Utilizzando a disegno Galvanotaxis Chambers per studiare la migrazione direzionale di cellule della prostata

Riepilogo

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Abstract

Il campo elettrico fisiologico serve funzioni biologiche specifiche, come dirigere la migrazione delle cellule in fase di sviluppo embrionale, escrescenza neuronale e epiteliale guarigione della ferita. L'applicazione di un campo elettrico in corrente continua a cellule coltivate in vitro induce migrazione cellulare direzionale, o galvanotaxis. Il metodo galvanotaxis 2-dimensionale dimostriamo qui viene modificato con poli misura (cloruro di vinile) (PVC) camere, superficie di vetro, elettrodi di platino e l'uso di uno stadio motorizzato su cui vengono esposte le cellule. Le camere di PVC e elettrodi di platino presentano bassa citotossicità e sono accessibili e riutilizzabili. La superficie di vetro e la fase di microscopio motorizzato migliorare la qualità delle immagini e consentono possibili modifiche alla superficie di vetro e trattamenti alle cellule. Abbiamo girato la galvanotaxis di due linee di cellule tumorali non-SV40-immortalata prostata, PRN-1-1 e pnt2. Queste due linee cellulari mostrano velocità di migrazione simili ed entrambe migrano versoil catodo, ma lo fanno mostrano un diverso grado di direzionalità in galvanotaxis. I risultati ottenuti con questo protocollo suggerire che i PRN-1-1 e le linee cellulari pnt2 possono avere diverse caratteristiche intrinseche che regolano le loro risposte migratori direzionali.

Introduzione

Campi elettrici endogeni vengono rilevati in vari tessuti, come la pelle ^{1, 32, 33} e il cervello ^2. Il campo elettrico fisiologica serve funzioni biologiche specifiche, tra dirigere sviluppo embrionale ^{3, 4,} guidando la conseguenza di processi neuronali ^{5, 6} e promuovere cicatrizzazione corneale epiteliale e ^{1, 7.} In vitro, l'applicazione di un campo elettrico in corrente continua a cellule coltivate imita il campo elettrico fisiologico e induce migrazione cellulare direzionale, o galvanotaxis. Galvanotaxis è stato studiato in fibroblasti, cheratinociti ^{8 9} pesci, epiteliale umano e cheratinociti corneali ^10-12, linfociti ^13, neuroblasti ² e cellule progenitrici neuronali ^14. Se esposto al campo applicato, la maggioranza delle cellule studiate migrare direzionalmente verso il catodica (-) poli. Tuttavia, diverse cellule tumorali, tra cui altamente metastaticole cellule del cancro al seno umano e della prostata umano linea di cellule di cancro PC-3M, passare al anodica (+) Polo ^{15, 16.} Diversi meccanismi sono proposti a mediare galvanotaxis o per spiegare la capacità delle cellule di percepire il campo elettrico, tra cui l'attivazione recettori di EGF ^12, il canale del sodio epiteliale ^17, PI3K e PTEN ^18, e il rilascio di ioni calcio ^{15, 19.} Il meccanismo non è ancora completamente compresa ed è possibile che più vie di segnalazione sono coinvolti in galvanotaxis.

Il metodo galvanotaxis 2-dimensionale dimostriamo qui è utile per caratterizzare la migrazione direzionale aderenti, cellule mobili, sia per monitorare la migrazione singola cella ^{10, 12, 17} o migrazione di un foglio di cellule confluenti ^{18, 20.} Questa tecnica è modificato dal Peng e Jaffe ^21, e Nishimura et al. ¹⁰ con, camere di PVC trasparente su misura, con coversl rimovibileips consentendo il recupero delle cellule facile dopo galvanotaxis per l'analisi secondaria, come l'imaging immuno-fluorescenza. La superficie di vetro delle camere galvanotaxis è ottica compatibile, che consente le riprese ad alto ingrandimento e con cellule fluorescenza marcata. Inoltre permette il disegno sperimentale con modifica della superficie di vetro, ad esempio modificando il rivestimento o di superficie. Distanziatori realizzati No. 1 coprioggetti sono utilizzati nelle camere per minimizzare il flusso di corrente sulle celle; quindi il riscaldamento joule, che è proporzionale al quadrato del flusso di corrente, non surriscaldare le cellule durante l'esperimento. I ponti di collegamento agar impediscono il contatto diretto degli elettrodi con le cellule e prevenire cambiamenti del pH medio o concentrazione di ioni durante galvanotaxis.

Due linee cellulari di prostata umana non-cancerogeni sono stati esaminati per la loro risposta galvanotaxis in questo studio. I PRN-1-1 ²² e ²³ sono entrambi pnt2 SV40 immortalizzate, linee cellulari fattore dipendente dalla crescita esprimono marcatori epiteliali citocheratina 5, 8, 18 e 19 con bassa o nessuna espressione di antigene-specifica della prostata (PSA). Entrambe le linee cellulari mantengono la morfologia poligonale di cellule epiteliali normali, ma cromosoma anomalia è stata osservata in cariotipo ^{22, 24.} Sebbene PRN-1-1 e pnt2 condividono comportamenti simili nella maggior parte degli esperimenti, fanno mostrano differenze nella formazione della struttura e in acinose galvanotaxis. Su una matrice 3-D, Matrigel, i PRN-1-1 cellule formano strutture acinose cave con lumen che assomiglia alla prostata normale della ghiandola tessuto ^25. Tuttavia, le cellule pnt2 formano sferoidi solidi senza lumen o polarizzata dell'epitelio ^26. Le cellule PRN-1-1 dimostrano anche una risposta galvanotactic superiore alla pnt2 in questo studio. La correlazione tra la formazione della struttura acinar e galvanotaxis in PRN-1-1 suggerisce che i segnali galvanotactic possono svolgere un ruolo nell'organizzazione della prmovimenti tessuto ghiandolare ostate in risposta a campi elettrici endogeni, e fornisce ulteriori caratteristiche di discriminare tra queste linee cellulari 2.

Protocollo

1. Le celle Culturing prostata

1. Cultura dei PRN-1-1 e pnt2 prostata cellule in 100 piatti mm di coltura in RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e antibiotici contro funghi a 37 ° C con il 5% di CO _2. Aggiornare il terreno di coltura ogni giorno fino a quando le cellule raggiungono 80% di confluenza per gli esperimenti galvanotaxis.

2. Montaggio Galvanotaxis Chambers

1. Assemblaggio camere inferiori
   1. Pulire una camera galvanotaxis plastica con 2-propanolo. Applicare il sigillante silicio di qualità marine intorno alle aperture circolari sul lato inferiore di una camera con una siringa e attaccare un grande coprioggetti (Figura 1). Usare il lato posteriore di un applicatore di cotone per spingere verso il basso il coprioggetti e pulire la colla in eccesso con tamponi di cotone. Le aperture circolari consentono la corrente elettrica media e scorrano sulle cellule situate tra i due serbatoi medie interne.
   2. Tagliare un piccolo coprioggetti per fare 6 mm x 25 millimetri distanziali con un pennarello a punta di diamante.
   3. Capovolgere la camera. Applicare 2 strisce di colla silicio con una siringa e / o una spatola metallica per creare una superficie canale x 25 mm 10 mm per l'adesione delle cellule tra i 2 aperture circolari sul fondo di vetro. Colla 2 pezzi di vetro distanziatore tra le due aperture circolari. Utilizzare il retro degli applicatori di cotone per spingere verso il basso i distanziali e pulire la colla in eccesso con tamponi e / o stuzzicadenti cotone.
   4. Asciugare la camera per 24 ore fino a quando la colla di silicio è guarito. Mettere a bagno nella camera durante la notte acqua distillata per rimuovere il residuo di acido acetico da colla. Asciugare la camera per un uso immediato, o conservare la camera per un uso successivo in un contenitore pulito.
      
      Figura 1: Montaggio della camera di fondo galvanotaxis. A) Una grande coprioggetti è attaccato al fondo di una camera pulita. B) Two pezzi di distanziali vetro sono incollati tra le 2 aperture circolari per creare un canale 10 mm mm x 25 per le cellule di allegare.
2. Semina cellule sulle camere galvanotaxis
   1. Preparare il numero richiedere di camere galvanotaxis necessari per l'esperimento. Ogni linea o il trattamento di cellule richiede una sola camera galvanotaxis. Pulire le camere galvanotaxis con 2-propanolo. Lavare le camere sterili con PBS 3 volte e controllare il flusso di liquido tra le due aperture circolari nelle camere.
   2. Racchiudere le camere sterili in piatti di coltura di cellule e permettere loro di equilibrare a 37 ° C per 15 min. Staccare le cellule della prostata dal loro piatto di coltura utilizzando 5 ml 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C per 5 minuti. Neutralizzare il tripsina-EDTA con 5 ml di 10% FBS in PBS.
   3. Trasferire le cellule a 15 ml provette e centrifugare le cellule per 5 minuti a 200 xg, 37 ° C. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno di coltura.
   4. Prendere 20 μl di soluzione di cellule per caricare ad una camera di conteggio e calcolare il numero di cellule. Regolare la concentrazione cellulare di 8 x 10 ⁴ cellule / ml con terreno di coltura.
   5. Prendete le camere galvanotaxis dalla C incubatore 37 °. Seed 350 ml di sospensione cellulare su ciascuna camera.
   6. Incubare le cellule nelle camere di notte nel piatto cultura con Kimwipe bagnato o in una camera umida in incubatore a 37 ° C con 5% di CO _2.

Figura 2:. Semina le cellule alla camera La camera inferiore viene asciugato e pulito cellule A) della prostata vengono tripsinizzate, contate e trasferiti alla camera e incubate overnight B) Un coprioggetti superiore è collegata a sigillare la camera prima di girare...

3. Lassembling le camere superiori
   1. Montare la camera superiore prima delle riprese. Il microscopio può ospitare l'imaging un'unica camera galvanotaxis contemporaneamente. Warm up 10 ml di terreno di coltura a 37 ° C per ogni camera galvanotaxis. Trasferire una camera galvanotaxis dalle incubatrici ad una piastra 37 ° C il riscaldamento.
   2. Lavare le cellule con terreno di coltura per rimuovere le cellule separati. Lasciare 400 microlitri di media nella camera. Utilizzare una siringa per applicare grasso alto vuoto sulla parte superiore di entrambi i distanziali vetro.
   3. Aggiungere una piccola coprioggetti per sigillare la camera. Premere delicatamente verso il basso il coprioggetti con il lato posteriore di un applicatore di cotone. Pulire l'eccesso di terreno con tamponi di cotone.
   4. Asciugare la superficie di vetro e applicare il grasso alto vuoto per sigillare il divario tra il coprioggetti e la camera. Utilizzare una spatola metallica per diffondere il grasso. Aggiungere 4 ml del terreno di coltura per i serbatoi interni e controllare il flusso di liquido tra i serbatoi.
4. Fai agarponti
   1. Tagliare un paio di tubi lungo PVC da 2 pollici (503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Muro), capovolgere e inserirli in un bicchiere da 100 ml.
   2. Misura 200 mg Bacto-agar e aggiungere in un pallone da 50 ml con 10 ml di terreno di coltura per fare 2% gel di agar. Forno a microonde per 30 secondi. Caricare il gel di agar per il tubo di plastica con una pipetta di trasferimento. Lasciare i ponti agar a temperatura ambiente per 10 minuti per solidificare l'agar.
   3. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura per i serbatoi esterni della camera galvanotaxis. Inserire i ponti agar al mezzo interno ed esterno serbatoi per condurre la corrente.

Figura 3:. Filmare le celle della camera Un diagramma per dimostrare l'assemblaggio finale della camera galvanotaxis. La camera è completamente sigillata con grasso alto vuoto. Medium è aggiunto to riempire i serbatoi, e due ponti agar vengono inseriti nella camera. Poi la camera galvanotaxis viene trasferito alla fase microscopio e gli elettrodi sono attaccati per applicare il campo elettrico. Vista laterale della camera galvanotaxis assemblato è mostrato per dimostrare che la corrente elettrica scorre sulle cellule attraverso i ponti agar e lo spazio tra il vetro di copertura.

3. Time-lapse imaging

1. Accendere la camera ambientale a 37 ° C con 5% di CO ₂ in aria circolante 2 ore prima di imaging.
2. Accendere il microscopio e avviare il software di immagine acquisizione. Calibrare palco microscopio e selezionare l'obiettivo 10X.
3. Trasferire le camere galvanotaxis al palco microscopio, fissare la camera con nastro adesivo e concentrarsi sulle cellule. Gli elettrodi galvanotaxis ai serbatoi esterni con catodo sul lato destro. Fissare il filo e gli elettrodi con nastro adesivo.
4. Accendere il bo poterex per applicare un campo elettrico alla camera. Misurare la tensione di uscita con il voltmetro attraverso la camera per raggiungere 2,5 volt per la camera lunga 25 mm (100 mV / mm). Mantenere l'intensità di campo durante l'esperimento regolando la corrente di uscita.
5. Selezionare 10 punti in tutta la camera per filmare nel software per generare dieci film time-lapse. Impostare le condizioni di acquisizione a intervalli di 10 min per 2 ore.
6. Inizio riprese e regolare la corrente di uscita, se necessario.
7. Alla fine dell'esperimento, rimuovere la camera dalla fase e fissare le cellule con 95% di alcol. Rompere aperto la camera con una lama di rasoio per pulire e ri-utilizzarlo.

4. Quantificazione di Galvanotaxis

1. Ruotare i filmati time-lapse e ri-orientare il catodo alla parte superiore delle immagini. Esportare i film per il software di monitoraggio delle cellule.
2. Monitorare manualmente il (x, y) posizione 10-20 cellule in ciascun time-point da ogni film (Figura 4 A, B).Le distanze di migrazione e gli angoli rispetto alla direzione nord-sud, lo stesso orientamento del campo elettrico, vengono calcolati nel software di monitoraggio cella (Figura 4C).
   NOTA: La velocità media di migrazione viene convertito dalla distanza di migrazione totale e tempo totale riprese. La direzionalità viene convertito da angoli al valore del coseno. Se le cellule migrano con direzionalità a caso, la media del coseno netto sarà vicino allo zero. Se le cellule migrano direttamente verso il catodo, il valore del coseno sarà +1. Se le cellule migrano direttamente verso l'anodo, il valore del coseno sarà -1.

Figura 4: Inseguimento cellulare per misurare direzionalità A) Sovrapposizione delle linee di tracciamento con immagini di cellule.. I (x, y) posizioni delle cellule sono Manually rintracciato nei film time-lapse. . Se le cellule migrano caso, il coseno media è vicina a zero B) Tuttavia, se le cellule migrano verso il catodo e l'anodo, il valore del coseno media è vicino a + (catodo) o -. (Anodo) 1.0 C ) La direzionalità è presentato dal valore del coseno, che viene convertito da angoli di migrazione (θ). Il coseno (θ) è uguale al rapporto tra la distanza a (la distanza di migrazione) della distanza b (la distanza proiettata alla direzione del campo elettrico).

3. Salvare le misurazioni. Importare i dati di un'applicazione database per calcolare i risultati combinati.
4. Esportare i dati combinati di velocità media di migrazione e il valore medio del coseno di un foglio di calcolo per tracciare i grafici a barre (Figura 5).

Risultati

Due linee di cellule della prostata (PRN-1-1 e pnt2) sono stati studiati con questo metodo. Cellule in entrambe le linee migrano a velocità simili di 1,0 +/- 0,3 micron / min nel corso di 2 ore (Figura 5A). Tuttavia, la direzionalità al campo elettrico è di 0,7 +/- 0,3 per l'PRN-1-1 riga e 0,2 +/- 0,8 per la linea pnt2 (Figura 5B). I risultati mostrano una differenza significativa nella galvanotaxis di queste due linee cellulari (p <0.01, 100 cellule sono state seguiti), sugge...

Discussione

L'analisi della risposta galvanotaxis di una cellula è stato un indicatore funzionale importante per molti migratori o crescita cellulare elabora ^{27, 28.} Qui usiamo una camera di misura con superficie di vetro per filmare due linee di cellule della prostata. Queste linee cellulari hanno dimostrato diversi gradi di galvanotaxis, e ipotizzano che la localizzazione intracellulare o l'attivazione delle proteine ​​galvanotaxis mediare potrebbero creare interferenze durante il processo di generazione d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee, et al. (1994)
PNT2 prostate cells	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	warm up to 37 °C before use
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% in PBS, warm up to 37 °C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240	add 5 ml to 500 ml medium
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	-	-	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4 in 1,000 ml of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 °C before use
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	warm up to 37 °C before use, treat cells for 3-5 min at 37 °C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc, CA		Custom-designed (1/4" x 2" x 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs.
Galvanotaxis electrodes	UCD electric shop		platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box	Substrate Engineering, CA		custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5	Fisher	12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Diamond point marker	ThermoScientific	750
Marine grade silicon sealer, clear	3M	051135-08019
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
6 ml syringe	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5 ml	Nichiryo	SG-M
Cotton applicators	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC tubing	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% agar solution
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer counting chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-002	load 20 μl cell solutions to count
Culture Temp Warming plate	Bel-Art Scienceware	370150000	to keep the galvanotaxis chambers at 37 °C
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len	Nikon
Retiga EX CCD camera	Qimaging		Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2	Airgas		special order
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	Microsoft