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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Gli isozimi lipossigenasi (LOX) possono generare prodotti che possono aumentare o diminuire la neuroinfiamminazione e la neurodegenerazione. Uno studio di interazione gene-ambiente potrebbe identificare effetti specifici dell'isozima LOX. L'uso del modello 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) del danno nigrostriatale in due linee transgeniche carenti di isozima LOX consente il confronto del contributo degli isozimi LOX sull'integrità dopaminergica e sull'infiammazione.

Abstract

L'attività della lipossigenasi (LOX) è stata implicata in disturbi neurodegenerativi come il morbo di Alzheimer, ma i suoi effetti nella patogenesi del morbo di Parkinson (PD) sono meno compresi. I modelli di interazione gene-ambiente hanno utilità nello smascherare l'impatto di specifiche vie cellulari in tossicità che non possono essere osservate usando solo un modello di malattia genetica o tossico. Per valutare se isozimi LOX distinti contribuiscono selettivamente alla neurodegenerazione correlata alla PD,i topi transgenici (cioè 5-LOX e 12/15-LOX carenti) possono essere sfidati con una tossina che imita la lesione cellulare e la morte nel disturbo. Qui descriviamo l'uso di una neurotossina, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP), che produce una lesione nigrostriatale per chiarire i distinti contributi degli isozimi LOX alla neurodegenerazione legata alla PD. L'uso dell'MPTP nel topo, e nel primate non umano, è ben consolidato per riassumere i danni nigrostriatale nella PD. L'estensione della lesioning indotta da MPTP è misurata dall'analisi HPLC della dopamina e dei suoi metaboliti e dall'analisi semi-quantitativa western dello striato per l'idrossilasi tirosina (TH), l'enzima limitante della velocità per la sintesi della dopamina. Per valutare i marcatori infiammatori, che possono dimostrare sensibilità isozima-selettiva LOX, le proteine acide fibrillari gliali (GFAP) e l'immunoistochimica Iba-1 vengono eseguite su sezioni cerebrali contenenti substantia nigra, e l'analisi gfap western blot viene eseguita su omogeneati striatoli. Questo approccio sperimentale può fornire nuove informazioni sulle interazioni gene-ambiente alla base della degenerazione nigrostriatale e della PD.

Introduzione

L'uso di modelli di interazione gene-ambiente fornisce un approccio ai fattori di rischio imitatori che probabilmente influenzano il morbo di Parkinson idiopatico (PD) e offre l'opportunità di discernere intuizioni meccaniche che difficilmente saranno chiarite dall'uso di un solo sistema genetico o tossico1,2. Qui illustriamo questo punto e descriviamo l'applicazione del modello di topo 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) della degenerazione nigrostriatale3 per comprendere meglio la selettività dell'attività isozima lipossigenasi (LOX) sulla neuroinflammazione e tossicità4. Mentre un ruolo per gli isozimi LOX è stato ampiamente valutato nei disturbiperiferici 5,6 così come nella malattia del SNC tra cuil'ictus 7 e il morbo di Alzheimer8,9, il ruolo della famiglia degli isozimi nella funzione nigrostriatale e nella degenerazione correlata alla PD non è ben compreso e merita uno studio. La neurotossina MPTP dimostra una degenerazione preferenziale della via nigrostriatale e ricapitola l'esaurimento della dopamina striatale e la perdita di cellule dopaminergiche nigral che sono alla base delle compromissioni motorie nei pazienti con PD10. Sebbene questo modello non riproduca l'intero cadre dei comportamenti della PD non motoria e motoria e della patologia del corpo lewy positiva alla α-sinuchicina, è stato utile chiarire nuovi obiettivi meccanicistici che contribuiscono al danno nigrostritale e per i test traslazionali in fase iniziale in quanto è il modello non invasivo meglio caratterizzato disponibile per produrre in modo affidabile la morte cellulare nigrale accompagnata da perdita di dopamina stritale11-15. L'ampio utilizzo del topo MPTP, con paradigmi che vanno da acuto, subacuto acronico 16-18,ha permesso la standardizzazione del dosing per provocare danni nigrostriatali da lievi agravi 19,20 con attivazione di diversi meccanismi di tossicità a seconda del regime di trattamento18,21,22. Di conseguenza, ciò consente di prendere di mira una "finestra di lesioniing" che può comportare lesioni nigrostriali migliorate o ridotte a seconda dell'agente terapeutico o del modello transgenicoutilizzato 23-25.

Essenziali anche per gli studi di biologia traslizionale e di scoperta sono le tecniche utilizzate per valutare i danni e le prove fornite da tali metodi. Per il modello di topo MPTP, le metriche stabilite per valutare la lesioning sono la misurazione dei marcatori del tono dopaminergico striato, tra cui la dopamina e i suoi metaboliti da parte dell'HPLC, e l'analisi western blot dell'idrossilasi tirosina (TH), l'enzima limitante della velocità nella sintesi della dopamina e indicatori di eventi degenerativi come l'attivazione gliale utilizzando l'analisi western della macchia e l'immunoistochimica4. Sebbene queste siano procedure neurochimiche classiche, biochimiche e istologiche, le tecniche forniscono letture critiche e riproducibili sull'entità del danno all'interno della via dopaminergica nigrostriatale, indicano meccanismi di tossicità e si sono dimostrate strumenti preziosi per comprendere gli eventi degenerativi nella PD.

Protocollo

Nota: tutte le procedure e i metodi di cura degli animali dovrebbero essere approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'istituzione. Lo studio qui descritto è stato eseguito in conformità con le linee guida stabilite dalla IACUC di SRI International.

1. Acquisizione e manutenzione di topi carenti di LOX

  1. Acquista topi carenti di 5 LOX o 12/15-LOX e rispettivi controlli a sforzo e sex-matched all'età di 7-8 settimane e concedi diversi giorni per l'acclimatazione alla struttura dopo l'arrivo.
  2. Mantenere i topi in alloggi di gruppo su un ciclo di buio chiaro 12 ore e dare cibo e acqua potabile ad libitum.

2. Precauzioni MPTP, stoccaggio, preparazione, decontaminazione e smaltimento

Nota: L'intossicazione mptp da esposizione endovenosa nell'uomo ha dimostrato di causareparkinsonismo 10; MPTP è altamente lipofilo e può facilmente attraversare la barriera ematica-encefalica26. Dovrebbero essere adottate misure precauzionali per garantire una manipolazione, una disintossicazione e uno smaltimento sicuri. Il suo metabolismo comporta più passaggi tra cui la conversione in 1-metil-4-fenil-2,3-diidropiridinio dall'enzima monoammina ossidasi B (MAO-B)27. Gli inibitori mao-B possono essere utilizzati in caso di intossicazione accidentale umana.

  1. Assicurarsi che il personale abbia un'adeguata formazione in materia di sicurezza e gestione prima di utilizzare l'MPTP come dettato dal comitato per la salute e la sicurezza dell'istituzione. Ogni istituzione può stabilire e attuare le proprie procedure operative standard per l'uso dell'MPTP, sulla base di raccomandazioni delineate in modoesaustivo nella letteratura 17,22.
  2. Prima della preparazione, indossare dispositivi di protezione individuale appropriati (DPI) tra cui: camice da laboratorio monouso o tuta per tutto il corpo, guanti a doppio nitrile, maschera chirurgica, copricapelli, occhiali di sicurezza e copriscarpe monouso. I DPI adeguati devono essere indossati durante la preparazione dell'MPTP, il paradigma di iniezione e 72 ore dopo l'iniezione durante la manipolazione di animali e / o biancheria da letto.
  3. Eseguire calcoli prima della preparazione. Dovrebbero essere seguiti gli orientamenti istituzionali per il dosamento dei volumi; la consegna di 100-150 μl viene tipicamente utilizzata per 25-30 g di topi.
    1. Per preparare una soluzione MPTP da 3 mg/ml in salina, applicare un fattore di correzione (1,211 MPTP-HCl: base libera 1,0 MPTP); la concentrazione di MPTP-HCl nel veicolo salino è di 3,633 mg/ml.
    2. Preparare tutte le attrezzature, le forniture e i reagenti necessari per la preparazione dell'MPTP e la potenziale decontaminazione delle fuoriuscite prima di maneggiare la neurotossina.
  4. Rimuovere il flaconcino sorgente MPTP-HCl dalla posizione di archiviazione corretta.
    Nota: MPTP deve essere mantenuto a RT in una fiala chiusa all'interno di un contenitore secondario e conservato all'interno di un armadio bloccato, etichettato come "MPTP".
    1. Coprire l'area circostante le bilance con cuscinetti o tovaglioli di carta inumiditi con una soluzione di candeggina al 10% per ridurre il rischio di polvere fuoriuscita. Tenere i tessuti e la soluzione di candeggina al 10% nelle vicinanze per precauzione.
    2. Utilizzando una bilancia analitica situata in una cappa aspirante, pesare 50 mg di MPTP-HCl in flaconcino di vetro con contenimento secondario contenente il 10% di tessuto imbevuto di candeggina. Etichettare la fiala di vetro "MPTP" con concentrazione e data.
    3. Chiudere la fiala sorgente e pulire l'esterno con candeggina al 10%.
  5. Aggiungere lentamente 13,763 ml di soluzione salina sterile al flaconcino e chiudere completamente per la miscelazione. (La soluzione è di 3,633 mg/ml mptp-hcl.)
    1. Nella cappa, sterilizzare accuratamente la soluzione MPTP mediante filtrazione utilizzando un filtro da 0,22 μm in fiala di iniezione etichettata all'interno di un contenitore secondario con tessuto imbevuto di candeggina al 10%. Pulire qualsiasi fuoriuscita con tessuto imbevuto di candeggina.
    2. Smaltire con cura taglienti e fiala in un contenitore a rischio biologico opportunamente etichettato. Mantenere la soluzione MPTP in fiala nel contenitore secondario con tessuto imbevuto di candeggina per il trasporto nella sala di procedura degli animali.
      Nota: non autoclavare la soluzione MPTP per la sterilizzazione in quanto la sua vaporizzazione è un rischio di inalazione.
  6. Riportare il flaconcino di origine MPTP nel contenitore secondario e posizionarsi nella posizione di archiviazione. Spatola decontaminata, scala analitica e superficie del cofano per 10 minuti utilizzando candeggina al 10%.

3. Amministrazione MPTP

  1. Preparare gabbie monouso con coperchi perforati microisolatori standard contenenti stoviglie filtrate in poliestere contrassegnate con "MPTP" (meno griglia alimentare a filo), portacavi monouso, pellet alimentari pre-umidi e idrogel come fonte d'acqua. Pesare tutti gli animali e registrare il volume di 3 mg/ml di MPTP in salina richiesto per 15 mg/kg di iniezione.
    Nota: i metaboliti MPTP sono rilevabili negli escrementi per 3 giorni dopol'iniezione 28,29; tuttavia, i topi espelleno MPTP n-ossido, un derivato atossico che non attraversa le membrane a causa della sua idrofilia30.
    1. Indossare tutti i DPI sopra elencati e tenere i topi sopra un tampone di assorbimento monouso, iniettare un veicolo salino o una soluzione MPTP per 15 mg / kg di dose nella cavità intraperitoneale (i.p.), ogni giorno per 4 giorni con una siringa tubercolina monouso calibro 26.
    2. Non ricatturare la siringa dopo l'uso; smaltire in un contenitore di affilati biopertomi MPTP dedicato ed etichettato. Mantenere il 10% di candeggina e tessuti nelle vicinanze per pulire eventuali gocciolamenti accidentali.
  2. Posizionare gli animali iniettati con MPTP in gabbie monouso, fino a 5 topi per gabbia e alloggiare su rack aperti. Non utilizzare rack ventilati.
    1. Posizionare MPTP utilizzare cartelli su rack contenenti topi e porta della stanza di alloggiamento fino a 72 ore dopo l'ultima iniezione.
      Nota: assicurarsi che la temperatura del locale abitativo sia compresa tra 22,2 e 24,4 o C, poichéitopi sperimentano ipotermia transitoria fino a 12 ore dopo l'intossicazione mptp. 31 di cui: La commissione per la
    2. Superficie di lavoro decontaminata con candeggina dopo ogni utilizzo (vedere fase 2.8), smaltire la soluzione MPTP rimasta mediante aggiunta di un equivalente in volume di candeggina al 10% e scartare il contenuto come rifiuti liquidi pericolosi per via bioa rischiosa.
    3. Scartare tutti i DPI usati nel contenitore di smaltimento dedicato. Se necessario, spruzzare con candeggina al 10% prima dello smaltimento.
  3. Controllare regolarmente gli animali e rinfrescare quotidianamente cibo e fonte d'acqua durante il paradigma di iniezione e 72 ore dopo l'ultima iniezione. Nota: sebbene non sia prevista alcuna contaminazione nell'area immediatamente circostante l'esterno della gabbia, questa regione viene trattata con la soluzione di candeggina per precauzione (come descritto al passaggio 2.8). Prestare attenzione quando si maneggiano tutti i topi e le attrezzature durante questo periodo.
    1. Tre giorni dopo l'ultima iniezione, smaltire tutte le gabbie e le nze in un sacchetto a rischio biologico opportunamente etichettato. Riprendere l'uso di DPI regolari e alloggi normali per gli animali; rimuovere i cartelli di porte e scaffali.

4. Raccolta dei tessuti

  1. Eutanasia degli animali mediante lussazione cervicale 7 giorni dopo l'ultima iniezione di MPTP. Sezionare immediatamente il cervello sul ghiaccio usando muffa cerebrale pre-refrigerata con fessure di 1 mm nel piano coronale.
  2. Sezionare lo striato da una fetta di forebraina spessa 2 mm a livello della commissure anteriore.
    1. Rimuovere le regioni corticali e subcorticali circostanti utilizzando un bisturi. Tessuto striato snap-freeze da ogni emisfero in un tubo di microcentrifugo separato da 1,5 ml per analisi neurochimiche o biochimiche.
  3. Bloccare il cervello medio/posteriore nel piano coronale a livello dell'ipotalamo anteriore e del tessuto ad immersione-fissazione in soluzione acquosa di formaldeide al 4%.

5. Lavorazione dei tessuti

  1. Processo di biochimica
    1. Omogeneizzare il tessuto striato da un emisfero utilizzando un disgregatore cellulare ad ultrasuoni in tampone di lisi Tris-EDTA da 200 μL (base Tris da 25 mM, 1mM EDTA, 1:100 cocktail di inibitore della proteasi e della fosfatasi) per 10 impulsi a 10-12 Hz e centrifugati per 10 min alle 4oC a 1000xg.
    2. Aspirare con cura il supernatante e ricostituire il pellet in tampone di lysis da 150 μl. Le frazioni sono utilizzate per l'analisi biochimica da SDS-PAGE e western blotting.
      Nota: utilizzare proteasi e tampone contenente inibitori della fosfatasi entro 1 h dalla preparazione a causa dell'instabilità nelle soluzioni acquose.
  2. Processo di neurochimica
    1. Utilizzare lo striato sezionato da un altro emisfero da ogni campione conservato a -80°C per HPLC. Scongelare i tessuti striati in tubi di microfugo sul ghiaccio, aggiungere acido perclorico 500-μl 0,3N (PCA) e omogeneizzare utilizzando il sonicatore.
      Nota: Per fare 100 ml di PCA da 0,3N, misurare 90 ml ddH2O, aggiungere a un cilindro graduato da 100 ml, aggiungere 2,58 ml di PCA al 70% e portare a segno da 100 ml. Questo tampone campione può essere conservato a 4°C per un massimo di un mese.
    2. Sonicare il tessuto striato in PCA da 0,3N ghiacciato da 500 μl, per 10 impulsi a 10-12 Hz e posizionare sul ghiaccio. Per garantire l'omogeneità, sonicare i campioni una seconda volta per 10 secondi, quindi centrifugare per 12 minuti a 4oC a 16.100xg.
    3. Decantare immediatamente i tubi di microcentrifugo da 1,5 ml e conservare a -80°C. Asciugare all'aria la frazione pellet nel cappuccio.
    4. Mantenere il supernatante a -80°C fino all'uso per la misurazione della dopamina e dei suoi metaboliti, acido 3,4-diidrossifenilacetico (DOPAC) e acido omovanillico (HVA) da parte dell'HPLC con rilevamento elettrochimico.
    5. Una volta asciutto, ricostituire la frazione pellet in NaOH 0,5N (500 μL) e sonicare brevemente. Conservare la frazione di pellet ricostituita a 4°C fino all'uso per la determinazione della proteina totale utilizzando il metodo Lowry.
  3. Processo di immunoistochimica
    1. Blocchi cerebrali medio e posteriori ad immersione durante la notte in soluzione acquosa di formaldeide al 4% e crioprotezione in soluzioni di saccarosio graduato (10% in salina tamponata da fosfati (0,01 M PBS; 0,138 M NaCl, 0,0027 M KCl e ddH2O, pH 7,4) per 24 ore, quindi 30% in PBS fino a quando il tessuto non affonda) a 4°C. Cancellare brevemente i blocchi crioprotetti per rimuovere la soluzione di saccarosio in eccesso, congelare sul ghiaccio secco e conservare a -80 °C fino all'uso.
    2. Sessatura di microtomi di blocchi cerebrali contenenti cervello medio e posteriore in un criostato.
      1. Rimuovere i tessuti da -80°C, equilibrare a -16°C per 1 h in criostato e montare in mezzi di incorporamento tissutale.
      2. Raccogliere sezioni coronali con spessore di 40 μm in soluzione crioprotettiva (0,01 M PBS con 30% di saccarosio, 30% glicole etilenico, pH 7,4) a -16°C. Raccogliere il tessuto in serie in 6 tubi di microcentrifugo da 1,5 ml a intervalli di 240 um e conservare a -20°C.

6. Immunoblotting

  1. Determinare la concentrazione proteica nella frazione supernatante striatale (preparata come descritto nella sezione 5.1) mediante saggio BCA.
  2. Calcolare la diluizione necessaria affinché ogni campione produca 10 μg per ben consegnato in 20 μl di volume.
  3. Diluire la proteina supernatante con tampone 4X Laemmli e tampone di omogeneizzazione per produrre 10 μg di proteine in soluzione tampone Laemmli 1X. Calcolo di esempio:
    1. Determinare la concentrazione finale di proteine e volume necessari. In questo caso, sono necessari 10 μg in 20 μl (0,5 mg/ml).
    2. Determinare il volume finale della soluzione proteica necessaria. Sebbene siano necessari 20 μl per il carico, deve essere preparato un volume aggiuntivo (30 μl).
    3. Poiché il volume finale e la concentrazione sono noti, e la concentrazione della frazione supernatante proteica è nota (determinata dal saggio BCA), calcolare il volume del supernatante proteico richiesto usando l'equazione:
      Vsupernatante = (Vfinale x Cfinale)/C supernatante
      Pertanto, per una concentrazione proteica supernatante di 1,5 mg/ml,
      Vsupernatante = (30 μl x 0,5 mg/ml)/1,5 mg/ml
      Vsupernatante = 10 μl
    4. Calcolare la quantità di tampone 4X Laemmli necessaria per produrre una concentrazione 1x in 30 μl di volume (30 μl / 4 = 7,5 μl). Nota: il tampone 4X Laemmli deve essere diluito a 1X di resistenza nella preparazione del campione.
    5. Calcolare la quantità di tampone di omogeneizzazione necessaria per portare il volume a 30 μl (e ottenere la concentrazione finale di proteine desiderata di 0,5 mg/ml):
    6. Preparare il campione con vortici e poi pipettando 10 μl di supernatante proteico in 12,5 μl di tampone di omogeneizzazione. Aggiungere 7,5 μl di tampone Laemmli 4X per una soluzione di lavoro del campione da 30 μl e una concentrazione di 0,5 mg/ml.
  4. Preparare tutti i campioni utilizzando la procedura descritta, vortice e far bollire per 5 minuti.
    Nota: utilizzare tubi a microcentrifugo a vite per evitare perdite e aperture dovute alla pressione durante l'ebollizione.
  5. Dopo 5 minuti, mettere immediatamente sul ghiaccio. Caricare 20 μl di soluzione di lavoro del campione per gel bene (10 μg di proteine). Separare i campioni proteici da SDS-PAGE su un gel tris-glicina al 12%.
    1. Utilizzare una scala proteica pre-macchiata per la conferma dei pesi molecolari. Il buffer di corsa è tris-base da 25 mM, glicina da 192 mM, 0,1% SDS e ddH2O, pH 8,3.
    2. Proteine separate per elettroforesi: correre a 80 V per cancellare i pozzi (10 min) e 125 V (circa 1 h; fino a quando la scala proteica non si è completamente separata) per risolvere le proteine.
  6. Eseguire il trasferimento di proteina-nitrocellulosa utilizzando la membrana di nitrocellulosa da 0,2 μm nel tampone di trasferimento di tris-glicina (25 mM Tris, 192 mM di glicina, 0,04% SDS, 20% metanolo e ddH2O, pH 8,3) durante la notte per 40 V a 4 °C.
  7. Lavare le macchie di nitrocellulosa in 1x Tris saline (TS; 25mM Tris, 0.9% NaCl in ddH2O, pH 7.4) per 10 min a RT. lncubato a Ponceau S per 5 minuti quindi risciacquare in ddH2O per fornire una verifica approssimativa del carico proteico equivalente. Digitalizzare l'immagine per conservare la registrazione per notebook e detenere utilizzando PBS.
    Nota: In alternativa, lavare la macchia in Milli-Q o ddH2O contenente HCl (0,2%) per circa 5 minuti. Cerca record. Rimuovere la macchia di Ponceau S dalla membrana con successiva fase di incubazione (cioè posizionare nel tampone di blocco).
  8. Bloccare le macchie nel 5% di latte non grasso in polvere in TS per 1 h a RT e incubare 24 ore su 24 a 4ºC con idrossilasi anti-tirosina del coniglio (1:1000), anti-β-actina (1:200); anti-GFAP (1:1000) in 5% latte-TS.
  9. Lavare le macchie 3 x 5 min in TS con 0,05% Di età compresa tra 20 e 1 x 5 min in TS, quindi incubare in anticorpi secondari coniugati con HRP (1:5000 in TS contenente il 5% di latte), abbinati alla specie del primario, per 2 ore a RT.
  10. Preparare il substrato chemiluminescente utilizzando volumi uguali di soluzioni di luminolo e perossido e applicare per 1-3 min. In una camera oscura, posizionare macchia in una manica di plastica per l'esposizione al film ed esporre alla pellicola; la pellicola viene quindi sviluppata utilizzando un processore automatico.
  11. Strip blots con tampone di stripping disponibile in commercio a 37 °C per 30 min, lavare 3x 10 min in TS con 0,05% Tween-20 e 1x 10 min in TS e quindi riprobizzare per il controllo del carico o altre proteine di interesse.
  12. Quantificare i segnali tramite il software Image J per le misurazioni della densità ottica e normalizzarli al controllo interno del carico β–actin.

7. Neurochimica

  1. I tessuti per l'analisi sono preparati come descritto sopra nella sezione 5.2. Fare riferimento alla tabella 1 per la ricetta della fase mobile.
    Nota: tutti i reagenti devono essere ≥99,0% puri e di grado HPLC. Garantire l'integrità del buffer con vetrerie pulite e dedicate e stirare le barre. Il buffer di fase mobile deve essere utilizzato entro sette giorni dalla preparazione.
    1. Pesare il fosfato di idrogeno e l'acido citrico, aggiungere 1 L di ddH2O e mescolare in un cilindro graduato da 2 Litri. Filtrare la soluzione attraverso una membrana GSTF da 0,22 μm.
      Nota: Questo massimizza l'estrazione di contaminanti nel fosfato e nell'acido citrico, che aiuta a ridurre al minimo le correnti di fondo.
    2. Aggiungere l'OSA seguito dalla soluzione acetonitrile ed EDTA. Aggiungere il grado HPLC ddH2O a circa 1900 ml prima di regolare il pH a 3,0 con acido fosforico.
    3. Aggiungere HPLC grado ddH2O al marchio 2-L, quindi versare in un pallone da 2-L. Aggiungere una barra di agitazione dedicata e degasare la fase mobile mescolandola sotto vuoto per > 10 minuti.
  2. Preparare gli standard per la dopamina e DOPAC e HVA per le curve standard. Le soluzioni stock di standard sono preparate a 1 mg/ml in 0,3 N PCA.
    1. Pesare 12,4 mg di dopamina-HCl e aggiungere 10,0 ml di 0,3 N PCA per fare 1 mg / ml di dopamina.
    2. Pesare 10,0 mg di DOPAC e aggiungere 10,0 ml di PCA da 0,3 N per fare 1 mg/ml di DOPAC.
    3. Pesare 10,0 mg di HVA e aggiungere 10,0 ml di 0,3 N PCA per fare 1 mg/ml di HVA.
  3. Preparare soluzioni standard di lavoro dalle soluzioni stock. Gli standard a cinque punti vengono utilizzati per generare una curva di concentrazione.
    1. Per la misurazione della dopamina striatale, preparare concentrazioni standard di 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml e 200 ng/ml.
    2. Per il DOPAC striato, preparare concentrazioni standard di 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml e 40 ng/ml.
    3. Per l'HVA striato, preparare concentrazioni standard di 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml e 80 ng/ml.
    4. Generare standard in cinque punti: diluire 1 mg/ml di soluzione di stock di dopamina a 5 μg/ml utilizzando PCA 0,3N. Diluire 1 mg/ml di soluzione di stock DOPAC a 1 μg/ml utilizzando PCA da 0,3N e diluire la soluzione di stock di HVA da 1 mg/ml a 2 μg/ml utilizzando PCA da 0,3N.
    5. Trasferire 1 ml di 5 μg/ml di dopamina, 1 ml di 1 μg/ml di DOPAC e 1 ml di 2 μg/ml di HVA in un matraccio volumetrico da 25 ml e portare il volume a 25 ml con 0,3 N PCA.
      Nota: Gli standard misti nel pallone volumetrico contengono la più alta concentrazione degli standard a cinque punti: 200 ng/ml di dopamina, 40 ng/ml di DOPAC e 80 ng/ml di HVA.
    6. Trasferire 1 ml delle norme miste in tubi di microcentrifugo puliti da 1,5 ml. Eseguire la diluizione seriale 1:1 quattro volte per generare i successivi standard in quattro punti.
      1. Ad esempio, a 250 μl delle norme miste, aggiungere a fondo 250 μl di tampone e vortice del campione per produrre standard misti al 50% delle concentrazioni originali; processo di ripetizione fino a quando non si ottengono le diluizioni desiderate.
  4. Preparare il sistema HPLC (pompa, autocampionatore, colonna in fase inversa (C18, 150×3,2 mm, 3 μm)). Elimina la pompa con una nuova fase mobile per sostituire tutte le soluzioni precedenti nel sistema HPLC e le bolle d'aria intrappolate con una nuova fase mobile. Raffreddare l'autocampionatore a 4°C. Riscaldare la colonna a 35°C, riducendo la pressione totale.
    1. Impostare la tensione rispettivamente a -150 mV e 220 mV per il primo e il secondo elettrodo del rivelatore elettrochimico. Equilibrare il sistema per almeno 2 ore, e idealmente durante la notte, con la fase mobile ad una portata di 0,2 ml/min.
      Nota: Durante l'equilibrazione le cellule devono essere su e la lettura di base monitorata. La lettura stabile indica che il sistema è pronto per l'uso. Per le due ore della fase di equilibrazione, consentire alla fase mobile di entrare in un contenitore di rifiuti invece di ricircolarlo. Dopo questo periodo, la fase mobile può essere riciclata durante la notte per l'equilibrazione.
    2. Una volta completata l'equilibrazione, regolare la portata della fase mobile a 0,6 ml/min. Iniettare 20 μl di ciascuno degli standard in cinque punti.
  5. Scongelare campioni stritali sul ghiaccio e iniettare 2 x 20 μl di ciascun campione nel sistema HPLC. Utilizza gli standard all'inizio e casualmente in ogni set di campioni striatoli.
  6. Utilizzare il software per analizzare l'area sotto i picchi di dopamina, DOPAC e HVA prodotti dagli standard e dai campioni. Identificare gli aliti in base al tempo di ritenzione e misurare confrontando l'area sotto picco con quella della curva a 5 punti per il suo standard corrispondente.
  7. Preparare la frazione di pellet come descritto nella sezione 5.2.3. Eseguire un saggio di proteine Lowry sul pellet striato. Nota: Questo saggio misurerà la quantità di proteine presenti nei campioni striato in mg/ml; queste informazioni sono utilizzate per determinare la concentrazione ng/mg di alita.

8. Immunoistochimica

  1. Immunofluorescenza duale GFAP/TH
    1. Rimuovere i tubi contenenti midbrain sescate dal congelatore a -20°C e portare a RT. Rimuovere le sezioni di tessuto contenenti sostanza nigra dalla soluzione crioconservativa in un vassoio contenente PBS.
    2. Posizionare le sezioni tissutali in inserti in polistirolo con fondi in rete di poliestere per l'immunochimica flottante. Lavare 3 x 5 minuti in PBS.
    3. Trasferire sezioni in piastra da 96 porcili con soluzione a blocchi da 180 μl (5% siero d'asino normale, 1% PVP, 1% BSA e 0,3% Triton X-100 in PBS) in ogni pozzo. Incubare 40 min a RT.
      Nota: tutti i passaggi di lavaggio e incubazione vengono eseguiti con leggera agitazione sullo shaker.
    4. Trasferire sezioni in pozzi contenenti la soluzione anticorpale primaria (180 μl per pozzo). Incubare in cocktail di anticorpi primari, coniglio anti-GFAP (1:1000) e pecora anti-TH (1:400) diluito in PBS con 1% BSA e 0,3% TX-100, per 24 h a 4°C. L'IgG della specie primaria funge da controllo immunosottenzione negativo.
    5. Incubare in cocktail di anticorpi secondari (1:200 anti-coniglio d'asino 568 e 1:200 FITC anti-pecora asino in PBS con 0,1% TX-100). Utilizzare un foglio per proteggere la soluzione dalla luce durante la preparazione e l'incubazione; incubare a RT per 2 h.
      1. Per un controllo negativo, incubare sezioni in IgG dalla specie primaria diluita alla stessa concentrazione utilizzata per gli anticorpi primari.
      2. Lavare 2 x PBS e 1 x TS per 5 minuti ciascuno a RT. Montare sezioni di tessuto su più scivoli in mezzo di montaggio con macchia hoechst e copripazzo.
    6. Incubare in cocktail di anticorpi secondari (1:200 anti-coniglio d'asino 568 e 1:200 FITC anti-pecora asino in PBS con 0,1% TX-100). Utilizzare un foglio per proteggere la soluzione dalla luce durante la preparazione e l'incubazione; incubare a RT per 2 h.
    7. Lavare 2 x PBS e 1 x TS per 5 minuti ciascuno a RT. Montare sezioni di tessuto su più scivoli in mezzo di montaggio con macchia hoechst e copripazzo.
    8. Proteggere i vetrini dalla luce e dall'ossidazione fino all'imaging memorizzandoli in una scatola di scorrimento a 4°C.
    9. Analizzare prima il controllo negativo per determinare il livello di fondo della fluorescenza, quindi valutare l'immunoreattività positiva utilizzando la microscopia fluorescente.
  2. Immunoistochimica Iba1 con precipitazione di cromageno
    1. Rimuovere i tubi contenenti midbrain sescate dal congelatore a -20°C e portare a RT. Rimuovere le sezioni di tessuto contenenti sostanza nigra dalla soluzione crioconservativa in un vassoio contenente PBS.
    2. Posizionare le sezioni tissutali in inserti in polistirolo per l'immunochimica flottante. Lavare le sezioni 3 x 5 min in PBS e posizionare le sezioni direttamente in una piastra da 12 pozzetti contenente monoidrato di acido citrico preriscaldato da 10 mM, pH 9,0, 80 °C per 30 minuti, per il recupero dell'epitopo.
    3. Piastra fredda 20 min a RT. Restituire le sezioni agli inserti e lavare 3 x 5 minuti in PBS.
    4. Trasferire sezioni in piastra da 96 pozzetti contenente soluzione bloccante da 180 μl (siero di capra normale al 10%, 1% di BSA in PBS) per pozzo e incubare 40 min a RT.
    5. Trasferire sezioni in pozzi contenenti anticorpi primari diluiti da 180 μl (1:1000 nell'1% di BSA-PBS). Incubare durante la notte a 4°C.
    6. Trasferire sezioni in inserti. Lavare 3 x 5 min PBS e applicare anticorpi secondari biotinlati (1:200 nell'1,5% di siero-PBS normale) per 1 h a RT.
    7. Preparare la soluzione ABC 30 minuti prima dell'uso. Lavare 3 x 5 min PBS e trasferire alla soluzione ABC per 1 h a RT.
    8. Preparare la soluzione DAB in cappuccio. Lavare 2x 5 min in PBS e 1x 5 min in TS e incubare sezioni in DAB.
      1. Sviluppare per 3-4 min. Il controllo negativo deve rimanere di colore chiaro.
        Nota: eseguire questo passaggio nella cappa aspirante in quanto DAB è un agente cancerogeno noto. Una soluzione di permanganato di potassio da 0,2 M in ddH2O per la decontaminazione deve essere mantenuta in prossimità in caso di gocciolamento accidentale.
    9. Risciacquare brevemente le sezioni in ddH2O, quindi in TS 3 x 5 min. Montare sezioni su più scivoli e asciugare all'aria durante la notte in cappa aspirante.
    10. Decontaminare i rifiuti DAB con un volume uguale di 0,2 M di permanganato di potassio in ddH2O, vortice e incubare in una cappa aspirante durante la notte prima di immagazzinare in un bidone dei rifiuti DAB opportunamente etichettato nella cappa aspirante.
      Nota: la soluzione di candeggina non elimina le proprietà mutagene di DAB.
      1. Decontaminare gli articoli da riutilizzare (cioè inserti in polistirolo) e lavare con detergente.
    11. Disidratare/controsostenire leggermente con viola cresile (CV). Tutte le fasi di disidratazione/lavaggio sono 3 min: etanolo 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV (30 secondi), ddH20 x 2, 95% etanolo + acido acetico glaciale (0,1%) x 2, 100% etanolo e xilene.
    12. Copricapo in distirolo-toluene-xilene mezzo di montaggio e asciutto in cappa fumi.
    13. Osservare l'immunoreattività positiva al microscopio leggero. L'IgG della specie primaria funge da controllo immunosottenzione negativo.

9. Statistiche

  1. Valutare le differenze tra i mezzi mediante un'analisi univiale della varianza (ANOVA) per confrontare le differenze tra genotipo e ANOVA a due modi per confrontare le differenze tra genotipo e trattamento tossico. Utilizzare l'analisi post hoc HSD di Tukey quando le differenze sono osservate dai test ANOVA(p≤0.05).
    Nota: gli esperimenti (con n = 6-9 topi/gruppo) vengono eseguiti almeno due volte per garantire la riproducibilità.

Risultati

Questo paradigma di esposizione alla tossina può produrre un significativo e rilevabile esaurimento della dopamina striatale del 20% negli animali iniettati da MPTP rispetto a quello iniettato in soluzione salina. È importante notare che diversi lotti di MPTP possono produrre leggermente più o meno lesioni; pertanto, per una migliore precisione, si raccomanda un esperimento preliminare nei topi di tipo selvatico prima dell'uso in transgenica quando viene utilizzato un nuovo lotto di neurotossina. L'uso di lesioni da ...

Discussione

La progettazione di questo studio di interazione gene-ambiente ci ha permesso di ottenere nuove informazioni sulla natura duale dell'isozima 5-LOX nel percorso nigrostriatale. Eseguendo HPLC per misurare le monoammine stritali dopo il trattamento saline o MPTP in transgenica priva dell'isozima 5-LOX e dei loro littermates di tipo selvatico, siamo stati in grado di notare che la sua carenza sembra essere protettiva in condizioni tossiche (Figura 1), ma in condizioni normali, la mancanza dell'enzima riduc...

Divulgazioni

Non c'è nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health NIGMS 056062.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL)Sigma-AldrichM0896for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA)American MasterTech ScientificBUP0157for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA)Sigma-Aldrich244252for HPLC acid extraction
Tris BaseSigma-AldrichT1503for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE1644for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktailSigma-AldrichP5726for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH)Sigma-AldrichS5881for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) Sigma-AldrichS0389for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS)Sigma-AldrichP3813for IHC
BCA Protein Assay KitPierce/Thermo23225for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-wellInvitrogen/Life TechnologiesEC60052BOXfor SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Invitrogen/Life TechnologiesNP0007for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard Invitrogen/Life TechnologiesLC5800protein ladder
GlycineSigma-AldrichG7126for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS)Sigma-AldrichL3771for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent American MasterTech ScientificSPM1057Cmethanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagentSigma-AldrichS9888saline and buffers
Nonfat dry milk powderCarnationn/afor immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid Sigma-AldrichP7170for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonalChemicon/MilliporeAB1542for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonalPel-Freez BiologicalsP40101-0for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbitSigma-AldrichA2066for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonalChemicon/MilliporeAB5804for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonalCovance Inc.SMI-22Rfor immunoblotting
Tween-20Sigma-AldrichP1379for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated Fisher Scientific31462for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugatedPierce/Thermo31480for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugatedPierce/Thermo31430for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstratePierce/Thermo34078for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in Pierce/Thermo34089for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer Pierce/Thermo21059for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% Sigma-AldrichC1909for IHC
Normal Donkey SerumMilliporeS30-100MLfor IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP)Sigma-AldrichP5288for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilizedSigma-AldrichA3294for IHC
Triton X-100Fisher ScientificBP151-01for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled Invitrogen/Life TechnologiesA10042for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC Jackson ImmunoResearch713-095-147for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1500for IHC
Normal Goat SerumMilliporeS26-100MLfor IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) Vector LaboratoriesPK-4001for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidineVector LaboratoriesSK-4100for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30%Sigma-Aldrich216763for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1Biocare MedicalsCP290Afor IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength FD NeurotechnologiesPS102-01counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcoholSigma-AldrichR8382dehydration for IHC
100% Absolute ethanolMallinckrodt7019-10dehydration for IHC
Acetic acidSigma-AldrichA6283destaining for IHC
XyleneSigma-Aldrich534056clearing agent for IHC
DPX MountantSigma-Aldrich06522mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium American MasterTech ScientificEMOCTCSembeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganateSigma-Aldrich223468to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochlorideSigma-AldrichH8502for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC)Sigma-Aldrich850217for HPLC
Homovanillic acid (HVA)Sigma-AldrichH1252for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70%Sigma-Aldrich244252for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateSigma-Aldrich71504for HPLC
Citric acid monohydrateSigma-AldrichC1909for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA)Sigma-AldrichO8380for HPLC
EDTASigma-AldrichE1644for HPLC
AcetonitrileEMDAX0145-1for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O)Milliporefor HPLC
0.22 µm GSTF membraneMilliporefor filtration
Corning NetwellsSigma-AldrichCLS3477polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150)MSEMSE.41371.274
MicrocentrifugeEppendorf5414R
ESA MD-150 reverse-phase column ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000)DionexISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000)DionexWPS-3000TSL
Electrochemical detectorESACoulochem III
Guard CellESA5020
Analytical CellESA5011A
Chromeleon softwareDionex
Eclipse E400NikonE400light/fluorescent microscope
Disposable mouse cageAncareN10HT
Microfilter topAncareN10MBT
5-LOX- deficient miceThe Jackson Laboratory004155
12/15-LOX-deficient miceThe Jackson Laboratory002778

Riferimenti

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