In tempo reale citotossicità saggi in Human Sangue intero

Riepilogo

L'intero test di citotossicità sangue (WCA) è un test di citotossicità sviluppato incorporando high-throughput tecnologia di posizionamento delle cellule con un microscopio a fluorescenza e l'elaborazione automatizzata delle immagini. Qui, descriviamo come cellule di linfoma trattati con un anticorpo anti-CD20 possono essere analizzati in tempo reale nel sangue intero umano per fornire un'analisi quantitativa citotossicità cellulare.

Abstract

Un live a base di cellule del sangue intero test di citotossicità (WCA) che consente l'accesso alle informazioni temporali della citotossicità delle cellule complessivo è sviluppato con high-throughput tecnologia di posizionamento delle cellule. Le popolazioni di cellule tumorali mirate in primo luogo sono preprogrammati per l'immobilizzazione in un formato matrice, ed etichettati con verdi coloranti fluorescenti citosoliche. Dopo la formazione matrice di celle, farmaci anticorpali sono aggiunti in combinazione con sangue umano intero. Ioduro di propidio (PI) viene poi aggiunto per valutare la morte cellulare. La matrice di celle viene analizzato con un sistema di imaging automatico. Mentre tintura citosolico etichette le popolazioni di cellule tumorali mirate, PI etichette le popolazioni di cellule tumorali morte. Pertanto, la percentuale di cancro bersaglio uccisione delle cellule può essere quantificata calcolando il numero di cellule sopravvissute mirati al numero di cellule bersaglio morte. Con questo metodo, i ricercatori possono accedere dipendente dal tempo e informazioni citotossicità cellulare dipendente dalla dose. Sorprendentemente, nessuna radio pericolosivengono utilizzati prodotti chimici. Il WCA qui presentato è stato testato con linfoma, leucemia, e le linee cellulari di tumori solidi. Pertanto, WCA permette ai ricercatori di valutare l'efficacia dei farmaci in una grande rilevanza ex vivo condizione.

Introduzione

I recenti progressi nel settore farmaceutico hanno portato ad un crescente interesse per la realizzazione delle identificazioni di anticorpi specifici di cellule tumorali e trattamenti contro il cancro personalizzati; Tuttavia, molti di ostacoli nel processo. Solo il 5% degli agenti che hanno attività antitumorale in fase di sviluppo preclinico sono concessi in licenza dopo aver mostrato sufficiente efficacia di fase II-III test ^1,2. Le strategie preclinici (in vitro e in vivo) sono ottimali altrettanti esempi hanno dimostrato che i farmaci antitumorali si comportano diversamente nell'uomo e in animali da laboratorio principalmente a causa dei diversi componenti del sangue ^3-5.

Per affrontare la necessità di una piattaforma di screening di farmaci antitumorali e per fornire un controllo di punti prima sperimentazione animale costosa e sperimentazioni cliniche, un intero saggio di citotossicità sangue umano (WCA) viene proposto per valutare l'efficacia dei farmaci antitumorali in ambiente biologico più rilevante. Laintero test di citotossicità sangue può essere utilizzato per valutare la risposta delle cellule individuali anticorpi e altri farmaci candidati nel sangue umano intero.

Il WCA è sviluppato incorporando la tecnologia high-throughput posizionamento cella con high-throughput e ad alto contenuto di imaging ^6. Utilizzando un sistema di imaging automatizzato, il numero sia delle cellule viventi e morti può essere determinata con un elevato grado di precisione. A causa del fatto che le cellule bersaglio sono immobilizzati sullo stesso piano focale, WCA è in grado di fornire analisi citotossicità quantitativa in tempo reale senza la rimozione dei globuli rossi. Inoltre, il sistema di imaging automatico fornisce diversi vantaggi come quella che solo le cellule bersaglio che hanno raggiunto i criteri specificati (ad es., Le cellule fluorescente, e la morfologia delle cellule) sono recintati e trasformati. Inoltre, permette la produzione di 144 lastre al giorno. Di conseguenza, la capacità di imaging e il throughput permette funzionamento di high-cONTENUTO e gli esperimenti high-throughput contemporaneamente. Combinando WCA e il sistema di imaging automatizzato, alta velocità di analisi di citotossicità delle cellule quantitativa può essere raggiunto all'interno di un ambiente biologico più rilevante.

Protocollo

1. Obiettivo delle cellule Preparazione

1. Mantenere (cellule di linfoma ad es. Raji) cellule bersaglio in terreni di coltura (RPMI 1640 medium di coltura, con il 10% di siero inattivato al calore fetale bovino (FBS), 4Nm L-glutammina, e 500 UI / ml di penicillina / streptomicina) a ³⁷ ° C in un incubatore CO ₂ al 5%.
2. Centrifugare il campione per agglomerare le cellule bersaglio in un tubo da 15 ml. Tempo di centrifugazione varia con diversi tipi di cellule; centrifugare per 3 minuti a 468 xg per le cellule Raji.
3. Prima aspirare eventuali bolle formate sulla superficie del surnatante, e rimuovere l'intero surnatante.
4. Aggiungere 10 ml di soluzione salina in tubo. Risospendere le cellule pipettando la soluzione su e giù più volte per rompere il ciuffo cellulare.
5. Centrifugare il campione per 3 min a 468 x g.
6. Aspirare eventuali bolle formate sulla superficie del surnatante, e rimuovere l'intero surnatante.

2. Preparazione dei microarrays cellulari

1. Oadesione cellulare btain 96 kit pozzetti o singoli array di celle 8 diapositive da camera e (vedi tabella dei materiali / reagenti).
2. Applicare 1,2 ml di Activator al reagente DNA dal kit. Tappare il flacone, capovolgere, e scuotere delicatamente per miscelare la soluzione.
3. Lasciare la soluzione di reagire per 20 minuti a RT.
4. Applicare la soluzione miscelata al pellet di cellule bersaglio (nel tubo 15 ml).
5. Aggiungere coloranti di fluorescenza citosoliche verdi ad una concentrazione finale di 500 nM.
6. Incubare le cellule bersaglio con la soluzione mista e la tintura per 30 min a temperatura ambiente su un agitatore orbitale.
7. Lavare le cellule due volte con 5 ml di PBS e risospendere le cellule in 10 ml di mezzi di crescita.
8. Applicare 100 microlitri della soluzione proveniente dal passaggio 2,7 a ciascun pozzetto. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Assicurarsi che i numeri di cellulare variano tra 5 × ^04-01 ottobre × 10 ⁶ cellule per pozzetto.
9. Dopo 10-15 minuti di incubazione a temperatura ambiente, lavare delicatamente i campioni due volte con 200-300 supporti di crescita microlitri per rimuovere tutte le cellule non legato.
   NOTA: A proposito di 5-10 mezzi di crescita microlitri rimane in ciascun pozzetto dopo il lavaggio.

3. Sangue intero citotossicità saggi

1. Aggiungere 180 ml di sangue umano intero a ciascun pozzetto.
2. Ottenere soluzione di anticorpo anti-CD20 a 5 mg / ml, ed eseguire diluizioni seriali per fare 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 ug / ml di soluzione di anticorpi anti-CD20 in provette da 1,5 ml. Aggiungere 20 ml di ciascuna concentrazione di anticorpi anti-CD20 per ogni campione e fare triplicato.
3. Aggiungere propidio ioduro ad una concentrazione finale di 500 nM di ciascun pozzetto.
4. Incubare la piastra risultante a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 16 ore.
5. Immagine le cellule sulle diapositive o piastre da 96 pozzetti con un sistema di imaging automatico con 8X ingrandimento.
6. Utilizzare il programma di conteggio delle cellule del sistema di imaging automatico per quantificare i risultati.
   NOTA: Il software del sistema di imaging automatico fornisce semplicepasso-passo le operazioni di conteggio delle cellule. Il protocollo di utilizzo di questo software sono disponibili sul sito web del fornitore.
7. Selezionare [Risultati Recensione] dalla pagina principale del software.
8. Selezionare [Il file salvato per i campioni].
9. Prima porta FITC significa intensità> 50, quindi cancello TxRed significa intensità> 20.
10. Selezionare [Panoramica Piastra].
11. Selezionare [Tabelle Esporta].
    NOTA: La formula uccisione delle cellule percentuale del programma è la seguente:
    Uccisione% cella di destinazione = (numero di cellule colorate sia verde e rosso / # di cellule colorate verde) * 100%

Risultati

Anti-CD20 anticorpi e cellule di linfoma (cellule Raji e MC / CAR) sono stati scelti come sistema modello per dimostrare tutto il test di citotossicità sangue (WCA) ^7,8. Cellule Raji aveva elevato numero di copie di CD20 sulla superficie cellulare, mentre le cellule MC / auto era basso numero di copie di CD20 sulla loro membrana. Cellule bersaglio sono stati colorati con coloranti di fluorescenza verde citosoliche verde e disposte sulla piastra a 96 pozzetti. 10.000 - 50.000 cellule di linfoma bersaglio sono...

Discussione

WCA è un fondamentale strumento di screening in vitro anti-cancro con risoluzione di singola cellula ^12-16, idealmente utilizzato dopo tradizionali proiezioni di destinazione, come CDC e test ADCC ^9-11, e prima che i test sugli animali preclinici. Attualmente, obiettivo primario test di screening come il CDC o test ADCC sono tutte eseguite in un supporto semplificato o un sistema tampone. Tuttavia, farmaci candidati che mostrano efficacia in questi sistema tampone semplificata non sono se...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell attachment 96 well plate kits	Adheren	AP9601
Suspension Single cell array 8 well chamber slide	Adheren	SS0801
Adherent Single cell array 8 well chamber slide	Adheren	SS0802
Lymphoma cell line CD20+	ATCC	CCL-86	Raji cells
Lymphoma cell line CD20-	ATCC	CRL-8083	MC/CAR
RPMI 1640 with L-glutamine	Life Technologies	11875-119
Fetal Bovine Serum	Thermo	SH30070.01HI
Peni/Strep	Life Technologies	15070063
Cytosolic dye	Life Technologies	C7025	Cell Tracker Green
Rituxan (Biosimilar)	Eureka Therapeutics
Human whole blood	Allcells	WB001
Propidium Iodide	Sigma	P4170-10MG
Automatic imaging system	Molecular Devices	Contact Vendor	Cell Reporter
Cell counting program	Molecular Devices	Contact Vendor	Cell Reporter