Em tempo real de Citotoxicidade em Sangue Total Humano

Resumo

O ensaio de citotoxicidade de sangue total (WCA) é um ensaio de citotoxicidade desenvolvido mediante a incorporação de alto rendimento tecnologia de posicionamento de célula com microscopia de fluorescência e de processamento de imagem automatizado. Aqui, nós descrevemos como células de linfoma tratadas com um anticorpo anti-CD20 pode ser analisada em tempo real no sangue humano inteiro para fornecer uma análise quantitativa da citotoxicidade celular.

Resumo

Um ensaio baseado em células vivo de sangue total citotoxicidade (WCA) que permite o acesso à informação temporal da citotoxicidade celular global é desenvolvida com a tecnologia de alto rendimento de posicionamento de célula. As populações de células tumorais alvo são primeiro pré-programado para imobilização num formato de array, e marcadas com corantes fluorescentes verdes citosólicas. Na sequência da formação de matriz celular, drogas de anticorpo são adicionados em combinação com sangue total humano. Iodeto de propídio (PI) é então adicionado para avaliar a morte celular. A matriz de células é analisado com um sistema de imagem automática. Embora as etiquetas corante citosólica populações de células tumorais visadas, as etiquetas PI populações de células tumorais mortas. Assim, a percentagem de morte de células de cancro alvo pode ser quantificada por cálculo do número de células sobreviventes direccionadas para o número de células alvo mortas. Com este método, os pesquisadores são capazes de acessar dependente do tempo e informações citotoxicidade celular dependente de dose. Notavelmente, sem rádio perigososprodutos químicos são utilizados. O WCA aqui apresentada foi testado com linfoma, leucemia e linhas celulares de tumores sólidos. Portanto, WCA permite aos pesquisadores para avaliar a eficácia da droga em uma condição altamente relevante ex vivo.

Introdução

Recentes avanços na indústria farmacêutica têm levado a um aumento do interesse em realizar as identificações específicas de anticorpos contra as células do tumor e tratamentos personalizados de câncer; No entanto, vários obstáculos são encontrados no processo. Apenas 5% dos agentes que têm actividade anti-cancerígena em desenvolvimento pré-clínico são licenciados depois de mostrar eficácia suficiente em fase de testes II-III ^1,2. As estratégias de pré-clínicos (tanto in vitro como in vivo) são sub-óptima como muitos exemplos têm mostrado que os medicamentos anti-tumorais se comportam de maneira diferente em humanos e em animais de laboratório, principalmente devido aos seus diferentes componentes do sangue ^{de 3-5.}

Para abordar a necessidade de uma plataforma de rastreio de drogas anti-tumor e para fornecer um ponto de verificação antes de experiências com animais e ensaios clínicos dispendiosa, um ensaio de citotoxicidade de sangue total humano (WCA) é proposto para avaliar a eficácia do fármaco anti-tumoral num ambiente biológico mais relevante. Oensaio de citotoxicidade de sangue total pode ser utilizada para avaliar a resposta de células individuais de anticorpos e outros candidatos a fármacos no sangue humano inteiro.

A WCA é desenvolvido através da incorporação de tecnologia de alto rendimento posicionamento de células com alta taxa de transferência e de alto teor de imagem ^6. Através da utilização de um sistema de imagem automatizado, o número de ambas as células vivas e mortas pode ser determinada com um elevado grau de precisão. Devido ao facto de que as células-alvo são imobilizadas no mesmo plano focal, WCA é capaz de fornecer uma análise quantitativa citotoxicidade em tempo real, sem a remoção de células vermelhas do sangue. Além disso, o sistema de imagem automática, oferece várias vantagens, como a que apenas as células-alvo que atingiram os critérios especificados (ex., Células com marcação fluorescente, e morfologia das células) são fechados e processados. Além disso, ele permite a produção de placas de 144 por dia. Consequentemente, esta capacidade de imagem e taxa de transferência permite um funcionamento de alta content e experiências de alto rendimento simultaneamente. Ao combinar WCA eo sistema de imagem automatizado, alto rendimento análise de citotoxicidade celular quantitativa pode ser alcançada dentro de um ambiente mais relevante biológica.

Protocolo

1. Alvo celular Preparação

1. Manter (por exemplo, células de linfoma. Raji) células alvo em meio de crescimento RPMI 1640 (meio de cultura, com 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), L-glutamina 4 nM, e 500 UI / ml de penicilina / estreptomicina), a 37 ^{° C} 5% num incubador de _CO2.
2. Centrifuga-se a amostra para sedimentar as células-alvo em um tubo de 15 ml. Tempo de centrifugação varia de acordo com diferentes tipos de células; centrifuga-se durante 3 min a 468 xg durante células Raji.
3. Primeiro aspirar quaisquer bolhas formadas na superfície do sobrenadante, e remover todo o sobrenadante.
4. Adicionar 10 ml de PBS ao tubo. Re-suspender as células por pipetagem a solução para cima e para baixo várias vezes para quebrar o amontoado de células.
5. Centrifugar a amostra durante 3 minutos a 468 x g.
6. Aspirar as bolhas formadas na superfície do sobrenadante, e remover todo o sobrenadante.

2. Preparação de Microarrays celular

1. Ofixação das células btain 96 kits placa bem ou conjunto de células 8 lâminas único bem de câmara (ver tabela de materiais / reagentes).
2. Aplicar 1,2 ul do Activador para o reagente de ADN a partir do kit. Tampe o frasco, invertê-lo, e agitar suavemente para misturar a solução.
3. Permitir que a solução a reagir durante 20 min à temperatura ambiente.
4. Aplicar a solução misturada ao sedimento de células alvo (no tubo de 15 ml).
5. Adicionar corantes de fluorescência verde citosólicas a uma concentração final de 500 nM.
6. Incubar as células-alvo com a solução mista e o corante durante 30 min à temperatura ambiente num agitador orbital.
7. Lavar as células duas vezes com 5 ml de PBS, e voltar a suspender as células em 10 ml de meios de crescimento.
8. Adicionar 100 ul da solução a partir do passo 2.7 em cada poço. Contar o número de células utilizando um hemacitómetro. Adicione os números de células certeza variar entre 5 × ^outubro 04-01 × 10 ⁶ células por poço.
9. Após 10-15 min de incubação à temperatura ambiente, lavar suavemente as amostras duas vezes com 200-300 meio de crescimento ul para remover as células não ligadas.
   NOTA: Cerca de 5-10 ul de meio de crescimento permanece em cada poço após lavagem.

3. Sangue Total de Citotoxicidade

1. Adicionar 180 ul de sangue humano inteiro para cada poço de amostra.
2. Obter solução de anticorpo anti-CD20, a 5 mg / ml, e realizar diluição em série para fazer 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 ug / ml de solução de anticorpo anti-CD20 em tubos de 1,5 ml. Adicionar 20 ul de cada concentração do anticorpo anti-CD20 para cada poço de amostra tomada de triplicados.
3. Adicionar iodeto de propídio, a uma concentração final de 500 nM para cada poço.
4. Incubar a placa resultante a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 16 horas.
5. Imagem das células nas lâminas ou placas de 96 poços com um sistema automático de imagem com ampliação de 8X.
6. Use o programa de contagem de células do sistema de imagem automático para quantificar os resultados.
   NOTA: O software do sistema de imagens automático fornece simplespasso-a-passo para as operações de contagem das células. O protocolo de usar este software pode ser encontrado no site do provedor.
7. Selecione [Resultados revisão] da página principal do software.
8. Selecione [o arquivo salvo para as amostras].
9. Primeiro portão FITC intensidade média> 50, então portão TxRed intensidade> 20 significam.
10. Selecione [Placa Overview].
11. Selecione [Tabelas de exportação].
    NOTA: A fórmula de morte celular percentagem do programa é mostrada abaixo:
    Assassinato% célula-alvo = (número de células coradas tanto verde e vermelho / # de células coradas verde) * 100%

Resultados

Anti-CD20 Os anticorpos e células de linfoma (células Raji e MC / CAR) foram escolhidos como um sistema modelo para demonstrar o ensaio de citotoxicidade de sangue total (WCA) ^7,8. Células Raji teve alta do número de cópias de CD20 na superfície celular, enquanto que as células MC / CAR tinha baixo número de cópias de CD20 na sua membrana. Células-alvo foram coradas primeiro verde com corantes de fluorescência citossólicas verdes e formou na placa de 96 poços. 10.000 - 50.000 células de linfoma ...

Discussão

WCA é uma crítica em ferramenta de triagem anti-câncer vitro com resolução única célula ^12-16, idealmente utilizado após exames alvo tradicionais, como o CDC e ensaios ADCC ^11/09, e antes de testes em animais pré-clínicos. Atualmente, alvo primário testes de rastreio, como CDC ou ensaios ADCC são todos realizados em uma mídia simplificado ou um sistema de buffer. No entanto, os candidatos de droga que mostram eficácia no sistema tampão simplificada estes nem sempre ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell attachment 96 well plate kits	Adheren	AP9601
Suspension Single cell array 8 well chamber slide	Adheren	SS0801
Adherent Single cell array 8 well chamber slide	Adheren	SS0802
Lymphoma cell line CD20+	ATCC	CCL-86	Raji cells
Lymphoma cell line CD20-	ATCC	CRL-8083	MC/CAR
RPMI 1640 with L-glutamine	Life Technologies	11875-119
Fetal Bovine Serum	Thermo	SH30070.01HI
Peni/Strep	Life Technologies	15070063
Cytosolic dye	Life Technologies	C7025	Cell Tracker Green
Rituxan (Biosimilar)	Eureka Therapeutics
Human whole blood	Allcells	WB001
Propidium Iodide	Sigma	P4170-10MG
Automatic imaging system	Molecular Devices	Contact Vendor	Cell Reporter
Cell counting program	Molecular Devices	Contact Vendor	Cell Reporter