Un protocollo per l'analisi dell'epatite C replicazione del virus

Riepilogo

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Abstract

Virus dell'epatite C (HCV) colpisce il 3% della popolazione mondiale e provoca gravi disturbi epatici, tra cui epatite cronica, cirrosi e carcinoma epatocellulare. HCV è un virus a RNA enveloped appartenente alla famiglia Flaviviridae. Terapia attuale non è pienamente efficace e provoca effetti collaterali negativi. Non esiste un vaccino HCV disponibili. Pertanto, è necessaria continuato sforzo per sviluppare un vaccino e migliore terapia. Un sistema di coltura cellulare HCV è fondamentale per studiare varie fasi di crescita HCV tra cui l'ingresso del virus, la replicazione del genoma, imballaggio e uscita. Nella procedura attuale presentata, abbiamo utilizzato un virus wild-type intragenotype 2a chimerico, FNX-HCV, e un virus ricombinante FNX-Rluc portando un Renilla luciferasi gene reporter per studiare la replicazione del virus. Una linea di cellule di epatoma umano (Huh-7 riferiscono) è stato utilizzato per la trasfezione in vitro di trascritti HCV RNA genomici. Surnatanti di coltura privi di cellule, lisati proteici e tRNA otale sono state raccolte in vari momenti punti post-trasfezione per valutare la crescita HCV. HCV stato replicazione del genoma è stata valutata mediante RT-PCR e visualizzando la presenza di HCV RNA a doppio filamento. L'espressione della proteina di HCV è stata verificata da blot e immunofluorescenza saggi occidentali utilizzando anticorpi specifici per le proteine ​​HCV NS3 e NS5A. Cellule trasfettate HCV RNA rilasciate particelle infettive nella cultura surnatante e il titolo virale è stato misurato. Saggi di luciferasi sono stati utilizzati per valutare il livello di replicazione e infettività di HCV giornalista. In conclusione, vi presentiamo vari saggi virologici per la caratterizzazione delle diverse fasi del ciclo di replicazione di HCV.

Introduzione

Virus dell'epatite C (HCV) causa cirrosi e cancro del fegato. Essa colpisce 170 milioni di persone in tutto il mondo con 350.000 persone muoiono ogni anno ^1-3. HCV è un virus a RNA filamento positivo con un genoma di 9,6 kb. Il genoma di HCV è tradotto come singola poliproteina di ~ 3000 residui amminoacidici che viene scissione proteolitica da varie proteasi cellulari e virali in 10 polipeptidi. HCV è il virus prototipo in genere Hepacivirus e appartiene alla famiglia Flaviviridae ^4. Dopo l'esposizione, HCV stabilisce infezione cronica nel 80% degli individui. L'infezione è prevalentemente asintomatica e tempestiva diagnosi può consentire l'intervento terapeutico per prevenire il deterioramento del fegato. Il trattamento attuale è ottimale e nessun vaccino è disponibile ^5,6.

L'eziologia di epatite C è stata descritta per la prima nel 1989 ^7. Studiare la replica di HCV è importante per il vaccino contro l'epatite C e la ricerca del trattamento, ma era statolungo ostacolata dalla mancanza di un efficiente sistema di coltura virale. Un clone molecolare di HCV ha dimostrato di essere contagiosa negli scimpanzé su inoculazione intraepatica ^8. Successivamente, sono stati descritti repliconi HCV sub-genomici, che ha permesso di sezionare la fase di replicazione del genoma virale in un sistema di coltura cellulare ^9,10. Scoperta di un HCV genotipo 2a isolare JFH-1 (Giapponese epatite fulminante-1), in grado di infettare colture cellulari ha aperto nuove strade per la ricerca replicazione di HCV ^11-13. Ceppo genotipo 2a JFH-1 sistemi di coltura infettive basati basati virus chimerici inter-e intra-genotipiche e genotipo 1 HCV sono disponibili pure ^14-18.

Abbiamo utilizzato con successo JFH-1 ceppo e HCV intragenotype 2a virus chimerico avere la ad alta risoluzione profili funzionali mappa di domini di proteine ​​e cis-acting elementi RNA ^19,20. In base a questo, qui si descrive un sistema efficace cultura utilizzato di routine che permettestudiando varie fasi del ciclo di replicazione di HCV e l'interazione ospite-patogeno. Vi presentiamo saggi virologici per valutare la replicazione del genoma virale e infettività de novo di intragenotype 2a HCV e un giornalista HCV basata Renilla luciferasi.

Protocollo

Uno schema generale del protocollo è illustrato in Figura 1.

1. Cellule

1. Preparare mezzi di crescita completo che contiene il 10-15% di siero bovino fetale (FBS), 10 mM aminoacidi non essenziali, Hepes 10 mM, penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 mg / ml), e 2 mM L-glutammina.
2. Mantenere Huh-7.5.1 celle ¹³ in mezzi di crescita completi contenenti i supplementi di cui sopra per l'analisi in vitro di epatite C ciclo di replicazione virale.
3. Cultura ceppi virali in Huh-7.5.1 celle con i mezzi di crescita integrata specificato a 37 ° C con 5% di CO _2.

2. Virus e plasmidi costrutti

1. Generare la forma complementare DNA (cDNA) di HCV RNA e clonare in un vettore plasmidico per facilità di manipolazione genetica. Nota: La scoperta del giapponese epatite fulminante 1, JFH-1 (genotipo HCV 2 bis), isolare è stato fondamentale per la ricerca HCV ed èutilizzato principalmente per studiare il ciclo ^11-13 replicazione di HCV. Virus chimerici-Inter e intragenotypic basato su JFH-1 HCV sono comunemente utilizzati nella ricerca ^14-18. Costruzione di intragenotype sintetico 2a virus chimerico, FNX-HCV, e un monocistronic ceppo giornalista chimerico è stato descritto in precedenza ^{i 19 ei} dettagli costruttivi sono oltre la portata di questo protocollo.
2. Utilizzare il pFNX-HCV virus intragenotype 2a in quanto contiene un 5'NTR, regioni strutturali e p7, e parte delle regioni non strutturali NS2 (nucleotidi 1-2878) del ceppo parentale J6CF (NCBI adesione n. AF177036), come nonché i componenti non strutturali del JFH-1 ceppo virale (NCBI adesione n. AB047639). Nota: FNX-HCV è stato sintetizzato basandosi sulla sequenza di Jc1 intragenotype 2a HCV chimerico riferito in precedenza ^15.
3. Generare un costrutto chimerico monocistronic giornalista virale, la pFNX-Rluc, basato sul ceppo pFNX-HCV (sopra al punto 2.2) inserendo un Renilla gene luciferasi tra il 5 'NTR e gene nucleo (nt tra 388 e 389). Successivamente, collegare il gene della luciferasi e nucleo gene di questo costrutto utilizzando un 2A virus dell'afta epizootica (F2A) sequenza peptidica, che funzioni come un segnale di scissione.
4. Ingegnere il costrutto virale RNA polimerasi-null (Pol-) utilizzando il pFNX-HCV o lo sfondo virale pFNX-Rluc. Sostituire i residui catalitici NS5B polimerasi, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), di una di queste dorsali virali con residui di acido AAG amino.

3. In Vitro HCV RNA Trascrizione

1. Utilizzare un intragenotype 2a virus chimerico FNX-HCV e FNX-HCV Pol null (Pol-) HCV per la valutazione della replicazione virale (Figura 2A).
2. Linearizzare i plasmidi virali con XbaI enzima di restrizione e poi trattare con mung bean nucleasi per generare estremità smussata. Purificare i plasmidi digeriti mediante cromatografia a scambio anionico. Verificare l'integrità of plasmide linearizzato sottoponendo DNA per elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2B).
3. Trascrivere i plasmidi virali linearizzate utilizzando la polimerasi T7-RNA.
4. Purificare il RNA DNasi trattati nuova sintesi utilizzando un kit di purificazione dell'RNA.
5. Verificare la produzione di RNA mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2C).
6. Quantificare l'RNA per spettrofotometria.
7. Conservare il RNA generati in -80 ° C in aliquote di 10 mcg lavorativi. Nota: Per ridurre al minimo la variazione di qualità RNA in ciascun disegno sperimentale trascrivendo tutto RNA per ogni campione e controllo virale allo stesso tempo.

4. HCV RNA Transfezione e raccolta dei campioni

1. Raccogliere le cellule Huh-7.5.1 utilizzando tripsina.
2. Per lavare le celle, centrifugare e risospendere la sospensione per due volte con il freddo i media siero basso. Risospendere le cellule in mezzi siero partire a 1 x 10 ⁷ cellule per ml.
3. Mescolare un totale di 10 & #956; g di RNA virale trascritto con 400 microlitri di cellule risospese (4 x 10 ⁶ cellule) in 0,4-cm elettroporazione cuvetta. Transfettare le cellule tramite elettroporazione a 270 V, 100 Ω e 950 uF.
4. Risospendere le cellule elettroporate in 10 ml di media crescita completa con il 15% FBS. Nota: Aumento di sopravvivenza delle cellule elettroporate si vede quando le cellule Huh-7.5.1 sono state coltivate in 15% di siero fetale bovino.
5. Piastra le cellule in entrambe T-25 palloni (~ 1,2 x 10 ⁶ cellule per pallone) e piastre a 48 pozzetti (1 x 10 ⁴ cellule per pozzetto) per ciascuno dei seguenti punti temporali: 4, 48 e 96 ore.
6. Sostituire i media a 4-8 ore post-trasfezione con fresca mezzi di crescita supplementato con 10% FBS per rimuovere i detriti cellulari morti palloni in coltura e piatti.
7. Surnatanti di coltura cellulare Harvest ai 48, 96 punti di tempo hr e rimuovere detriti cellulari da campioni raccolti mediante centrifugazione di cellule a 1.500 rpm per 10 minuti a 4 º C.
8. Conservare il surnatante cell-free a -80 ° C. Lisare le cellule per l'analisi delle proteine ​​e RNA da Western blot e trascrizione inversa-PCR quantitativa nei punti all'ora indicata.

5. Trascrizione inversa-PCR quantitativa (RT-qPCR) per la valutazione delle copie HCV Genome

1. Eseguire un due fasi RT-qPCR per determinare il numero di copie di RNA genomico di HCV.
2. Trascrivere Reverse 1 mg di RNA cellulare totale utilizzando la trascrittasi inversa e un primer specifico per HCV senso filo che lega 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') o un primer specifico per il gene housekeeping peptidylprolyl isomerasi G (ppig R : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Anche invertire trascrivere FNX-HCV RNA (generato nel passaggio 3) di copie del genoma noti ⁽¹⁰ gennaio - 10 settembre di serie) utilizzando senso HCV filamento primer.
3. Effettuare qPCR utilizzando 50 ng del risultante cDNA trascritto utilizzando specifici primer HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') e il legame al DNA colorante verde contenente qPCR eccellente mix. Eseguire qPCR per le pulizie gene ppig così (primer ppig F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; ppig R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Nota: Per il calcolo esatto livello intracellulare di RNA di HCV di tutti i campioni, usare cellulari gene housekeeping, ppig , livello di espressione (ciclo Ct) per la normalizzazione. Utilizzare il numero di copie del genoma FNX-HCV come standard per la determinazione del numero di copie.
4. Utilizzare le seguenti condizioni durante l'esecuzione qPCR per la determinazione del numero di copie di HCV RNA: 95 º C per 15 sec e 60   ° C per 30 sec (40 cicli) utilizzando il sistema di PCR in tempo reale.
5. Vedere le Figure 3A e 3B per i risultati replicazione del genoma.

6. Western Blotting analisi per il rilevamento di HCV Protein Expression (Figura 3C)

1. Utilizzare lisati cellulari frRNA virale om transfettata a 96 ore dopo la trasfezione di proteine ​​western blotting.
2. Risolvere il lisato cellulare mediante SDS-PAGE e trasferimento a polivinilidene (PVDF) membrana.
3. Bloccare la membrana con una soluzione bloccante contenente latte scremato 5%, 0,2% Tween 20 in tampone fosfato salino (PBS).
4. Incubare la membrana con l'anticorpo monoclonale di topo primario NS3 (1 in 1.000 diluizione) e beta-actina (1 in 5.000 diluizione).
5. Aggiungi IgG di capra anti-topo coniugata con perossidasi di rafano (1 in 5.000 diluizione) e rilevare da chemiluminescenza.

7. Immunofluorescenza Assay (IFA)

1. Fissare le cellule con infezione da HCV e trasfettate con metanolo per 30 minuti a -20 ° C per l'analisi di immunofluorescenza.
2. Lavare le cellule con PBS per tre volte e bloccare con IFA tampone di bloccaggio.
3. Utilizzare policlonale di coniglio anti-NS5A principalmente anticorpo (gentilmente fornito dal Dr. Dasgupta, UCLA) o il mouse monoclonale anti-DSRNA anticorpo J2 alla diluizione 1:200 (1 mg / ml) e incubare per 5 ore a tutta la notte a 4 º C.
4. Lavare le cellule con PBS per tre volte dopo l'anticorpo primario.
5. Aggiungere goat anti-rabbit IgG-488 policlonale anticorpo secondario o di capra anti-topo IgG-594 anticorpo secondario policlonale ad una diluizione 1:1000 (1 mg / ml) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Lavare le cellule con PBS per tre volte e nuclei macchia con Hoechst colorante e vista utilizzando microscopio a fluorescenza (Figura 3D).

8. Virus misura Titer

1. Piatto ingenui Huh-7.5.1 cellule a circa 3 x 10 ³ cellule / pozzetto utilizzando una piastra a 96 pozzetti. Il giorno successivo, eseguire diluizioni seriali di 10 volte del cell-free cultura surnatante raccolto da RNA transfettate cellule HCV utilizzo dei supporti di crescita e di inoculare in triplice copia su Huh-7.5.1 cellule.
2. Fissare le cellule a 72 ore dopo l'infezione con metanolo (per 30 minuti a -20 º C) e immunostain per HCV proteine ​​NS5A come indicato nella sezione 7.
3. Usare la massima diluizione di contare per i fuochi positivo NS5A e calcolare il numero medio di messa a fuoco unità di formazione (FFU) per millilitro. Vedere Figura 4 per HCV titolo.

9. Renilla Luciferase Reporter Assay per Viral Genome Replica e Infettività

1. Per valutare la replicazione del genoma virale, piastra HCV RNA-elettroporato Huh-7.5.1 cellule in triplice copia in piastre 48 pozzetti (1 x 10 ⁴ cellule / pozzetto).
2. Lisare le cellule con 75 ml di tampone di lisi passiva al 6 ore, 48 ore e 96 ore dopo la trasfezione.
3. Oscillare delicatamente le piastre per 15 minuti a temperatura ambiente e conservare a -80 ° C.
4. Per misurare l'attività enzimatica Renilla luciferasi, scongelare il lisato proteico e Renilla luciferasi i reagenti a temperatura ambiente.
5. Aggiungere 20 ml di lisato proteico per pozzetto di una 96-wel l piatto luminescenza bianca e mettere il piatto in un luminometro.
6. Dispensare 100 ml di Renilla luciferasi di reagenti del dosaggio (coelenterazina substrato + tampone) per bene e dopo un ritardo di 2 secondi di pre-lettura; integrare la luce emessa per 10 sec.
7. Calcolare la media e la deviazione standard per ciascun campione dai valori di luciferasi triplicato biologici e sottoporre i dati per l'analisi statistica (Figura 5).
8. Per valutare l'infettività, inoculare 500 ml di surnatante cell-free ottenuti da cellule RNA-HCV transfettate per i punti temporali indicati (48 ore e 96 ore) in triplice copia su naïve Huh-7.5.1 cellule in piastre 48 pozzetti.
9. Sostituire l'inoculo virale con 500 ml di mezzo fresco per bene dopo 6 ore dopo l'infezione.
10. Lisare le cellule a 48 ore dopo l'infezione e sono soggetti a Renilla saggio luciferasi come descritto nei passaggi 8,2-8,7 (Figura 5).

DENOMINAZIONE "> 10. Analisi statistica

1. Le barre di errore nei grafici indicano deviazioni standard (SD). I valori di P sono stati calcolati con il test t spaiato.

Risultati

Il virus dell'epatite C è un virus a RNA. Così per scopo di manipolazione genetica, l'HCV cDNA genomico è stato clonato in un plasmide vettore batterico. Una sequenza del promotore T7 RNA polimerasi è stata introdotta immediatamente prima estremità 5 'del genoma di HCV. Uno schema generale di workflow analisi HCV è presentato nella figura 1. Per generare HCV RNA genomico con precisione 3 ', il genoma di HCV contenente plasmide è tagliato con l'enzima di restrizione XbaI

Discussione

Questa illustrazione descrive un metodo per analizzare il ciclo di replicazione del virus dell'epatite C. HCV è un agente patogeno umano e il protocollo sulla biosicurezza prescritta dovrà essere seguite scrupolosamente. Sistemi di coltura di cellule HCV infettive sono state descritte in precedenza ^11-13,16,17. Ci sono alcuni punti cruciali attuiamo quando seguendo il protocollo illustrato. In primo luogo, è di grande importanza per avere una buona qualità di intatta tutta la lunghezza RNA genomico vi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Non essential amino acid	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)	Cedars-Sinai Medical Center		The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides.
XbaI	New England Biolabs Inc.	R0145S
Mung Bean Nuclease	New England Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm)	Bioexpress	E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System	Bio-Rad	165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
PVDF membrane package	Bio-Rad	162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk	Bio-Rad	170-6404XTU
Tween-20	Bio-Rad	170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]	Abcam	ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]	Abcam	ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents	GE Healthcare Life Sciences	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
ViiA 7 real-time PCR system	Life Technologies	NA
Renilla Luciferase Assay System kit	Promega	E2810
RNase-Free DNase	Promega	M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer)	Promega