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요약

포유 동물의 청각 시스템의 기능 연구는 전통적으로 전기 생리학 녹음 등의 공간에 초점을 맞춘 기술을 사용하여 수행되었다. 다음 프로토콜은 기능적 자기 공명 영상을 이용하여 고양이 청각 피질에서 유발 혈역학 활성의 대규모 패턴을 시각화하는 방법을 설명한다.

초록

포유류의 청각 시스템에있는 감각 처리의 현재의 지식은 주로 원숭이, 흰 족제비, 박쥐, 쥐, 고양이 등의 동물 모델의 다양한 전기 생리학 연구에서 파생됩니다. 청각 기능의 인간 및 동물 모델 간의 최적 평행선을 그리는 위해서는, 인간의 기능적 이미징 연구 동물 전기 생리학 연구 간의 브리지를 설정하는 것이 중요하다. 기능성 자기 공명 영상 (fMRI)는 대뇌 피질의 여러 영역에 걸쳐 혈역학 적 활동의 다양한 패턴을 측정 설립, 최소 침습적 방법이다. 이 기술은 널리 인간의 뇌에서 감각 기능을 조사하는 데 사용되는, 인간과 동물 모두에서 청각 처리의 연구를 연결하는 유용한 도구이며, 성공적으로 원숭이와 쥐의 청각 기능을 조사하는 데 사용되었다. 다음 프로토콜은 마취 성인의 청각 기능을 조사하기위한 실험 절차를 설명의 fMRI를 사용하여 청각 피질의 자극 유발 혈역학 적 변화를 측정 고양이. 이 방법은 따라서 포유류의 청각 피질의 종의 독립적 인 기능의 더 나은 이해에 이르는 청각 기능의 다른 모델에서 혈역학 적 반응의 비교를 용이하게한다.

서문

포유류의 청각 처리의 현재 이해는 주로 원숭이 1-5, 흰 족제비 6-10, 박쥐 11-14, 15-19 설치류, 고양이 20 ~ 24에 침략 전기 생리학 연구에서 파생됩니다. 전기 생리 기법은 일반적으로 전극 팁을 둘러싸는 신경 조직의 작은 영역 내에서 단일 및 복수의 뉴런의 활성을 기록하는 세포 외 미소 전극을 이용한다. 광 이미징 및 기능성 자기 공명 영상 (fMRI)와 같은 기능 영상 방법, 뇌의 여러 공간적으로 서로 다른 지역에 걸쳐 동시 운전 장치 ​​활동의 거시적 관점을 제공하여 세포 녹음에 유용 보완 역할을 설립. fMRI를 혈액 산소 수준의 종속 (BOLD)를 이용하면서 내장 신호 광학 이미징은 표면 조직의 반사 특성의 활동과 관련된 변화를 측정하여 뇌의 유발 활동의 시각화를 용이하게특정 작업 중에 활성 뇌 영역의 자극 - 유발 혈역학 적 변화를 측정 대조적. 광학 이미징 자극 유발 활동 (25)과 관련된 표면 조직의 반사율의 변화를 측정하는 대뇌 피질의 표면에 직접 노출이 필요합니다. 비교에서의 fMRI는 비 침습적이며 그대로 두개골 내에서 대뇌 피질의 표면에 26 ~ 28과 고랑 기반 27, 29 유발 활동을 모두 측정하는 환원 된 혈액의 성체의 특성을 이용한다. 인간이 아닌 영장류 시각 ​​피질 (30)과 인간의 청각 피질 (31)의 BOLD 신호와 신경 세포의 활동 사이에 강한 상관 관계는 감각 기능을 연구 할 수있는 유용한 도구로의 fMRI를 확인합니다. 의 fMRI는 tonotopic 조직 32-36, 청각 기능 (37)의 재화, 대뇌 피질의 활성화 패턴, 대뇌 피질의 영역 (38)의 식별, 소리의 영향과 청각 경로의 기능을 연구하기 위해 광범위하게 사용되고 있기 때문에청각 응답 특성 39, 40, 인간, 원숭이, 쥐 모델, 고양이의 청각 기능을 연구하기에 적합한 기능 영상 프로토콜의 개발에 유용한 보충을 제공 할 것이다에 굵은 응답 시간 코스 29,41의 특성에 대한 강도 기능 영상 문학. fMRI를 또한 마취 된 고양이 26-28,42에있는 시각 피질의 다양한 기능적 측면을 탐구하는 데 사용되었지만, 몇 가지 연구는 고양이 청각 피질의 감각 처리를 검토하는이 기술을 사용하고 있습니다. 본 프로토콜의 목적은 마취 된 고양이의 청각 피질 기능을 정량화의 fMRI를 사용하는 효과적인 방법을 확립하는 것이다. 이 논문에서 설명하는 실험 절차는 성공적으로 성인 고양이 청각 피질 (43)에 BOLD 응답 시간 코스의 특징을 설명하는 데 사용되었다.

프로토콜

다음 절차는 고양이가 사용되는 마취 된 어​​떠한 촬상 실험에 적용 할 수있다. (1.1-1.7 단계, 2.8, 4.1) 특별히 청각 실험에 필요한 단계는 다른 감각 자극 프로토콜을 수용하기 위해 수정 될 수 있습니다.

모든 실험 절차는 웨스턴 온타리오 대학의 동물 관리에 대학위원회의 동물 사용 분과위원회의 승인을받은 동물 관리에 캐나다위원회 (CCAC) (44)에 의해 지정된 지침을 따랐다. 설명 실험 회복 동물 준비에서 약 150 분을 필요로합니다. 실험의 시간 코스는도 1에 도시되어있다.

1. 자극 장비 준비

도 2는 전자 부품 및 MRI 스캐너에서 청각 자극을 생성하기 위해 필요한 해당 연결을 나타낸다. 요구 사항은 F과 같습니다ollows : 컴퓨터, 외장 사운드 카드, 스테레오 파워 앰프와의 fMRI 호환 이어폰 시스템.

  1. 범용 직렬 버스 (USB) 케이블을 통해 외부 사운드 카드에 청각 자극을 제시하는 데 사용되는 컴퓨터를 연결한다.
  2. 스테레오 전력 증폭기의 입력 포트에 외부 사운드 카드의 출력 포트를 연결하는 케이블을 연결.
  3. fMRI를 호환 이어폰 시스템의 변압기 박스의 입력 포트에 스테레오 전력 증폭기의 출력 포트를 연결하는 케이블을 연결.
  4. 변압기 상자의 출력 포트에 바 이노 럴 이어폰을 연결합니다.
  5. 사용 스캐너 실외 침투 패널 변압기 박스를 연결하는 BNC 연결과 동축 케이블을 차폐.
  6. 스캐너 실내의 침투 패널에 대응 BNC 포트에 이어폰 케이블 조립체를 연결한다.
  7. 이어폰에 폼 이어 팁을 연결 한 후 이어폰 t에게 연결케이블 어셈블리 오. 그 소리는 이어폰을 컴퓨터에서 전송되는 확인하기 위해 테스트 청각 자극을 실행합니다. 이어폰을 분리하고 동물의 준비 단계 (단계 2.7) 동안 안전하게 고양이의 귀에 폼 이어 팁을 삽입합니다.

2. 동물 준비

  1. , 고양이를 premedicate 피하 (SC) 주사를 통해 아트로핀 황산염의 진정 혼합물 (0.02 ㎎ / ㎏)와 아세 프로 마진 (0.02 ㎎ / ㎏)을 관리하는.
  2. 20 분 후, 마취를 유도하기 근육 내 (IM) 주사를 통해 케타민 (4 ㎎ / kg) 및 dexmedetomidine 염산염 (0.02 ~ 0.03 ㎎ / kg)을 투여. 케타민 통상 케타민 단독 45 사용될 때 일반적으로 관찰 떨림과 근육 경직을 줄이기 위해,이 경우, dexmedetomidine 염산염, 진정제, 근육 이완제와 결합된다. 이 마취 조합은 일반적으로 진정 작용의 약 150 분을 유도하고 자주 유도하기 위해 동물의 실제 사용작은 동물을 마취.
  3. 고양이가 된 직립 반사 손실되면, 절차를 수행하는 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 적용합니다. 마취제의 정맥 전달을위한 중간 복재 정맥 유치 카테터를 배치합니다.
  4. 앞발은 그 고양이가 발을 철회 여부를 관찰에 발가락을 곤란하게하여 성공적으로 마취 유도를위한 시험. 페달 반사가 사라지면, 다음 4.0-4.5 기관 내 튜브와 함께 고양이를 삽관 인두 벽에 리도카인을 분사하여 개그 반사를 억제합니다.
  5. 1.5 L / 분에서 100 % 산소를 전달 케타민의 일정한 속도로 주입 (0.6-0.75 ㎎ / ㎏ / h) 및 흡입 이소 플루 란 (0.4 ~ 0.5 %)와 영상 세션에 걸쳐 마취를 유지합니다. 60 ML의 주사기에 생리 식염수 60 ㎖ 및 케타민 (ketamine) 0.07 ㎖의 결합 후 주사기 펌프에 주사기를 놓습니다. 이 단계는 고양이를 premedicating하기 전에 수행 할 수 있습니다.
  6. MRI-호환의 바닥에 따뜻한 왁스 채워진 가열 패드를 배치주도 (도 3a 및도 3C) 다음 슬 레드의 내부 벽 주위에 절연 플라스틱 버블 랩 레이어.
  7. MRI 호환 썰매 (그림 3C)에서 절연 버블 랩 내에서 흉골 위치에 고양이를 넣습니다.
  8. 고양이가 배치되면, 귀에 액세스하는 헤드를 조정한다. 가능한 가장 작은 직경으로 폼 이어 팁을 롤 후 깊은 외이도에 각 귀 끝을 삽입합니다. 일단 삽입, 폼 이어팁은 귀 운하 내에서 공간을 채우기 위해 확장해야합니다.
  9. 머리가 제대로 3 채널 무선 주파수 (RF) 코일 (그림 3B) 내에 위치 할 때까지 고양이를 조정합니다. 음향 감쇠 메모리 폼 (그림 3D)로 머리를 고정. 스캐너 소음의 추가 감쇠를 제공하기 위해 귀 주위에 거품을 놓습니다.
  10. 다음 보안 스캐너 침대에 썰매를 운반 플라스틱 버블 랩의 절연 담요에 고양이를 감싸십시오.
  11. 고양이에 주입 라인, 마취 배달 튜브 및 모니터링 장비를 연결합니다. 침투 패널에 부착 된 이어폰 케이블 어셈블리에 이어폰을 연결합니다.
  12. 마취의 깊이에 기초하여 필요에 따라 0.6 ㎎ / kg /시의 기본 유량으로 케타민 주입을 시작하고 유량을 증가시킨다. 해부학 적 검사가 수집되고 나면 초기 이소 플루 란 용량을 0.5 %로 설정 한 후 0.4 %로 감소.
  13. 모니터와 스캐너 구멍에서 적절한 거리에 위치 MRI 호환 모니터링 장비를 사용하여 실험을하는 동안 고양이의 혈액 산소 포화도, 호 기말 이산화탄소 농도, 심박수, 호흡 및 직장 온도를 (가능한 경우)을 기록. 표 1 값과이 절차의 성공적인 실행을위한 생리 학적 측정의 범위를 의미한다. 심장 박동 및 호흡의 꾸준한 증가는 일반적으로 마취에서 절박한 복구와 연관되어 있습니다.
  14. 이후의ession는 썰매에서 고양이를 제거 완료됩니다. 동물이 완전히 회복 될 때까지 가열 패드와 수건 보조 난방을 제공하기 위해 계속합니다. 개그 반사가 반환되면, 기관 내 튜브를 제거합니다. 복원력 반사는 다음 시설에 동물을 반환 복원 될 때까지 고양이를 모니터링합니다. 실험에서 부작용을 지키기 위해 동물에게 시술 후 하루를 평가합니다.

3. 뇌 영상

  1. 축 슬라이스 방향으로 고양이의 뇌의 해부학 적 검사를 수집합니다. 해부학 적 기준 볼륨에 대한 다음과 같은 이미지 매개 변수를 사용하여 TR = 750 밀리 초와 플래시 영상 시퀀스를, TE = 8 밀리 초, 매트릭스 = 256 X 256 X 1.0 mm 수집 복셀 크기 = 281 μm의 X 281 μm의. 해부학 적 검사의 지속 시간은 약 6 분. 그림 4 (왼쪽 패널) 지정된 매개 변수를 사용하여 얻은 샘플 해부학 적 이미지 조각을 제공합니다.
  2. 능의 대한 다음 촬상 파라미터를 사용NAL 볼륨 : TR = 1,000 밀리로, TE는 = 15 밀리 초, 3 세그먼트 / 비행기, 21 X 1mm의 조각 분할 인터리브 에코 평면 수집 (EPI) 행렬 = 96 X 96, 시야 = 72mm X 72 mm, 취득 복셀 크기 = X 825 mm × 1.0 mm 0.75 mm;. 수집 시간 = 3 초 / 볼륨 4 (오른쪽 패널)도 지정된 매개 변수를 사용하여 얻은 샘플 기능 이미지 조각을 제공합니다.

4. 자극의 프리젠 테이션

  1. 청각 자극이 30 초 동안 재생되는 블록 디자인에 광대역 백색 잡음 자극 (0-25 kHz에서, 5 밀리 초 상승 / 하강 시간, 1 프리젠 테이션 100 밀리 초 버스트마다 200 밀리 초, 90-100데시벨 SPL)를 제시하고 30 초 기준 (무 자극) 상태 (그림 5)로 교체했다. 어쿠스틱 유발 BOLD 활동이 청각 피질에서 관찰 될 때까지이 단계를 반복합니다. 블록 설계를 사용하여 각각의 기능의 실행 기간은 90 볼륨에 대해 약 4.5 분이다.
  2. AP에 자극을 제시기능 실행의 원하는 번호와 적합한 블록 설계 구성.

5. 데이터 분석

  1. 획득 한 기능 볼륨을 처리 할 수있는 적절한의 fMRI 분석 소프트웨어 (예 : SPM, FSL)을 선택합니다.
  2. 참고 해부학 적 검사에 시간에 가까운 인수 볼륨에 각 기능 볼륨을 다시 정렬합니다. 단계 5.6 사용에 대한 결과 모션 보정 값을 저장합니다. 회전 헤드의 움직임이 1 ° 또는 번역 헤드의 움직임을 1 mm를 초과를 초과하는 모든 기능 실행을 제외합니다.
  3. 참고 해부 검사에 Coregister 각 볼륨.
  4. 2mm 반치 전폭 (FWHM) 가우시안 필터를 사용하여 각 볼륨을 부드럽게.
  5. 일반 선형 모형 (GLM)에 대한 회귀 변수로 ON-OFF 자극 블록 설계에 해당하는 구형파 (박스 카) 기능을 통합 할 수 있습니다.
  6. 운동 관련 이슈를 설명 할 수없는 그 회귀 변수로 모션 보정 값을 통합. U 적용P의 ncorrected 통계 임계 값은 = GLM에 0.001 BOLD 활성화의 클러스터를 볼 수 결과. (: FWE 가족 현명한 오류) 클러스터 수준에서 p <0.05의 임계 값 수정을 충족 작은 클러스터의 크기를 결정합니다. 관심 영역에서 통계적으로 의미있는 클러스터를 보려면이 값으로 클러스터 범위의 임계 값을 설정합니다.
  7. 기준 블록 동안 자극 블록과 평균 BOLD 신호 동안 평균 BOLD 신호의 차이로 각 복셀의 BOLD %의 신호 변화 (PSC)를 정의합니다.

결과

대표적인 기능 데이터는 7T 수평 구멍 스캐너에서 획득 및 MATLAB에서 통계 파라 메트릭 매핑 도구를 사용하여 분석 하였다. 청각 자극에 강력한 대뇌 피질의 혈역학 적 반응은 지속적으로 기술 된 실험 프로토콜 43을 사용하여 고양이에서 관찰되었다. 그림 6은 블록 설계에서 제시된 30 초 광대역 잡음 자극에 대한 응답으로이 동물의 BOLD 활성화를 보여줍니다. 기준 대 광대역 잡...

토론

청각 기능의 마취 된 동물 모델의 fMRI 실험 설계에서, 다음과 같은 문제가 신중하게 고려되어야한다 : 피질 반응에 마취 (I)의 영향, 배경 스캐너 잡음 (II)의 효과, 그리고 (iii) 최적화 실험 절차의 데이터 수집 단계.

마취 준비 진정 작용의 연장 기간을 생산 및 기능 영상 세션 동안 잠재적 인 머리의 움직임을 최소화하는 중요한 이점을 제공하지만, 마취는 대뇌 피질의 혈류 역...

공개

저자는 금융 또는 기타 관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 말

저자는 MRI 호환 썰매를 디자인 한 사용자 정의 RF 코​​일 설계 카일 길버트, 케빈 바커의 기여를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR), 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회, 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI)에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
Atropine sulphate injection 0.5 mg/mlRafter 8 Products
Acepromazine 5 mg/mlVetoquinol Inc.
Ketamine hydrochloride 100 mg/mlBimeda-MTC
Dexmedetomidine hydrochloride (Dexdomitor 0.5 mg/ml)Orion Pharma
Isoflurane 99.9%Abbott Laboratories
Lidocaine (Xylocaine endotracheal 10 mg/metered dose)Astra Zeneca
Lubricating opthalmic ointment (Refresh Lacri Lube)Allergan Inc.
Saline 0.95%
IV Catheter 22 g (wings)
IV Extension SetCodan US Corp.BC 269
IV Administration Set 10 drips/ml
Endotracheal tube 4.0
Heating pads (Snuggle Safe)Lenric C21 Ltd.
Syringe 60 ml
Equipment
External sound cardRoland CorporationCakewalk UA-25EX
Stereo power amplifierPyle Audio Inc.Pyle Pro PCAU11
MRI-compatible insert earphone systemSensimetric CorporationModel S14
Foam ear tips for insert earphonesE-A-R Auditory SystemsEarlink 3B
End-tidal CO2 monitorNellcorN-85
MRI-compatible pulse oximeterNonin Medical Inc.Model 7500
Syringe pumpHarvard Apparatus70-2208

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