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Resumo

Os isozimos lipoxygenase (LOX) podem gerar produtos que podem aumentar ou diminuir a neuroinflamação e neurodegeneração. Um estudo de interação gene-ambiente poderia identificar efeitos específicos da isozyme lox. Utilizando o modelo 1-metil-4-fenil-1,2,3,3,6-tetrahidropyridine (MPTP) de dano nigrostriatal em duas linhas transgênicas deficientes de isozim lox permite comparar a contribuição de isozimes LOX na integridade e inflamação do dopaminérgico.

Resumo

A atividade lipoxygenase (LOX) tem sido implicada em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, mas seus efeitos na patogênese da doença de Parkinson (DP) são menos compreendidos. Modelos de interação gene-ambiente têm utilidade em desmascarar o impacto de vias celulares específicas na toxicidade que podem não ser observadas usando apenas um modelo de doença genética ou toxicante. Para avaliar se isozymes LOX distintos contribuem seletivamente para a neurodegeneração relacionada à DP, os camundongos transgênicos(ou seja, 5-LOX e 12/15-LOX deficientes) podem ser desafiados com uma toxina que imita lesões celulares e morte na doença. Aqui descrevemos o uso de uma neurotoxina, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridina (MPTP), que produz uma lesão nigrostriatal para elucidar as distintas contribuições de isozimes LOX para neurodegeneração relacionada à DP. O uso de MPTP em camundongos, e primatas não humanos, é bem estabelecido para recapitular o dano nigrostriatal em DP. A extensão da lesão induzida pelo MPTP é medida pela análise hplc da dopamina e seus metabólitos e análise de manchas ocidentais semi-quantitativas de estriato para hidroxilase de tyrosina (TH), a enzima limitante de taxa para a síntese de dopamina. Para avaliar marcadores inflamatórios, que podem demonstrar sensibilidade lox isozyme-seletiva, proteína ácida fibrilar gliana (GFAP) e imunohistoquímica Iba-1 são realizadas em seções cerebrais contendo nigra substantia, e a análise de manchas ocidentais GFAP é realizada em homogeneados estriais. Esta abordagem experimental pode fornecer novas percepções sobre as interações gene-ambiente subjacentes à degeneração nigrostriatal e DP.

Introdução

O uso de modelos de interação gene-ambiente fornece uma abordagem para imitar fatores de risco que provavelmente influenciam a doença idiopática de Parkinson (DP) e oferece a oportunidade de discernir insights mecanicistas que dificilmente serão elucidados pelo uso de um sistema genético ou toxicantesozinho 1,2. Aqui ilustramos este ponto e descrevemos a aplicação do modelo de camundongos 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridine (MPTP) modelo de degeneração nigrostriatal3 para entender melhor a seletividade da atividade de isozínia lipoxygenase (LOX) sobre neuroinflamação e toxicidade4. Embora um papel para isozymes LOX tenha sido amplamente avaliado em distúrbios periféricos5,6, bem como doença de SNC, incluindo AVC7 e Doença de Alzheimer8,9, o papel da família de isozymes na função nigrostriatal e degeneração relacionada à DPN não é bem compreendido e merece estudo. A neurotoxina MPTP demonstra degeneração preferencial da via nigrostriatal e recapitula o esgotamento da dopamina sttartal e a perda de células dopaminérgicas nigral que sustentam prejuízos motoricos em pacientes com DP10. Embora este modelo não reproduza o quadro completo de comportamentos de DP não motor e motor e patologia corporal lewy α-sinuclein-positiva, tem sido útil para elucidar novos alvos mecanicistas que contribuem para danos nigrostriais e para testes translacionais em estágio inicial, pois é o modelo não invasivo mais bem caracterizado disponível para produzir de forma confiável a morte celular nigral acompanhada pela perda de dopamina striatal11-15. O uso amplo do camundongo MPTP, com paradigmas que vão do agudo, subaguto ao crônico16-18,permitiu que a padronização da dosagem resultasse em danos leves a graves de nigrostriatal19,20 com ativação de diferentes mecanismos de toxicidade dependendo do regime de tratamentonº 18,21,22. Consequentemente, isso permite que seja direcionada uma "janela de lesão" que pode resultar em lesão nigrostriatal aprimorada ou reduzida, dependendo do agente terapêutico ou modelo transgênico utilizado23-25.

Também essenciais para estudos de biologia translacional e de descoberta são as técnicas utilizadas para avaliar danos e as evidências que tais métodos fornecem. Para o modelo de mouse MPTP, Métricas estabelecidas para avaliar a lesão são a medição de marcadores de tom dopaminérgico estriatal, incluindo dopamina e seus metabólitos pelo HPLC, e análise de manchas ocidentais de hidroxilase tyrosina (TH), a enzima que limita a taxa na síntese de dopamina, e indicadores de eventos degenerativos como a ativação glial utilizando análise de manchas ocidentais e imunohistoquímica4. Embora sejam procedimentos neuroquímicos clássicos, bioquímicos e histológicos, as técnicas fornecem leituras críticas e reprodutíveis sobre a extensão dos danos dentro da via nigrostriatal dopaminérgica, indicam mecanismos de toxicidade e provaram ser ferramentas valiosas na compreensão de eventos degenerativos em DP.

Protocolo

Nota: Todos os procedimentos de animais e métodos de cuidado animal devem ser aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) da instituição. O estudo descrito aqui foi realizado de acordo com as diretrizes estabelecidas pela IACUC da SRI International.

1. Aquisição e manutenção de camundongos com deficiência de LOX

  1. Compre ratos deficientes de 5-LOX ou 12/15-LOX deficientes e respectivas cepas e controles combinados com sexo aos 7-8 semanas e permita vários dias para aclimatação à facilidade após a chegada.
  2. Mantenha os ratos em habitação em grupo em um ciclo claro-escuro de 12 h e dê comida e água potável ad libitum.

2. Precauções mptp, armazenamento, preparação, descontaminação e descarte

Nota: A intoxicação por MPTP por exposição intravenosa em humanos tem sido demonstrada como causa de parkinsonismo10; MPTP é altamente lipofílico e pode facilmente atravessar a barreira hemencefálica26. Medidas de precaução devem ser tomadas para garantir o manuseio seguro, a desintoxicação e o descarte. Seu metabolismo envolve múltiplos passos, incluindo conversão para 1-metil-4-fenil-2,3-dihydropyridínio pela enzima monoamina oxidase B (MAO-B)27. Os inibidores de MAO-B podem ser utilizados em caso de intoxicação humana acidental.

  1. Certifique-se de que o pessoal tenha treinamento adequado de segurança e manuseio antes de utilizar o MPTP, conforme ditado pelo Comitê de Saúde e Segurança da instituição. Cada instituição pode estabelecer e implementar seus próprios procedimentos operacionais padrão para uso do MPTP, com base em recomendações amplamente descritas na literatura17,22.
  2. Antes da preparação, don equipamento de proteção individual apropriado (EPI) incluindo o seguinte: jaleco descartável ou traje de corpo completo, luvas de nitrito duplo, máscara cirúrgica, tampa de cabelo, óculos de segurança e tampas de sapato descartáveis. Epi adequado deve ser usado durante a preparação do MPTP, o paradigma de injeção e 72 horas pós-injeção ao manusear animais e/ou cama.
  3. Realize cálculos antes da preparação. Devem ser seguidas diretrizes institucionais para os volumes de dosagem; a entrega de 100-150 μl é normalmente usada para ratos de 25-30 g.
    1. Para preparar uma solução MPTP de 3 mg/ml em soro fisiológico, aplique um fator de correção (1.211 MPTP-HCl: base livre de 1,0 MPTP); a concentração de MPTP-HCl em veículo salino é de 3.633 mg/ml.
    2. Prepare todos os equipamentos, suprimentos e reagentes necessários para a preparação do MPTP e potencial descontaminação de derramamento antes de manusear a neurotoxina.
  4. Remova o frasco de origem MPTP-HCl do local de armazenamento adequado.
    Nota: O MPTP deve ser mantido no RT em um frasco fechado dentro de um contêiner secundário, e armazenado dentro de um gabinete bloqueado, rotulado de "MPTP".
    1. Cobrir as escamas ao redor com almofadas ou toalhas de papel umedecidas com solução de alvejante de 10% para reduzir o risco de pó derramado. Mantenha tecidos e 10% solução de alvejante por perto como precaução.
    2. Utilizando um equilíbrio analítico localizado em um capô de fumaça, pesar 50 mg de MPTP-HCl em frasco de vidro com contenção secundária contendo 10% de tecido encharcado de alvejante. Rotule o frasco de vidro "MPTP" com concentração e data.
    3. Feche o frasco de fonte e limpe o exterior com 10% de alvejante.
  5. Adicione lentamente 13,763 ml salino estéril ao frasco e feche completamente para misturar. (A solução é 3.633mg/ml MPTP-HCl.)
    1. No capô, esterilize cuidadosamente a solução MPTP por filtração usando um filtro de 0,22 μm no frasco de injeção rotulado dentro de um recipiente secundário com tecido encharcado de alvejante de 10%. Limpe qualquer derramamento com tecido encharcado de alvejante.
    2. Descarte cuidadosamente os pontiagudos e o frasco em recipiente de risco biológico devidamente rotulado. Mantenha a solução MPTP em frasco no recipiente secundário com tecido encharcado de alvejante para transporte para sala de procedimento animal.
      Nota: não autoclave solução MPTP para esterilização, pois sua vaporização é um risco de inalação.
  6. Devolva o frasco de origem MPTP para o seu contêiner secundário e coloque no local de armazenamento. Descontaminar espátula, escala analítica e superfície do capô por 10 minutos usando 10% de alvejante.

3. Administração do MPTP

  1. Prepare gaiolas descartáveis com tampas perfuradas de microisolador padrão contendo forros filtrados de poliéster marcados como "MPTP" (menos grade de alimentos de arame), forros descartáveis de gaiola, pelotas de alimentos pré-molhados e hidrogel como fonte de água. Pesar todos os animais e volume recorde de 3 mg/ml MPTP em soro fisiológico necessário para injeção de 15 mg/kg.
    Nota: Os metabólitos MPTP são detectáveis em excreta por 3 dias após a injeção28,29; no entanto, os camundongos excretam o n-óxido MPTP, um derivado não tóxico que não cruza membranas por causa de sua hidrofilicidade30.
    1. Usando todos os EPI listados acima e segurando camundongos sobre uma almofada de absorção descartável, injete solução de ipê-fisiológico ou solução MPTP para dose de 15 mg/kg na cavidade intraperitoneal (i.p.), diariamente por 4 dias com uma seringa de tuberculina descartável de 26 bitolas.
    2. Não recapitula a seringa após o uso; descartar em um recipiente de afiadas bioarzardous MPTP dedicado e rotulado. Mantenha 10% de alvejante e tecidos próximos para limpar quaisquer gotas acidentais.
  2. Coloque animais injetados com MPTP em gaiolas descartáveis, até 5 ratos por gaiola, e abriga em racks abertos. Não utilize racks ventilados.
    1. Coloque os placas MPTP no rack contendo ratos e porta da sala de alojamento até 72 h após a última injeção.
      Nota: certifique-se de que a temperatura do ambiente habitacional esteja entre 22,2 - 24,4oC, pois os camundongos experimentam hipotermia transitória até 12h após a intoxicação por MPTP. 31
    2. Descontaminar a superfície de trabalho com alvejante após cada uso (ver etapa 2.8), descartar a solução mptp restante por adição de um volume equivalente a 10% de alvejante e descartar conteúdos como resíduos líquidos de risco biológico.
    3. Descarte todos os EPI usados em lixeira dedicada. Se necessário, pulverize com 10% de alvejante antes do descarte.
  3. Verifique os animais regularmente e refresque a fonte de alimento e água diariamente durante o paradigma de injeção e 72 horas após a última injeção. Nota: embora não seja prevista contaminação na área imediatamente ao redor do exterior da gaiola, esta região é tratada com a solução alvejante como precaução (conforme descrito na Etapa 2.8). Deve-se tomar cuidado ao manusear todos os ratos e equipamentos durante este período.
    1. Três dias após a última injeção, descarte todas as gaiolas e forros em saco de risco biológico apropriadamente rotulado. Retomar o uso de EPI regular e habitação normal para animais; remover placas de porta e prateleira.

4. Colheita de tecidos

  1. Eutanize os animais por deslocamento cervical 7 dias após a última injeção de MPTP. Dissecar imediatamente o cérebro no gelo usando molde cerebral pré-refrigerado com ranhuras de 1 mm no plano coronal.
  2. Disseque o estriado de uma fatia de cérebro de 2 mm de espessura ao nível da comissura anterior.
    1. Remova as regiões corticais e subcorticais circundantes usando um bisturi. O tecido estriatal de congelamento de snap de cada hemisfério em um tubo de microcentrifuge separado de 1,5 ml para análise neuroquímica ou bioquímica.
  3. Bloqueie o cérebro médio/cérebro traseiro no plano coronal ao nível do hipotálamo anterior e tecido de correção de imersão em solução aquosa de formaldeído de 4%.

5. Processamento de tecidos

  1. Processo de bioquímica
    1. Homogeneize o tecido estriatal de um hemisfério usando um disruptor de células ultrassônicas no tampão de lise tris-EDTA de 200 μL (base tris de 25mM, 1mM EDTA, 1:100 coquetéis inibidores de protease e fosfatase) para 10 pulsos a 10-12 Hz e centrifugados por 10 min a 4oC a 1000xg.
    2. Aspire cuidadosamente o supernasciente e reconstitua a pelota em 150-μl lysis buffer. As frações são utilizadas para análise bioquímica por SDS-PAGE e manchas ocidentais.
      Nota: use tampão contendo protease e fosfatase dentro de 1h de preparação devido à instabilidade em soluções aquosas.
  2. Processo para neuroquímica
    1. Utilize estrias dissecados de outro hemisfério de cada amostra armazenada a -80°C para HPLC. Descongele tecidos estriais em tubos de microfuge no gelo, adicione 500-μl 0,3N de ácido polemérico (PCA) e homogeneize usando sonicator.
      Nota: Para fazer 100 ml de 0,3N PCA, medir 90 ml ddH2O, adicionar a um cilindro graduado de 100 ml, adicionar 2,58 ml de 70% PCA e trazer a marca de 100 ml. Este buffer de amostra pode ser armazenado a 4°C por até um mês.
    2. Tecido striatal sonicato em 500-μl gelado 0.3N PCA, para 10 pulsos a 10-12 Hz e colocar no gelo. Para garantir a homogeneidade, sonicate amostras uma segunda vez por 10 segundos, em seguida, centrífuga para 12 min a 4oC a 16.100xg.
    3. Imediatamente decantante supernascer para tubos de microcentrifuuge de 1,5 ml e armazenar a -80°C. Seque a fração de pelota no capô.
    4. Mantenha o supernatante a -80°C até ser usado para medição de dopamina e seus metabólitos, ácido 3,4-dihidroxifenílacetic (DOPAC) e ácido homovanillic (HVA) pelo HPLC com detecção eletroquímica.
    5. Uma vez seco, reconstitua a fração de pelotas em 0,5N NaOH (500 μL), e sonicar brevemente. Armazene a fração de pelota reconstituída a 4°C até o uso para determinação da proteína total usando o método Lowry.
  3. Processo para imunohistoquímica
    1. A correção de imersão entre cérebros médios e traseiros durante a noite em solução aquosa de formaldeído de 4% e crioproteto em soluções de sacarose classificadas (10% em soro fisiológico tamponado com fosfato (0,01 M PBS; 0,138 M NaCl, 0,0027 M KCl, e ddH2O, pH 7.4) por 24 h, depois 30% em PBS até que o tecido afunde) a 4°C. Borrie brevemente os blocos crioprotegidos para remover o excesso de solução de sacarose, congele em gelo seco e armazene a -80°C até usar.
    2. Seção de microtoma de blocos cerebrais contendo cérebro médio e traseiro em um criostat.
      1. Remova os tecidos de -80°C, equilibre-se a -16°C por 1 h no criostat e monte em mídia de incorporação de tecidos.
      2. Colete seções coronais com 40-μm de espessura em solução crioprotetor (0,01M PBS com 30% de sacarose, 30% de etileno glicol, pH 7,4) a -16°C. Colete tecido em série em tubos de microcentrifuus de 1,5 ml a intervalos de 240-um e armazene a -20°C.

6. Imunoblotting

  1. Determine a concentração de proteínas na fração de supernascetal striatal (preparada conforme descrito na Seção 5.1) pelo ensaio BCA.
  2. Calcular a diluição necessária para que cada amostra produza 10 μg por bem entregue em 20 μl de volume.
  3. Diluir proteína sobrenante com tampão 4X Laemmli e tampão de homogeneização para produzir 10 μg de proteína em 1X solução tampão Laemmli. Cálculo do exemplo:
    1. Determine a concentração final de proteína e volume necessários. Neste caso, é necessário 10 μg em 20 μl (0,5 mg/ml).
    2. Determine o volume final da solução proteica necessária. Embora seja necessário 20 μl para o carregamento, deve-se preparar um volume extra (30 μl).
    3. Uma vez que o volume final e a concentração são conhecidos, e a concentração da fração supernante proteica é conhecida (determinada pelo ensaio BCA), calcule o volume do supernatante proteico exigido pela equação:
      Vsupernante =(Final V x Cfinal)/C supernante
      Assim, para uma concentração de proteína supernante de 1,5 mg/ml,
      Vsupernante = (30 μl x 0,5 mg/ml)/1,5 mg/ml
      Vsupernante = 10 μl
    4. Calcular a quantidade de tampão 4X Laemmli necessário para produzir uma concentração de 1x em 30 μl de volume (30 μl / 4 = 7,5 μl). Nota: O tampão 4X Laemmli deve ser diluído à força de 1X na preparação da amostra.
    5. Calcular a quantidade de tampão de homogeneização necessário para trazer volume para 30 μl (e obter concentração proteica final desejada de 0,5 mg/ml):
    6. Prepare a amostra por vórtice e, em seguida, pipetting 10 μl de proteína supernante em 12,5 μl de tampão de homogeneização. Adicione 7,5 μl de tampão 4X Laemmli para uma solução de trabalho de amostra de 30 μl e concentração de 0,5 mg/ml.
  4. Prepare todas as amostras usando o procedimento descrito, vórtice e fervura por 5 minutos.
    Nota: Use tubos de microcentrifuuge para evitar vazamentos e abertura devido à pressão durante a ebulição.
  5. Depois de 5 min, coloque imediatamente no gelo. Carregar 20 μl de solução de trabalho de amostra por gel bem (10 μg de proteína). Amostras de proteínas separadas por SDS-PAGE em um gel tris-glicina de 12%.
    1. Use uma escada de proteína pré-manchada para confirmação de pesos moleculares. O buffer de execução é de 25 mM Tris-base, 192 mM de gliccina, 0,1% SDS e ddH2O, pH 8.3.
    2. Proteínas separadas por eletroforese: corro em 80 V para limpar os poços (10 min) e 125 V (aproximadamente 1h; até que a escada proteica tenha totalmente separada) para resolver as proteínas.
  6. Realize a transferência de proteína para nitrocelulose usando 0,2 μm de membrana nitrocelulose no buffer de transferência tris-glicina (25 mM Tris, 192 mM de gliccina, 0,04% SDS, 20% metanol e ddH2O, pH 8,3) durante a noite para 40 V a 4°C.
  7. Lave manchas de nitrocelulose em 1x TS (TS; 25mM Tris, 0,9% NaCl em ddH2O, pH 7.4) por 10 min no RT. lncubate em Ponceau S por 5 min e depois enxágue em ddH2O para fornecer uma verificação aproximada de carga de proteína equivalente. Digitalize a imagem para reter o registro do notebook e a destain usando PBS.
    Nota: Alternativamente, lave a mancha em Milli-Q ou ddH2O contendo HCl (0,2%) por aproximadamente 5 min. Procure registro. Remova a mancha Ponceau S da membrana por etapa de incubação subsequente (ou seja, coloque no tampão de bloqueio).
  8. Bloqueie as manchas em 5% de leite em pó sem gordura em TS por 1 h no RT e incubar 24h a 4ºC com hidroxilase anti-tirasina de coelho (1:1000),anti-β-actin(1:200); anti-GFAP (1:1000) em 5% de leite-TS.
  9. Lave as manchas 3 x 5 min em TS com 0,05% Tween-20 e 1 x 5 min em TS, depois incubar em anticorpo secundário conjugado pelo HRP (1:5000 em TS contendo 5% de leite), combinado com a espécie do primário, por 2 h na RT.
  10. Prepare o substrato chemiluminescente usando volumes iguais de soluções de luminol e peróxido e aplique por 1-3 min. Em uma sala escura, coloque a mancha em uma manga plástica para exposição cinematográfica e exponha ao filme; o filme é então desenvolvido usando um processador automático.
  11. Retire manchas com tampão de descascamento comercialmente disponível a 37°C por 30 min, lave 3x 10 min em TS com 0,05% Tween-20, e 1x 10 min em TS e depois repúdio para controle de carga ou outra proteína de interesse.
  12. Quantifique os sinais pelo software Image J para medições de densidade óptica e normalize-se ao controle de carregamento interno β–actin.

7. Neuroquímica

  1. O tecido para análise é preparado conforme descrito acima na Seção 5.2. Consulte a Tabela 1 para receita de fase móvel.
    Nota: Todos os reagentes devem ser ≥99,0% puros e de grau HPLC. Certifique-se de integridade do buffer com vidros limpos e dedicados e barras de mexida. O buffer de fase móvel deve ser utilizado dentro de sete dias após a preparação.
    1. Pesar o fosfato de dihidrogênio e ácido cítrico, adicionar 1 L de ddH2O e misturar em um cilindro graduado em 2-L. Filtre a solução através de uma membrana GSTF de 0,22-μm.
      Nota: Isso maximiza a extração de contaminantes no fosfato e ácido cítrico, o que ajuda a minimizar as correntes de fundo.
    2. Adicione o OSA seguido da solução acetonitrila e EDTA. Adicione HPLC grau ddH2O a aproximadamente 1900 ml antes de ajustar o pH para 3.0 com ácido fosfórico.
    3. Adicione HPLC grau ddH2O à marca 2-L e, em seguida, despeje em um frasco de 2-L. Adicione uma barra de mexiça dedicada e desgase a fase móvel, mexendo-a sob vácuo por > 10 minutos.
  2. Prepare os padrões para dopamina, e DOPAC e HVA para curvas padrão. As soluções de estoque de normas são preparadas a 1 mg/ml em 0,3 N PCA.
    1. Pesar 12,4 mg de dopamina-HCl, e adicionar 10,0 ml de 0,3 N PCA para fazer 1 mg/ml de dopamina.
    2. Pesar 10,0 mgs de DOPAC e adicionar 10,0 ml de 0,3 N PCA para fazer 1 mg/ml DOPAC.
    3. Pesar 10,0 mg HVA, e adicionar 10,0 ml de 0,3 N PCA para fazer 1 mg/ml HVA.
  3. Prepare soluções padrão de trabalho a partir das soluções de estoque. Padrões de cinco pontos são usados para gerar uma curva de concentração.
    1. Para medição da dopamina striatal, prepare concentrações padrão de 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml e 200 ng/ml.
    2. Para o DOPAC striatal, prepare-se concentrações padrão de 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml e 40 ng/ml.
    3. Para o Striatal HVA, prepare-se concentrações padrão de 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml e 80 ng/ml.
    4. Gerar padrões de cinco pontos: diluir a solução de estoque de dopamina de 1 mg/ml para 5 μg/ml usando 0,3N PCA. Diluir 1 mg/ml solução de estoque DOPAC para 1 μg/ml usando 0,3N PCA, e diluir 1 mg/ml solução de estoque HVA para 2 μg/ml usando 0,3N PCA.
    5. Transfira 1 ml de 5 μg/ml de dopamina, 1 ml de 1 μg/ml DOPAC e 1 ml de 2 μg/ml HVA em um frasco volutrico de 25 ml e leve o volume para a marca de 25 ml com PCA de 0,3 N.
      Nota: Os padrões mistos no frasco volumoso contêm a maior concentração dos padrões de cinco pontos: 200 ng/ml de dopamina, 40 ng/ml de DOPAC e 80 ng/ml de HVA.
    6. Transfira 1 ml dos padrões mistos em tubos de microcentrifusagem limpos de 1,5 ml. Realize a diluição seriada 1:1 quatro vezes para gerar os padrões subsequentes de quatro pontos.
      1. Por exemplo, a 250 μl dos padrões mistos, adicione 250 μl de tampão de amostra e vórtice completamente para produzir padrões mistos em 50% das concentrações originais; processo de repetição até que as diluições desejadas sejam alcançadas.
  4. Prepare o sistema HPLC (bomba, autosampler, coluna de fase reversa (C18, 150×3,2 mm, 3 μm)). Limpe a bomba com fase móvel fresca para substituir todas as soluções anteriores no sistema HPLC e bolhas de ar presas com fase móvel fresca. Esfrie o autosampler a 4°C. Aqueça a coluna a 35°C, o que reduz a pressão total.
    1. Coloque a tensão em -150 mV e 220 mV para o primeiro e segundo eletrodos do detector eletroquímico, respectivamente. Equilibre o sistema por pelo menos 2h, e idealmente durante a noite, com a fase móvel a uma vazão de 0,2 ml/min.
      Nota: Durante o equilíbrio, as células devem estar em e a leitura da linha de base monitorada. A leitura estável indica que o sistema está pronto para uso. Durante as duas horas da fase de equilíbrio, permita que a fase móvel entre em um recipiente de resíduos em vez de recircula-lo. Após esse período, a fase móvel pode ser reciclada durante a noite para o equilíbrio.
    2. Uma vez que o equilíbrio esteja concluído, ajuste a taxa de fluxo de fase móvel para 0,6 ml/min. Injete 20 μl de cada um dos padrões de cinco pontos.
  5. Descongele amostras estriais no gelo e injete 2 x 20 μl de cada amostra no sistema HPLC. Utilize padrões no início e aleatoriamente em cada conjunto de amostras estriais.
  6. Use o software para analisar a área sob picos de dopamina, DOPAC e HVA produzidos pelos padrões e amostras. Identifique analitos por tempo de retenção e meça comparando a área abaixo do pico com a curva de 5 pontos para seu padrão correspondente.
  7. Prepare a fração de pelotização conforme descrito na Seção 5.2.3. Realize um ensaio de proteína Lowry na pelota striatal. Nota: Este ensaio irá medir a quantidade de proteína presente nas amostras estriais em mg/ml; essas informações são usadas para determinar a concentração de ng/mg de analito.

8. Imunohistoquímica

  1. Imunofluorescência dupla GFAP/TH
    1. Remova os tubos que contenham cérebro médio seccionado a partir de -20°C congelador e leve para RT. Remova seções de tecido contendo nigra substantia da solução criopreservadora em uma bandeja contendo PBS.
    2. Coloque seções de tecido em pastilhas de poliestireno com fundo de malha de poliéster para imunoquímica flutuante livre. Lave 3 x 5 min em PBS.
    3. Transferir seções para placa de 96 poços com solução de bloco de 180 μl (soro de burro normal de 5%, 1% PVP, 1% BSA e 0,3% Triton X-100 em PBS) em cada poço. Incubar 40 min na RT.
      Nota: Todas as etapas de lavagem e incubação são realizadas com agitação leve no shaker.
    4. Transferir seções para poços que contenham a solução de anticorpos primários (180 μl por poço). Incubar em coquetel de anticorpos primários, anti-GFAP de coelho (1:1000) e anti-TH de ovelhas (1:400) diluídos na PBS com 1% de BSA e 0,3% TX-100, para 24 h a 4°C. O IG da espécie primária serve como o controle negativo de imunossuagem.
    5. Incubar em coquetel de anticorpos secundários (1:200 burro anti-coelho 568 e 1:200 FITC burro anti-ovelhas na PBS com 0,1% TX-100). Use papel alumínio para proteger a solução da luz durante a preparação e incubação; incubar na RT por 2 h.
      1. Para um controle negativo, incubar seções em IgG da espécie primária diluídas para a mesma concentração usada para os anticorpos primários.
      2. Lave 2 x PBS e 1 x TS por 5 min cada no RT. Monte seções de tecido em mais lâminas em meio de montagem com mancha hoechst e deslizamento de tampa.
    6. Incubar em coquetel de anticorpos secundários (1:200 burro anti-coelho 568 e 1:200 FITC burro anti-ovelhas na PBS com 0,1% TX-100). Use papel alumínio para proteger a solução da luz durante a preparação e incubação; incubar na RT por 2 h.
    7. Lave 2 x PBS e 1 x TS por 5 min cada no RT. Monte seções de tecido em mais lâminas em meio de montagem com mancha hoechst e deslizamento de tampa.
    8. Proteja os slides da luz e da oxidação até que a imagem esteja armazenada em uma caixa de slides a 4°C.
    9. Analise o controle negativo primeiro para determinar o nível de fundo da fluorescência e, em seguida, avalie a imunoreatividade positiva usando microscopia fluorescente.
  2. Imunohistoquímica Iba1 com precipitação cromagena
    1. Remova os tubos que contenham cérebro médio seccionado a partir de -20°C congelador e leve para RT. Remova seções de tecido contendo nigra substantia da solução criopreservadora em uma bandeja contendo PBS.
    2. Coloque seções de tecido em pastilhas de poliestireno para imunoquímica flutuante livre. Lave as seções 3 x 5 min em PBS, e coloque seções diretamente em placa de 12 poços contendo monohidrato de ácido cítrico pré-aquecido de 10 mM, pH 9,0, 80°C por 30 min, para recuperação de epítope.
    3. Placa fria 20 min no RT. Volte as seções para as pastilhas e lave 3 x 5 min em PBS.
    4. Transfira seções para placa de 96 poços contendo solução de bloqueio de 180 μl (soro de cabra 10% normal, 1% BSA em PBS) por poço e incubar 40 min na RT.
    5. Transferir seções para poços contendo anticorpo primário diluído de 180-μl (1:1000 em 1% BSA-PBS). Incubar durante a noite a 4°C.
    6. Transfira seções para inserções. Lave 3 x 5 min PBS e aplique anticorpo secundário biotinilado (1:200 em soro-PBS normal) de 1,5% para 1 h na RT.
    7. Prepare a solução ABC 30 min antes de usar. Lave 3 x 5 min PBS e transfira para a solução ABC por 1 h na RT.
    8. Prepare a solução DAB no capô. Lave 2x 5 min em PBS e 1x 5 min em TS, e incuba seções em DAB.
      1. Desenvolva para 3-4 min. O controle negativo deve permanecer claro na cor.
        Nota: realize esta etapa no capô da fumaça, pois o DAB é um cancerígeno conhecido. Uma solução de permanganato de potássio de 0,2M em ddH2O para descontaminação deve ser mantida nas proximidades em caso de gotejamentos acidentais.
    9. Enxágüe brevemente em ddH2O, depois em TS 3 x 5 min. Monte seções em mais slides e ar seco durante a noite no capô da fumaça.
    10. Descontaminar resíduos DAB com um volume igual de 0,2M permanganato de potássio em ddH2O, vórtice e incubar em um capô de fumaça durante a noite antes de armazenar em lixeiras DAB apropriadamente rotuladas na capa de fumaça.
      Nota: A solução alvejante não elimina as propriedades mutagênicas do DAB.
      1. Descontaminar itens a serem reutilizados (ou seja, inserções de poliestireno) e lavar com detergente.
    11. Desidratar/contrastain levemente com violeta cresyl (CV). Todas as etapas de desidratação/lavagem são 3 min: etanol 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV (30 segundos), ddH20 x 2, 95% etanol + ácido acético glacial (0,1%) x 2, 100% etanol, e xileno.
    12. Tampaslip em distilrene-toluene-xileno montagem média e seca em capô de fumaça.
    13. Observe a imunoreatividade positiva por um microscópio leve. O IG da espécie primária serve como o controle negativo de imunossuagem.

9. Estatísticas

  1. Avalie as diferenças entre os meios por meio da análise unidirecional de variância (ANOVA) para comparar diferenças entre genótipo e ANOVA bidirecional para comparar diferenças entre genótipo e tratamento toxicante. Utilize a análise pós-hoc do HSD de Tukey quando as diferenças são observadas pelos testes ANOVA (p≤0,05).
    Nota: os experimentos (com n = 6-9 ratos/grupo) são realizados no mínimo duas vezes para garantir a reprodutibilidade.

Resultados

Este paradigma de exposição à toxina pode produzir um esgotamento significativo e detectável de dopamina 20% em animais injetados por MPTP vs. soro fisiológico. É importante notar que diferentes lotes de MPTP podem produzir um pouco mais ou menos lesões; assim, para uma melhor precisão, recomenda-se um experimento preliminar em camundongos de tipo selvagem antes do uso em transgênicos quando um novo lote de neurotoxina é utilizado. O uso de lesões leves a moderadas permite observar o impacto do transgene; uma...

Discussão

O projeto deste estudo de interação gene-ambiente nos permitiu obter novas informações sobre a dupla natureza da isozyme 5-LOX na via nigrostriatal. Ao realizar o HPLC para medir as monoaminas estriais após o tratamento salino ou MPTP em transgênicos sem a isozice de 5-LOX e seus ninhadas de tipo selvagem, pudemos notar que sua deficiência parece ser protetora em condições tóxicas(Figura 1),mas em condições normais, a falta da enzima reduz os níveis de dopamina striatal e pode ser deletéri...

Divulgações

Não há nada para revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde NIGMS 056062.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL)Sigma-AldrichM0896for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA)American MasterTech ScientificBUP0157for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA)Sigma-Aldrich244252for HPLC acid extraction
Tris BaseSigma-AldrichT1503for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE1644for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktailSigma-AldrichP5726for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH)Sigma-AldrichS5881for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) Sigma-AldrichS0389for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS)Sigma-AldrichP3813for IHC
BCA Protein Assay KitPierce/Thermo23225for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-wellInvitrogen/Life TechnologiesEC60052BOXfor SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Invitrogen/Life TechnologiesNP0007for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard Invitrogen/Life TechnologiesLC5800protein ladder
GlycineSigma-AldrichG7126for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS)Sigma-AldrichL3771for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent American MasterTech ScientificSPM1057Cmethanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagentSigma-AldrichS9888saline and buffers
Nonfat dry milk powderCarnationn/afor immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid Sigma-AldrichP7170for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonalChemicon/MilliporeAB1542for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonalPel-Freez BiologicalsP40101-0for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbitSigma-AldrichA2066for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonalChemicon/MilliporeAB5804for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonalCovance Inc.SMI-22Rfor immunoblotting
Tween-20Sigma-AldrichP1379for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated Fisher Scientific31462for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugatedPierce/Thermo31480for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugatedPierce/Thermo31430for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstratePierce/Thermo34078for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in Pierce/Thermo34089for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer Pierce/Thermo21059for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% Sigma-AldrichC1909for IHC
Normal Donkey SerumMilliporeS30-100MLfor IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP)Sigma-AldrichP5288for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilizedSigma-AldrichA3294for IHC
Triton X-100Fisher ScientificBP151-01for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled Invitrogen/Life TechnologiesA10042for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC Jackson ImmunoResearch713-095-147for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1500for IHC
Normal Goat SerumMilliporeS26-100MLfor IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) Vector LaboratoriesPK-4001for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidineVector LaboratoriesSK-4100for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30%Sigma-Aldrich216763for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1Biocare MedicalsCP290Afor IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength FD NeurotechnologiesPS102-01counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcoholSigma-AldrichR8382dehydration for IHC
100% Absolute ethanolMallinckrodt7019-10dehydration for IHC
Acetic acidSigma-AldrichA6283destaining for IHC
XyleneSigma-Aldrich534056clearing agent for IHC
DPX MountantSigma-Aldrich06522mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium American MasterTech ScientificEMOCTCSembeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganateSigma-Aldrich223468to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochlorideSigma-AldrichH8502for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC)Sigma-Aldrich850217for HPLC
Homovanillic acid (HVA)Sigma-AldrichH1252for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70%Sigma-Aldrich244252for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateSigma-Aldrich71504for HPLC
Citric acid monohydrateSigma-AldrichC1909for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA)Sigma-AldrichO8380for HPLC
EDTASigma-AldrichE1644for HPLC
AcetonitrileEMDAX0145-1for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O)Milliporefor HPLC
0.22 µm GSTF membraneMilliporefor filtration
Corning NetwellsSigma-AldrichCLS3477polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150)MSEMSE.41371.274
MicrocentrifugeEppendorf5414R
ESA MD-150 reverse-phase column ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000)DionexISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000)DionexWPS-3000TSL
Electrochemical detectorESACoulochem III
Guard CellESA5020
Analytical CellESA5011A
Chromeleon softwareDionex
Eclipse E400NikonE400light/fluorescent microscope
Disposable mouse cageAncareN10HT
Microfilter topAncareN10MBT
5-LOX- deficient miceThe Jackson Laboratory004155
12/15-LOX-deficient miceThe Jackson Laboratory002778

Referências

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