Imaging funzionale di Auditory Cortex in gatti adulti utilizzando ad alto campo fMRI

Riepilogo

Sono stati tradizionalmente condotti studi funzionali del sistema uditivo dei mammiferi utilizzando tecniche spazialmente concentrati come registrazioni elettrofisiologiche. Il seguente protocollo descrive un metodo di visualizzare modelli su larga scala di attività emodinamica evocata nel gatto corteccia uditiva utilizzando la risonanza magnetica funzionale.

Abstract

Le attuali conoscenze di elaborazione sensoriale nel sistema uditivo dei mammiferi è derivato principalmente da studi elettrofisiologici in una varietà di modelli animali, tra cui scimmie, furetti, pipistrelli, roditori e gatti. Al fine di elaborare adeguate paralleli tra modelli umani e animali della funzione uditiva, è importante stabilire un ponte tra gli studi di imaging funzionale umani e studi elettrofisiologici animali. Risonanza magnetica funzionale (fMRI) è un consolidato metodo minimamente invasivo per misurare vasti reticoli di attività emodinamica nelle diverse regioni della corteccia cerebrale. Questa tecnica è ampiamente utilizzata per sondare la funzione sensoriale nel cervello umano, è uno strumento utile nel collegamento studi di elaborazione uditiva in entrambi gli esseri umani e gli animali ed è stato utilizzato con successo per studiare la funzione uditiva nelle scimmie e roditori. Il protocollo che segue descrive una procedura sperimentale per studiare la funzione uditiva in anestetizzati adultigatti dalla misura di stimolo evocato cambiamenti emodinamici nella corteccia uditiva utilizzando fMRI. Questo metodo agevola il confronto tra le risposte emodinamiche attraverso diversi modelli di funzione uditiva dando luogo ad una migliore comprensione delle caratteristiche specie-indipendente della corteccia uditiva dei mammiferi.

Introduzione

Comprensione attuale di elaborazione uditiva nei mammiferi è derivato principalmente da studi elettrofisiologici invasivi nelle scimmie ^1-5, furetti ^{6-10, 11-14} pipistrelli, roditori ^{15-19, 20-24} e gatti. Tecniche elettrofisiologiche comunemente utilizzano microelettrodi extracellulari per registrare l'attività dei neuroni singoli e multipli all'interno di una piccola area di tessuto neurale che circonda la punta dell'elettrodo. Fondata metodi di imaging funzionale, come l'imaging ottico e la risonanza magnetica funzionale (fMRI), complementi servire come utili a registrazioni extracellulari, fornendo un punto di vista macroscopico di attività ad azionamento simultaneo su più regioni spazialmente distinte del cervello. Segnale intrinseco imaging ottico facilita la visualizzazione di attività evocata nel cervello misurando i cambiamenti di attività connesse nelle proprietà di riflettanza del tessuto superficie, mentre fMRI utilizza il sangue di ossigeno livello-dipendente (BOLD)contrasto per misurare stimolo evocato alterazioni emodinamiche nelle regioni del cervello che sono attive durante una determinata attività. Imaging ottico richiede l'esposizione diretta della superficie corticale di misura le variazioni di superficie riflettanza tessuto che sono legati all'attività di stimolo evocato ^25. In confronto, fMRI è invasiva e sfrutta le proprietà paramagnetiche di sangue deoxygenated di misurare sia la superficie corticale ^26-28 e basati ^solco-27,29 attività evocata all'interno di un cranio intatto. Forti correlazioni tra il segnale BOLD e l'attività neuronale in primati non umani corteccia visiva ³⁰ e nella corteccia uditiva umana ³¹ convalidano fMRI come uno strumento utile per studiare la funzione sensoriale. Dal fMRI è stato ampiamente utilizzato per studiare le caratteristiche del percorso uditivo quali l'organizzazione tonotopic ^32-36, lateralizzazione della funzione uditiva ^37, pattern di attivazione corticale, l'identificazione di regioni corticali ^38, effetti del suonointensità sulle proprietà di risposta uditive ^39,40, e le caratteristiche della risposta BOLD andamento temporale ^29,41 in umano, scimmia, e modelli di ratto, lo sviluppo di un protocollo adatto imaging funzionale per studiare la funzione uditiva nel gatto fornirebbe un utile complemento letteratura imaging funzionale. Mentre fMRI è stato utilizzato anche per esplorare i vari aspetti funzionali della corteccia visiva nel gatto anestetizzato ^26-28,42, pochi studi hanno utilizzato questa tecnica per esaminare l'elaborazione sensoriale gatto corteccia uditiva. Lo scopo del presente protocollo è di stabilire un metodo efficace di utilizzare fMRI quantificare funzione nella corteccia uditiva del gatto anestetizzato. Le procedure sperimentali descritte in questo manoscritto sono stati utilizzati con successo per descrivere le caratteristiche del corso BOLD tempo di risposta nel gatto adulto corteccia uditiva ^43.

Protocollo

La seguente procedura può essere applicata a qualsiasi esperimento di imaging in cui vengono utilizzati i gatti anestetizzati. Passi che sono specificamente necessari per gli esperimenti uditivi (passaggi 1,1-1,7, 2.8, 4.1) possono essere modificati per accogliere altri protocolli stimolo sensoriale.

Tutte le procedure sperimentali hanno ricevuto l'approvazione dalla uso di animali sottocommissione del Consiglio dell'Università su Animal Care presso la University of Western Ontario e seguite le linee guida indicate dal Consiglio canadese Animal Care (CCAC) ^44. L'esperimento descritto richiede circa 150 minuti dalla preparazione degli animali al recupero. La durata dell'esperimento è illustrato in Figura 1.

1. Stimolo Preparazione del materiale

La Figura 2 mostra i componenti elettronici ed i collegamenti corrispondenti necessari per generare uno stimolo uditivo nello scanner MRI. I requisiti sono come follows: un computer, una scheda audio esterna, un amplificatore di potenza stereo e un sistema di auricolari compatibile con fMRI.

1. Collegare il computer che verrà utilizzato per presentare lo stimolo uditivo alla scheda audio esterna tramite il cavo (USB) Universal Serial Bus.
2. Collegare i cavi di collegamento delle porte di uscita della scheda audio esterna alle porte di ingresso dell'amplificatore di potenza stereo.
3. Collegare i cavi di collegamento delle porte di uscita dell'amplificatore di potenza stereo alle porte di ingresso del box del trasformatore del sistema di auricolari compatibile con fMRI.
4. Collegare le cuffie binaurali per le porte di uscita del box del trasformatore.
5. Utilizzare cavi schermati coassiali con connessioni BNC per collegare il box trasformatore al pannello di penetrazione fuori dalla stanza dello scanner.
6. Collegare il gruppo cavo degli auricolari alle corrispondenti porte BNC sul pannello di penetrazione all'interno della stanza scanner.
7. Collegare le punte di schiuma auricolari per le cuffie quindi collegare gli auricolari to il gruppo del cavo. Eseguire un test di stimolo uditivo per confermare che il suono viene trasmesso dal computer agli auricolari. Scollegare le cuffie e inserire le punte di schiuma auricolari saldamente nelle orecchie del gatto durante la fase di preparazione degli animali (fase 2.7).

2. Preparazione degli animali

1. Per premedicate il gatto, somministrare una miscela sedativo di atropina solfato (0,02 mg / kg) e acepromazina (0,02 mg / kg) tramite una iniezione sottocutanea (SC).
2. Dopo 20 min, somministrare ketamina (4 mg / kg) e dexmedetomidina cloridrato (0,02-0,03 mg / kg) tramite un intramuscolare (IM) iniezione per indurre anestesia. La ketamina è solitamente combinato con un sedativo e miorilassante, in questo caso, cloridrato dexmedetomidina, per ridurre i tremori e rigidità muscolare comunemente osservati quando la ketamina viene usato da solo ^45. Questa combinazione anestetico provoca in genere circa 150 min di sedazione ed è spesso utilizzato nella pratica veterinaria per indurreanestesia nei piccoli animali.
3. Una volta che il gatto ha perso il suo riflesso di raddrizzamento, applicare pomata oftalmica per gli occhi per prevenire la secchezza durante la procedura. Inserire un catetere nella vena safena mediale per la consegna endovenosa di ketamina.
4. Test per il successo induzione dell'anestesia pizzicando un dito sulla zampa anteriore poi osservando se il gatto ritiri la sua zampa. Una volta che il riflesso pedale scompare, sopprimere il riflesso del vomito spruzzando lidocaina sulle pareti della faringe poi intubare il gatto con un tubo endotracheale 4,0-4,5.
5. Mantenere l'anestesia per tutta la sessione di imaging con una velocità di infusione costante di ketamina (0,6-0,75 mg / kg / ora) e isoflurano per via inalatoria (0,4-0,5%), consegnato in ossigeno al 100% 1-1,5 L / min. Unire 60 ml di soluzione fisiologica e 0,07 ml di ketamina in una siringa da 60 ml quindi posizionare la siringa nella pompa a siringa. Questa fase può essere eseguita prima premedicating il gatto.
6. Posizionare rilievi di riscaldamento di cera pieno di caldo sul pavimento della s compatibili con la risonanza magneticaled (figure 3a e 3c) poi strato isolante dell'involucro di bolla di plastica intorno alle pareti interne della slitta.
7. Mettere il gatto in una posizione sternale all'interno del pluriball isolanti in slitta compatibile con MRI (figura 3c).
8. Una volta che il gatto è posizionato, regolare la testina per accedere alle orecchie. Arrotolare le auricolari in schiuma nel diametro più piccolo possibile quindi inserire ogni punta orecchio in profondità nel canale uditivo. Una volta inserite, le punte di schiuma auricolari dovrebbero espandersi per riempire lo spazio all'interno del canale uditivo.
9. Regolare il gatto finché la testa sia posizionata correttamente all'interno della radiofrequenza (RF) bobina 3 canali (Figura 3b). Stabilizzare la testa con acustica memory foam smorzamento (Figura 3d). Posizionare schiuma attorno alle orecchie per fornire attenuazione supplementare del rumore scanner.
10. Avvolgete il gatto nella coperta di isolamento dell'involucro di bolla di plastica quindi fissare e trasportare la slitta al letto scanner.
11. Collegare le linee di infusione, tubi di mandata anestetici e apparecchiature di monitoraggio per il gatto. Collegare le cuffie con il cavo auricolare attaccato al pannello di penetrazione.
12. Avviare l'infusione ketamina alla portata di base di 0,6 mg / kg / hr quindi aumentare la portata come richiesto in base alla profondità dell'anestesia. Impostare la dose isoflurano iniziale al 0,5% per poi diminuire al 0,4% una volta che le scansioni anatomiche sono stati raccolti.
13. Monitorare e registrare la saturazione del gatto di ossigeno nel sangue, di fine espirazione livelli di CO _2, la frequenza cardiaca, la respirazione e la temperatura rettale (se possibile) in tutto l'esperimento utilizzando apparecchiature di monitoraggio compatibile con MRI posizionato ad una distanza appropriata dal foro scanner. Tabella 1 elenca i valori medi e gli intervalli delle misurazioni fisiologiche per la corretta esecuzione di questa procedura. Aumento costante della frequenza cardiaca e la respirazione sono di solito associati con il recupero imminente dall'anestesia.
14. Dopo le sessione è completata, rimuovere il gatto dalla slitta. Continuare a fornire il riscaldamento supplementare con cuscinetti termici e asciugamani finché l'animale riprenda pienamente. Una volta che i rendimenti gag reflex, rimuovere il tubo endotracheale. Monitorare il gatto fino a quando il riflesso di raddrizzamento viene ripristinato per poi tornare l'animale alla struttura. Valutare l'animale il giorno dopo la procedura per garantire l'assenza di effetti negativi della sperimentazione.

3. Brain Imaging

1. Raccogliere scansioni anatomiche del cervello del gatto in un orientamento fetta assiale. Utilizzare i seguenti parametri di imaging per il volume di riferimento anatomico: sequenza di imaging FLASH con TR = 750 msec, TE = 8 msec, matrice = 256 x 256, l'acquisizione dimensione voxel = 281 micron x 281 micron x 1,0 mm. La durata della scansione anatomica è di circa 6 min. Figura 4 (pannello di sinistra) fornisce una fetta immagine anatomica campione ottenuto utilizzando i parametri specificati.
2. Utilizzare i seguenti parametri di imaging per il funziovolumi nali: eco-planare acquisizione interleaved segmentata (EPI) con TR = 1.000 msec, TE = 15 msec, 3 segmenti / aereo, 21 x 1 millimetri fette; matrice = 96 x 96; campo di vista = 72 millimetri x 72 mm; acquisizione dimensione voxel = 0,75 millimetri x 0,75 mm x 1,0 mm. tempo di acquisizione = 3 sec / volume figura 4 (pannello di destra) fornisce una fetta di immagine funzionale campione ottenuto utilizzando i parametri specificati.

4. Stimolo Presentazione

1. Presentare una banda larga rumore stimolo bianco (0-25 kHz, 100 scoppia msec con 5 tempo di salita / discesa msec, 1 presentazione ogni 200 msec, 90-100 dB SPL) in un disegno blocco in cui lo stimolo uditivo viene riprodotto per 30 secondi e alternato con un 30 sec basale (non-stimolo) condizione (Figura 5). Ripetere questo passaggio finché attività BOLD acusticamente evocato si osserva nella corteccia uditiva. La durata di ogni ciclo funzionale utilizzando un disegno a blocchi è di circa 4,5 min per 90 volumi.
2. Presentare lo stimolo in apconfigurazione di progettazione blocco propriato per il numero desiderato di piste funzionali.

5. Analisi dei dati

1. Selezionare opportuno software di analisi fMRI (ad esempio SPM, FSL) per processare i volumi funzionali acquisiti.
2. Riallineare ogni volume funzionale al volume acquisito più vicino nel tempo al riferimento anatomico scansione. Salvare i risultanti valori di correzione del movimento per l'impiego nella fase 5.6. Escludere eventuali piste funzionali in cui i movimenti della testa di rotazione superano 1 ° o movimenti della testa traslazionali superano 1 mm.
3. COREGISTER ogni volume al riferimento anatomico scansione.
4. Liscio ogni volume con una metà del massimo a tutta larghezza 2 mm (FWHM) filtro gaussiano.
5. Incorporare una funzione onda quadra (Boxcar), che corrisponde alla ON-OFF disegno a blocchi stimolo come regressore al modello lineare generale (GLM).
6. Incorporare i valori di correzione del movimento come regressori di nessun interesse per tenere conto di artefatti di movimento correlati. Applicare un usoglia statistica ncorrected di p = 0.001 per la GLM risultati per visualizzare i gruppi di attivazione BOLD. Determinare la dimensione del cluster più piccolo che incontra un corretto (errore a conduzione saggio: FEM) Soglia di p <0.05 a livello di cluster. Impostare la soglia misura cluster per questo valore per visualizzare cluster statisticamente significative nelle regioni di interesse.
7. Definire la variazione del segnale BOLD percentuale (PSC) in ciascun voxel come differenza tra il segnale BOLD media durante i blocchi di stimolazione e il segnale BOLD media durante i blocchi di base.

Risultati

Dati funzionali rappresentativi sono stati acquisiti in uno scanner foro orizzontale 7T e analizzati utilizzando la casella degli strumenti Statistical Parametric Mapping in MATLAB. Robusti risposte emodinamiche corticali alla stimolazione uditiva sono stati costantemente osservati nei gatti utilizzando il protocollo sperimentale descritto ^43. Figura 6 illustra l'attivazione BOLD in 2 animali in risposta ad un 30 sec stimolo rumore a banda larga presentato in un disegno a blocchi. Mappe T...

Discussione

Nella progettazione di un esperimento fMRI per un modello anestetizzato della funzione uditiva degli animali, le seguenti questioni dovrebbe essere data attenta considerazione: (i) l'impatto di anestesia sulle risposte corticali, (ii) l'effetto del rumore di fondo dello scanner, e (iii) l'ottimizzazione della fase di raccolta dei dati della procedura sperimentale.

Mentre una preparazione anestetizzato offre l'importante vantaggio di produrre un prolungato periodo di sedazione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Atropine sulphate injection 0.5 mg/ml	Rafter 8 Products
Acepromazine 5 mg/ml	Vetoquinol Inc.
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml	Bimeda-MTC
Dexmedetomidine hydrochloride (Dexdomitor 0.5 mg/ml)	Orion Pharma
Isoflurane 99.9%	Abbott Laboratories
Lidocaine (Xylocaine endotracheal 10 mg/metered dose)	Astra Zeneca
Lubricating opthalmic ointment (Refresh Lacri Lube)	Allergan Inc.
Saline 0.95%
IV Catheter 22 g (wings)
IV Extension Set	Codan US Corp.	BC 269
IV Administration Set 10 drips/ml
Endotracheal tube 4.0
Heating pads (Snuggle Safe)	Lenric C21 Ltd.
Syringe 60 ml
Equipment
External sound card	Roland Corporation	Cakewalk UA-25EX
Stereo power amplifier	Pyle Audio Inc.	Pyle Pro PCAU11
MRI-compatible insert earphone system	Sensimetric Corporation	Model S14
Foam ear tips for insert earphones	E-A-R Auditory Systems	Earlink 3B
End-tidal CO2 monitor	Nellcor	N-85
MRI-compatible pulse oximeter	Nonin Medical Inc.	Model 7500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-2208