bit monochrome CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12-C
Microscope automation
Shutters phase contrast/fluorescence	PRIOR Scientific	H204/H202
X/Y Stage	PRIOR Scientific	H107AENN
Focus motor	PRIOR Scientific	H122
Joystick for XYZ control	PRIOR Scientific	CS152EF
Proscan Controller	PRIOR Scientific	H3-XY2
Image Acquisition Software	Fraunhofer CMI
Flow Cell Assembly and PDMS
Flow Cell	BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI	3333-1044	Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI
Glass window	Fraunhofer CMI	3333-1054	Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI
BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm	Edmund Optics Inc.	NT48-543
Sealing plate	BU Scientific Instruments Facility	3333-1045
Epoxide glass slide	Arrayit Corporation	SuperEpoxy 2
PDMS master	Fraunhofer CMI	3333-1053	Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)
PDMS slide design	Fraunhofer CMI	3333-1053
Tubing
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green	IDEX Health Science	M-644-03	Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule
Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black	IDEX Health Science	M-657
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural	IDEX Health Science	P-255
Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow	IDEX Health Science	P-259	Fits Luer-lock adapter
Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green	IDEX Health Science	1520G
Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red	IDEX Health Science	P-658