Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

Riepilogo

Leucociti assunzioni al fegato avviene nei canali specializzati delle sinusoidi epatici che sono rivestite da cellule endoteliali sinusoidali epatiche uniche. Fase microscopio a contrasto di reclutamento dei leucociti attraverso l'endotelio sinusoidale epatico umano in condizioni di shear stress fisiologico può facilitare la delucidazione dei meccanismi molecolari che sono alla base di questo processo.

Abstract

Leucocyte infiltrazione nel tessuto epatico umano è un processo comune a tutte le malattie epatiche infiammatorie adulti. Infiltrazione cronica può guidare lo sviluppo di fibrosi e la progressione a cirrosi. La comprensione dei meccanismi molecolari che mediano il reclutamento dei leucociti al fegato ha potuto identificare importanti bersagli terapeutici per le malattie del fegato. L'interazione tasto durante leucociti reclutamento è quella delle cellule infiammatorie con endotelio in condizioni di sforzo di taglio. Assunzioni al fegato si verifica entro le basse canali taglio delle sinusoidi epatici che sono allineati dalle cellule epatiche endoteliali sinusoidali (HSEC). Le condizioni all'interno dei sinusoidi epatici possono essere riepilogati mediante perfusione leucociti attraverso i canali fiancheggiati da monostrati HSEC umani a portate specifiche. In queste condizioni leucociti sottoposte ad un breve passo tethering seguita da attivazione e adesione stabile, seguita da una fase di scansione e successiva trasmigrazione di tutti i endotelialestrato. Utilizzando la microscopia a contrasto di fase, ogni passo di questa 'cascata adesione' può essere visualizzato e registrato seguita da analisi offline. Cellule endoteliali o leucociti possono essere pretrattate con inibitori per determinare il ruolo di molecole specifiche durante questo processo.

Introduzione

E 'ormai accertato che il reclutamento dei leucociti, in generale, segue il paradigma della cascata adesione multistep ^1. Ciò comporta la cattura di leucociti dal sangue che scorre dalle cellule endoteliali che rivestono la parete del vaso. Inizialmente, leucociti subiscono una fase di laminazione che è mediata da recettori selectina o membri della superfamiglia delle immunoglobuline. Questo permette recettori accoppiati alle proteine ​​G (GPCR) espressi sulla superficie dei leucociti essere attivata da chemochine presentate sul glicocalice endoteliale. Questo porta all'alterazione della conferma integrina ad uno stato 'alta affinità' sulla superficie dei leucociti e arrestare e ferma adesione all'endotelio. Ferma adesione è seguito da cambiamento di forma e scansione della leucocitaria sulla nave. Il passo finale è trasmigrazione attraverso il monostrato endoteliale, che può avvenire tramite paracellulare o transcellulare aeree.

Mentre la cascata adesione multistep descriveres il meccanismo generale di leucociti assunzioni all'interno del corpo ci sono differenze specifiche organo. Nel fegato la maggior parte dei leucociti assunzione avviene entro i sinusoidi epatici a differenza di altri organi dove il reclutamento avviene generalmente all'interno delle venule post-capillari ^2. Le sinusoidi epatici sono un ambiente a basso taglio e leucociti sottoposte ad un breve passo tethering prima di consolidare l'adesione che è selectina indipendenti ^2. Questi canali sono rivestite da endotelio sinusoidale epatica che è discontinuo e contiene Fenestrae, pori aperti 100-200 nm di diametro, e mancano di una membrana basale ^3. Chiarire i meccanismi molecolari che mediano il reclutamento dei leucociti attraverso l'endotelio sinusoidale epatico umano potrebbe identificare organo specifici bersagli terapeutici per le malattie del fegato infiammatorie.

Saggi di adesione di flusso sono strumenti essenziali nello studio leucocitaria assunzioni. Essi consentono la ricostruzione di leucociti recruitment in presenza di shear stress per analizzare l'adesione in forze ben definite. L'uso più frequente per il saggio è lo studio dei leucociti adesione a monostrati endoteliali o substrati purificati. Camere di flusso commercialmente disponibili sono utilizzati per perfusione cellule in condizioni di flusso laminare tra due superfici piane e poi visualizzare il processo dinamico di adesione su un microscopio ^4. Gruppi precedenti hanno dimostrato che alcune interazioni adesive avvengono solo sotto il flusso e non possono essere studiata in saggi statici ^5,6.

Abbiamo utilizzato questa tecnica per ricapitolare i sinusoidi epatici e studiare il reclutamento dei leucociti in condizioni di bassa tensione di taglio. Primario HSEC umano sono coltivate in microslides e leucociti può essere perfuso su questo monostrato ad una velocità di portata calcolata di riprodurre lo sforzo di taglio entro sinusoidi epatici. Lo sforzo di taglio è una sollecitazione che viene applicata parallela o tangente ad una superficie come opposed a sforzo normale, che è perpendicolare. Qualsiasi fluido che si muove lungo un confine eserciterà una sollecitazione di taglio su quel confine. Shear stress ha dimostrato di essere una componente essenziale di linfociti trasmigrazione ^7. In queste condizioni ogni passo della cascata adesione può essere visualizzato mediante microscopia a contrasto di fase. Questo metodo ha permesso importanti conoscenze sulla reclutamento di leucociti all'interno del fegato compreso lo studio di molecole di adesione convenzionali ^8, il ruolo delle chemochine e recettori per chemochine ^9-11, e molecole di adesione atipici quali l'adesione vascolare proteina-1 (VAP-1 ) ^8,12 e linfatica e vascolare endoteliale comune recettore-1 (CLEVER-1) ^13. Anche questo test è stato citato in diverse pubblicazioni del nostro gruppo, la sua descrizione è stata breve e ci hanno colto questa opportunità per fornire una dettagliata passo passo guida per aiutare nella risoluzione dei problemi e prevenire errori tecnici durante il tentativozione del test. Inoltre, abbiamo recentemente cambiato il reperimento delle camere MicroSlide che permette alterazioni accurati shear stress. Crediamo che questo allarga l'applicabilità del test ad altre cellule endoteliali e immunitarie. Il seguente metodo descrive la preparazione e la tecnica per la realizzazione di un saggio di adesione flusso based con cellule endoteliali sinusoidali epatiche umane e linfociti del sangue periferico.

Protocollo

1. MicroSlide Preparazione

1. Prerivestimento un MicroSlide sei canali con coda di ratto collagene di tipo I (RTC, diluito in PBS 1:100 dare una diluizione di lavoro di 220 mcg / ml). Questo viene effettuato iniettando 30 ml di soluzione diluita RTC direttamente nei canali e incubare per 2 ore a 37 ° C, seguita da tre lavaggi con PBS.

2. Cellule semina in Microslides

1. Dissociare una fiasca T75 confluenti di cellule epatiche umane coltivate sinusoidali endoteliali (HSEC) (isolato da tessuto epatico come descritto in precedenza ¹³⁾ in tripsina-EDTA, lavate in PBS e risospendere a 3 x 10 ⁶ cellule / ml in mezzi completi (endoteliali umane terreni di base integrate con 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina e la streptomicina 100μg/ml, siero umano il 10% inattivato al calore AB, di 10 ng / ml di fattore di crescita vascolare endoteliale e 10 ng / ml di fattore di crescita degli epatociti). Iniettare 30 ml di sospensione cellulare terribilictly in ciascun canale.
2. Lascia cellule di aderire per 1 h in un incubatore umidificato a 37 ° C con CO ₂ nell'atmosfera 5% su un rack scorrevole. Dopo permettendo alle cellule di aderire riempire le porte su entrambi i lati di ciascun canale con mezzo completo (Figura 1).

3. Citochina stimolazione delle cellule

1. Lasciare le cellule in incubatore per 24 ore. Valutare la crescita delle cellule utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito. 24 ore prima del dosaggio adesione, stimolare i monostrati endoteliali con citochine sostituendo il materiale di crescita con mezzi completi integrati da fattore di necrosi tumorale alfa e interferone gamma, sia a 10 ng / ml.

4. Isolamento di sangue periferico linfociti

1. Isolare linfociti del sangue periferico di sangue intero purificando inizialmente la frazione mononucleare dal gradiente di densità centrifugazione su un supporto di centrifugazione separazione cellulare appropriato per 25 min a 800x g. Incubare le cellule in plastica per 1 ora per consentire l'adesione dei monociti.
2. Dopo l'adesione ad aspirare plastica linfociti arricchito surnatante. Lavare i linfociti e risospendere loro (tipicamente 1 x 10 ⁶ cellule / ml in mezzo di flusso (terreni di base endoteliali contenenti 0,1% (v / v) di albumina di siero bovino (BSA)).

5. Il pretrattamento di endotelio o leucociti con inibitori

1. Preparare diluizioni raccomandate di anticorpi funzionali bloccare o piccole molecole inibitrici a endoteliale media/0.1% (v / v) BSA. Sostituire terreno completo con soluzione bloccante anticorpo / inibitore in canale MicroSlide scelto 30 min prima di fluire dosaggio.
2. Dove sono previsti pretrattamento di recettori per chemochine sui linfociti, risospendere leucociti isolati in soluzione RPMI contenente 0,1% (v / v) BSA e incubare con 200 ng / ml di tossina della pertosse per bloccare G-proteina recettore accoppiato attività di recettori per chemochine, in alternativa diluire specifico funzioneanticorpi bloccanti o piccole molecole inibitrici di recettori per chemochine alla diluizione raccomandata. Incubare leucociti a 37 ° C per 30 minuti, poi lavare e risospendere in mezzo flusso.

6. Impostazione del flusso sistema di test

1. Preriscaldare una camera di controllo termostatico trasparente a 37 ° C. La camera deve avere porte per l'inserimento del tubo in silicone e fornitura elettronico per un'elettrovalvola elettronico che consente la commutazione tra le cellule e media praticamente senza volume morto. La camera è montata su un microscopio invertito per consentire microscopio a contrasto di fase. Figura 2 illustra la camera di dosaggio flusso e microscopio e MicroSlide posto sul palco microscopio.
2. PreFill una siringa di vetro da 50 ml con un luer lock con 10 ml di acqua distillata sterile e inserire un pezzo di tubo in silicone 25 cm a porta siringa. Inserire in una pompa a siringa. Alterare il tasso di ritiro della pompa siringa seguendoistruzioni del produttore MicroSlide per mantenere una sollecitazione di taglio di 0,05 Pa (0,5 dyne / cm ^2, Figura 3).
3. Prendete due siringhe da 5 ml, scartare gli stantuffi e allegare i barili alle due porte nel flusso di una valvola a solenoide elettronica utilizzando tubi in silicone.
   1. Attaccare 12 cm di tubi in silicone alla valvola out-flow. La valvola permette alternanza tra un buffer cella lavaggio (endoteliale media/0.1% (v / v) BSA) e la sospensione linfocitaria.
   2. Lavare l'elettrovalvola elettronica inserendo il tampone di lavaggio sia in siringhe e garantendo tampone fluisce da un barile attraverso la valvola e nel tubo di silicone out-flow.
   3. Con l'interruttore valvola di alternare all'altra canna e garantire il buffer è scorrevole e che tutte le bolle vengono rimossi dal sistema. Rimuovere il tampone di lavaggio da una delle canne e sostituire con linfociti sospensione Figura 4a.
4. Collegare il Tubin siliconeg dalla pompa siringa ad una porta di un canale MicroSlide scelto tramite un adattatore MicroSlide. Quindi collegare il tubo di silicone dalla valvola di scarico alla porta opposta tramite un adattatore MicroSlide. Assicurarsi che il tubo in silicone e gli adattatori sono riempiti con tampone di lavaggio prima della connessione per evitare bolle d'aria che entra nel sistema (Figura 4b).
5. Una volta collegato al sistema di flusso, posizionare il MicroSlide sul palco microscopio e fissare con fermagli o nastro adesivo per impedire il movimento. Impostare il microscopio per l'obiettivo 10X con l'impostazione della fase appropriata. Assicurarsi che il monostrato endoteliale viene visualizzato e messa a fuoco utilizzando la lente oculare. Garantire immagini possono essere catturate tramite una telecamera che è attaccato al microscopio per cui le immagini possono essere inoltrati ad un monitor e registrate.

7. Flusso Tecnica Tenore e registrazione di adesione per l'analisi

1. Profumato strato endoteliale con tampone di lavaggio per 2 minuti per iniziare withdrawal della pompa a siringa per rimuovere eventuali detriti o anticorpo non legato blocco e quindi passare la valvola per permettere un 5 min bolo di soluzione di leucociti in un costante sforzi di taglio di 0,05 Pa.
2. Durante gli ultimi 2 min del bolo leucocitaria, registrare 10 campi casuali lungo la lunghezza del MicroSlide. Ciò consente l'analisi offline di linfociti rotolamento / tethering sul monostrato endoteliale. Registrare ogni campo per circa 10 secondi prima di passare alla successiva e garantire che le registrazioni vengono effettuate contro la direzione del flusso per evitare di registrare la stessa cella di laminazione due volte in rapida successione.
3. Seguire la bolo leucociti con un 5 min bolo di tampone di lavaggio restituendo la valvola nella sua posizione iniziale. Nella finale 2 min di questa bolo effettuare una seconda fase di registrazione scegliendo almeno 10 campi scelti a caso lungo la lunghezza del MicroSlide. Registrare ogni campo per circa 5 secondi prima di passare alla successiva e assicurarsi che il monostrato endoteliale e leucoc aderentiytes sono in chiaro focus. Questo consente l'analisi offline del pattern di aderenza.

Risultati

Questa analisi ha la capacità di visualizzare il multistep cascata adesione flusso e chiarire i meccanismi molecolari alla base confrontando i risultati di esperimenti di controllo a quelli con inibitori molecolari. I vari letti vascolari possono essere riepilogati incorporando cellule endoteliali specifiche e alterando le condizioni di stress di taglio.

Ogni passo della cascata di adesione può essere analizzato non in linea seguendo il metodo di registrazione descritto nel protocollo. Il primo passo della cascata adesione è il rotolamento dei leucociti che possono essere espresse come percentuale di cellule aderenti totali. Analisi offline consente al numero di cellule aderenti da enumerare in ogni campo registrato durante il bolo leucocitaria. La riproduzione delle immagini permette il confronto delle cellule che sono saldamente aderenti e quelli che stanno subendo un moto di rollio attraverso l'endotelio. Rollio può essere visualizzato utilizzando questa tecnica, ogni campo viene registrata per almeno 10 sec. Cellule rotolamento sono identificati dal loro velocità ridotta sulla superficie endoteliale rispetto a fluire cellule. Questo comportamento deve essere dimostrata per almeno 5 secondi, senza distacco. La cascata di adesione entro i sinusoidi epatici si svolge in un ambiente a basso taglio e studi in vivo hanno confermato di rotolamento minimo con solo un breve passo tethering. Abbiamo confermato che il saggio flusso riflette l'ambiente dei sinusoidi epatici dimostrando che meno del 10% di leucociti aderenti persistentemente rotolare stimolato HSEC in questi saggi.

Il passo successivo della cascata adesione è ferma adesione. Aderenza totale può essere calcolato dalla seconda fase di registrazione durante il bolo tampone di lavaggio (passo 7.3). Analisi offline consente al numero totale di cellule saldamente aderenti da contare in ogni campo (Figura 5). Cellule saldamente aderenti sono definiti come cellule che sono fermi o shapechanged con un comportamento scansione lenta.Il numero medio di cellule per campo può quindi essere calcolato. Questo dato può essere utilizzato, in combinazione con la superficie totale del campo visivo (determinata secondo un reticolo o equivalente), concentrazione di linfociti (tipicamente 1 x 10 ⁶ cellule / ml) e la portata per esprimere la misura di linfociti aderenza come cellule aderenti / mm ^{2/10 6} cellule perfuso.

Studiando il modello di adesione prevede l'analisi degli ultimi due gradini della cascata di adesione compresa la forma-cambiamento, strisciando e migrazione transendoteliale. Leucociti aderenti alla superficie superiore del monostrato HSEC appaiono fase-luminoso mentre quelli che sono migrati attraverso il monostrato appare fase di buio (Figura 6). Le cellule possono quindi essere classificati come espositrici adesione 'statica' (nonmigrated / anno), 'forma-cambiato' morfologia o come 'migrato' e le singole categorie sono poi espressi come percentuale delpopolazione totale adesivo.

Figura 1. Monostrato di cellule endoteliali epatiche primarie umane sinusoidali all'interno della camera di flusso. A) Microslides riempito con supporti contenenti monostrato di cellule endoteliali prima dell'inizio del flusso adesione saggio. B) fase di contrasto immagine confluenti monostrato endoteliale, cellule endoteliali dovrebbero essere seminate in MicroSlide che sono stati prerivestita (per le cellule endoteliali epatiche umane può essere eseguito un Tipo di coda di topo collagene 1) ed è essenziale che le cellule endoteliali sono sani di cultura e confluenti. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2. Fluire camera di dosaggio. Una camera di dosaggio flusso set-up può essere visto qui, si compone di una camera trasparente che è montato su un microscopio invertito. Un riscaldatore è posta nella camera e deve essere controllata termostaticamente per mantenere una temperatura di 37 ° C. Dovrebbe esserci porte disponibili per collegare tubi in silicone da un MicroSlide all'interno della camera ad una pompa a siringa che si trova all'esterno. Il MicroSlide viene posizionato direttamente sul palco microscopio. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3. Pompa a siringa. Una pompa a siringa è collegataEd tramite tubi in silicone alla camera di flusso. La pompa è impostata su un tasso di ritiro specifico a seconda della sollecitazione di taglio desiderata necessaria per il test. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 4. Valvola di collegamento a fluire da camera. A) Una valvola a solenoide elettronico permette la commutazione tra due siringhe contenenti sia cellule o supporti praticamente senza spazio morto. B) Una volta che la valvola è arrossato e le due canne sono istituiti, il tubo di silicone dalla valvola è collegato alla camera di flusso. E 'fondamentale che quando si collega l'adattatore sul tubo in silicone alla porta della camera di flusso vi è una interfaccia liquido / liquido. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 5. Misurazione del totale adesione leucocitaria. Durante gli ultimi due minuti del bolo fase di tampone di lavaggio (come delineato nel protocollo), un minimo di dieci campi aleatori deve essere registrata. Questi possono essere analizzati off-line e il numero totale di cellule saldamente aderenti si contano in ogni campo. Totale adesione dei leucociti può essere paragonato tra le camere di controllo e quelli pretrattati con anticorpi bloccanti, qui vi mostriamo un campo rappresentante di un vetrino di controllo e uno scivolo pretrattato con adesione intracellulare molecule-1 (ICAM-1) anticorpo bloccante. Le frecce sono state aggiunte per evidenziare i leucociti aderenti, nella rappresentazionetiva campo dal vetrino di controllo vi sono un totale di 25 leucociti identificati e nel ICAM-1 pattino ci sono un totale di 13 leucociti identificati. Barre di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 6. Analisi del modello di adesione leucocitaria su monostrati endoteliali mediante microscopia a contrasto di fase. Analisi offline campi registrati può anche essere usato per studiare la direzione e la velocità di adesione leucocitaria. Passaggi specifici della cascata di adesione possono essere visualizzati e quantificati con l'imaging a contrasto di fase. Fase cellule brillanti che sono saldamente aderenti ma non attivato può essere definito l'adesione 'round', le cellule che sono activated e la fase luminosa può essere definito 'cambiato forma' e le cellule che sono fase oscura sono le cellule che hanno subito migrazioni transendoteliale e possono essere chiamati 'migrazione'. L'immagine mostra esempi di ogni modello di adesione. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Discussione

La fase più critica per eseguire con successo un saggio di flusso è garantire che un monostrato sano e confluenti di cellule endoteliali è pronto prima del test di adesione flusso. Cellule endoteliali primarie possono essere difficili da cultura e sensibile alle alterazioni nei metodi di coltura. E 'importante che 1) camere di flusso vengono adeguatamente e uniformemente rivestite con cellule endoteliali in un monostrato, per HSEC usiamo ratto tipo coda collagene I ma può variare per altre popolazioni endoteliali, 2) terreno di coltura appropriato per il tipo di cellula, per HSEC abbiamo descritto il terreno completo nella sezione del protocollo. Altri passi fondamentali sono l'impostazione della pompa a siringa al tasso appropriato per riflettere i livelli fisiologici di shear stress.

Durante il saggio di flusso è necessario evitare bolle d'aria all'interno del circuito di flusso che possono danneggiare il monostrato endoteliale o nastri cellule immuni dalla superficie endoteliale. Ciò può essere evitato ensuring che tutti i tubi silicone e adattatori sono perfusi con tampone di lavaggio prima della connessione, che tutte le bolle d'aria vengono rimosse e che i media sono preriscaldata prima dell'uso. Nel collegare gli adattatori per porte sul MicroSlide è molto importante che vi è una interfaccia liquido / liquido durante la connessione, se c'è aria allora questo formerà uno spazio d'aria all'interno del sistema che interromperà il monostrato endoteliale durante il ritiro siringa passo. La soluzione leucociti nel cilindro della siringa deve agitazione regolare per assicurare che le cellule non si depositano, mantenendo così una densità cellulare costante durante l'esperimento.

Durante le fasi di registrazione è importante garantire l'immagine dello strato endoteliale è sufficientemente concentrata e chiaro che permette l'analisi offline accurata, e che durante la seconda fase del saggio flusso (post leucociti bolo) che viene lasciato un tempo sufficiente durante il tampone di lavaggio fase di prima registrazione viene ricominciato a garantire chetutti i leucociti non aderenti sono state rimosse. Analogamente, è indispensabile utilizzare cellule endoteliali in un monostrato di densità appropriata per prevenire la perdita di cellule che possono interferire con modelli di flusso nei capillari stretti e può anche essere difficile discriminare da grandi leucociti aderenti al microscopio a contrasto di fase. Abbiamo descritto ottimale densità di semina per le cellule endoteliali sinusoidali epatiche umane, ma puo 'variare tra le diverse popolazioni endoteliali e specie.

Notevoli progressi sono stati compiuti nello studio leucociti assunzioni in modelli animali con la microscopia intravitale. Il principale vantaggio del metodo saggi di adesione flusso è che il reclutamento dei leucociti può essere studiata in un sistema binario con cellule endoteliali umane primarie. Inoltre, queste interazioni possono essere studiati sotto i livelli fisiologici rilevanti di shear stress. E 'importante per confermare i risultati di studi intravitale negli animali con sistemi cellulari umani in quanto vi possono essere differences nelle proprietà endoteliali tra le specie. Una delle limitazioni del flusso saggio è che il reclutamento dei leucociti viene studiato in un ambiente unicellulare del monostrato endoteliale. Inoltre una volta che i leucociti hanno aderito e trasmigrata attraverso l'endotelio non possono essere presenti in numero sufficiente per essere isolati e sottoposti a processi a valle.

Nonostante questi limiti, una volta che il test di adesione flusso è stato masterizzato può essere sviluppato effettuare ulteriori analisi della cascata adesione leucocitaria e adattato ricapitolare un ambiente multicellulare. Registrazione prolungata di singoli campi e l'uso di software di monitoraggio può essere utilizzato per analizzare strisciando comportamento dei leucociti. Inoltre al termine del dosaggio flusso i microslides possono essere interrogati utilizzando microscopia confocale a scansione laser e l'etichettatura immunofluorescenza studiare adesione e trasmigrazione in maggior dettaglio. Inoltre, abbiamo precedentemente sviluppareEd un modello in vitro dove leucociti scorre potrebbero interagire con endotelio epatica condizionato dalla presenza di epatociti. Questo test può anche essere sviluppato per studiare sottopopolazioni di leucociti: il nostro gruppo ha condotto studi con sottoinsiemi come le cellule T regolatorie, cellule B e fegato infiltrante leucociti.

Questi studi sono la prova che il saggio di adesione flusso è un potente strumento per studiare il reclutamento generale e organo leucociti specifico in sistemi umani.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Six channel microslide VI 0.4 flow chamber	Ibidi	80601	Other channel size and precoated slides are available depending on assay requirements.
Flow adaptors  microslide VI 0.4	Ibidi	80646
Flow assay chamber	Solent Scientific	33-3322	These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.
Inverted Microscope IX2	Olympus, UK	Model IX50
Harvard Syringe Pump	Harvard Apparatus, UK	702101
Electronic solenoid valve	Lee Products Limited, UK	Part Number LFYA1226032H
Silicon Tubing large	Fisher Scientific	FB50855	2 mm inner diameter, 4 mm outer diameter
Silicone Tubing-small	Fisher Scientific	FB50853	1 mm inner diameter, 3 mm outer diameter
Harvard Glass Syringe	Harvard Apparatus, UK	55-0962
Cell separation medium/Lympholyte	VH Bio	CL-5020
Rat Tail Collagen	Sigma Aldrich	C3867-1VL