Generazione di cancro alla prostata del paziente Derivato modelli di xenotrapianto di cellule tumorali circolanti

Riepilogo

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Abstract

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

Introduzione

Paziente xenotrapianti derivati ​​sono modelli sperimentali sempre più popolari utilizzati per la ricerca sul cancro. Essi possono essere utilizzati per la caratterizzazione di biomarcatori e percorsi biologici, valutazione preclinica di efficacia dei farmaci, e la creazione di avatar per terapie antitumorali personalizzate ^1,2. In precedenza, altri gruppi di ricerca hanno sviluppato modelli PDX o impiantando o iniettando sospensioni di cellule tumorali singole o espianti intero tumore in topi immunocompromessi ^1. Questi PDX modelli richiedono raccolta chirurgica del tumore solido fresco, ascite maligna o versamento pleurico da un paziente sottoposto ad un intervento chirurgico che è sia costoso e espone il paziente ad un aumentato rischio di morbilità iatrogena.

Un recente sviluppo significativo nella ricerca sul cancro è stato il rilevamento, l'isolamento e la caratterizzazione di cellule tumorali circolanti. Queste cellule tumorali sfuggono dalla massa tumorale primaria e in circolodove giocano un ruolo critico nella metastasi e recidive, la causa più comune di cancro legato mortalità ^3. La valutazione e la caratterizzazione di CTC da diversi tipi di tumori solidi hanno fornito informazioni cliniche per la diagnosi, la prognosi e il monitoraggio malattia residua ^3. Una varietà di approcci attualmente utilizzati basandosi su entrambe le proprietà fisiche, espressione di marcatori o caratteristiche funzionali di CTC può essere utilizzata per isolare efficacemente CTC ^4. Esistenti macroscala metodi di isolamento CTC includono gradiente di densità centrifugazione, filtrazione fisica con pori del filtro e la separazione contro molecole di superficie. Le metodologie di isolamento CTC più utilizzati sono basati sulla cattura a base di anticorpi di CTC. Sia selezione positiva e negativa di marcatori di superficie cellulare può essere impiegato per isolare CTC dal sangue periferico. Selezione positiva per CTC nella circolazione periferica utilizza comunemente marcatori epiteliali (ad esempio, EpCAM), che unre espresso sulle CTC, ma le cellule non ematopoietiche. Lo svantaggio di questo metodo è che CTCs con potenziale metastatico sono spesso sottoposti epiteliali-to-mesenchymal transizione (EMT), che downregulates marcatori di superficie epiteliali ^3. Per isolare CTC con potenziale metastatico, una metodologia di selezione negativa che impiega il marcatore di superficie ematopoietiche, CD45, per esaurire la popolazione normale di cellule di leucociti può essere usato ^5.

Il cancro alla prostata è il tumore più comunemente diagnosticato e una delle principali cause di decessi correlati al cancro negli uomini ^6. I meccanismi di progressione del tumore e l'aggressività sono state comprese e quindi la generazione e caratterizzazione di modelli sperimentali che ricapitolano l'eterogeneità molecolare del cancro alla prostata sono di notevole interesse. Modelli PDX di carcinoma della prostata sono stati generato in precedenza da attecchimento delle cellule del cancro alla prostata umano in immunocomtopi promesso ^7,8. Tuttavia, la generazione di tali modelli è stata ostacolata dal tasso attecchimento basso di cancro alla prostata in topi immunocompromessi, che viene principalmente attribuito alla natura indolente della malattia. Recentemente, CTC sono stati utilizzati per generare il cancro al seno ^9, il cancro del polmone ^{10 e} il cancro alla prostata ^{11 modelli} PDX. Questi studi proof-of-concept introdotto la possibilità di generare modelli PDX indipendente dalla necessità di raccolta dei campioni chirurgici. In questo articolo si descrive in dettaglio un metodo per la generazione di questo modello sperimentale romanzo.

Protocollo

Questo protocollo è stato condotto presso il nostro istituto con l'approvazione del comitato etico della ricerca istituzionale ed è in conformità con tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano.

1. Raccolta di sangue periferico di pazienti affetti da cancro alla prostata avanzato

Nota: Selezionare i pazienti con carcinoma della prostata metastatico. Ottenere il consenso scritto del paziente e registrare le caratteristiche cliniche dei pazienti, tra cui l'età di isolamento e la chemioterapia precedente e trattamenti ormonali. I pazienti con malattia metastatica saranno potenzialmente avere più alta concentrazione di CTC nel sangue periferico.

1. Raccogliere i campioni di sangue dopo consenso informato e sotto un appropriato Institutional Review Consiglio ha approvato il protocollo. Indossare guanti in lattice e un camice da laboratorio durante tutta la procedura.
2. Collegare 25 G farfalla ago e tubo alla porta aghi. Utilizzare un tampone imbevuto di alcool per pulire un'area divena periferica tra il bicipite ed avambraccio, quindi applicare laccio emostatico al braccio del paziente.
3. Inserire l'ago a farfalla nella vena antecubitale e spingere il tubo di raccolta del sangue in porta aghi per avviare la raccolta. Raccogliere circa 10 ml di sangue in provette per il prelievo che contengono acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per prevenire la coagulazione.
4. Rimuovere ago a farfalla da paziente e applicare pressione con garza sterile su sito di puntura della vena per 1 min. Sito Coprire con una benda sterile.

2. Isolamento di cellule mononucleate

Nota: Il sangue raccolto dal passaggio 1 conterrà cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) (ad esempio, linfociti e monociti) oltre ai CTC mononucleari.

1. Pipettare sangue intero in 50 ml tubo conico in polistirene con un 5 ml pipetta sierologica e aggiungere Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS) in un rapporto 1: 1. Delicatamente miscela pipetta per omogeneizzare.
2. Aggiungere 15 ml di una soluzione preparati commercialmente (Ficoll-Paque) per separare componenti del sangue da bassa velocità di centrifugazione in gradiente di densità in una provetta conica da 50 ml in polistirolo vuoto.
3. Delicatamente pipetta sangue intero e la miscela di HBSS, dal punto 2.1, nel tubo di polistirolo dal punto 2.2, in modo da formare strato superiore distinta. Set pipetta di valore più basso per ridurre al minimo la miscelazione di soluzioni, questo garantirà la separazione efficiente.
4. Centrifugare a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente (25 ° C). Impostare la decelerazione a valore più basso per evitare la miscelazione di soluzioni dopo la separazione. L'accelerazione può essere impostato su qualsiasi velocità.
5. Dopo centrifugazione, identificare la banda bianco-grigio sottile strato PBMC e CTCs sandwich tra plasma sulla soluzione superiore e la separazione sul fondo della provetta.
6. Raccogliere le cellule della striscia bianco-grigio al punto 2.5 in una provetta da 50 ml in polistirolo con una pipetta di plastica trasferimento.
7. Aggiungi HBSS a 50 ml tubo conico in polistirene con PBMC e CTC ecentrifuge nuovamente a 400 xg per 10 min a RT lavare.
8. Decantare pellet liquido e risospendere in 50 ml di HBSS e centrifugare di nuovo a 400 xg per 3 minuti a temperatura ambiente per lavare.
9. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet rimanente con 5 ml di globuli rossi Lysis buffer e incubare la soluzione per 5 minuti a temperatura ambiente.
10. Rimuovere il globulo rosso tampone di lisi per centrifugazione a 400 xg per 3 minuti a temperatura ambiente.
11. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di PBS 1x supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) per bloccare prima di colorazione degli anticorpi.

3. Cellule mononucleate colorazione con CD45-FITC anticorpi per fluorescenza cellulare Attivato (FACS) Ordinamento

1. Quantificare il numero di (Trypan Blue-negativo) cellule vitali (dal punto 2.11) utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatizzati. Preparare un 1 x 10 ^{6 cellule} / ml sospensione (in PBS 1x con il 10% FBS) e posizionarlo sul ghiaccio per 1 ora.
2. Distribuire il quantificatosospensione cellulare dal passo precedente in due tubi. Etichettare le provette come il controllo e CD45 colorazione.
3. Nella provetta di controllo, aggiungere IgG1κ-FITC (2,5 mcg / ml) alla diluizione di 1: 250. Nel tubo colorazione CD45, CD45 FITC aggiungere (2,5 mcg / ml) anticorpo primario coniugato alla diluizione di 1: 250 e incubare le sospensioni cellulari in ghiaccio per 30 min. Etichettatura antigene CD45 è utilizzato per escludere le cellule ematopoietiche.
4. Centrifugare le cellule a 400 xg per 3 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
5. Lavare le cellule due volte, sospendendo ogni pellet con 1 x PBS sterile supplementato con 10% FBS seguita da centrifugazione a 400 xg per 3 min a 4 ° C.
6. Risospendere le cellule in una soluzione di PBS contenente 1x 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) ad una concentrazione di 10 ug / ml 1 ml.
7. Filtrare la soluzione finale attraverso tappi colino 35 micron in 12 millimetri tubi in polistirolo x 75 mm.

4. Isolamento dei prostata CTC perFACS

Nota: Utilizzare un citofluorimetro per raccogliere in tempo reale CTC negativi CD45.

1. Controlli di compensazione SET utilizzando cellule dal tubo etichettato, "Control".
2. Creare cancelli che escludono detriti e gruppi di cellule utilizzando opportuni parametri previsionali scatter e side-scatter.
3. Stabilire le porte FITC utilizzando le sospensioni di cellule dal tubo etichettato, "CD45-FITC."
4. Vitali (DAPI-negativo), le cellule cancello utilizzando il Pacific Blue-Un canale.
5. Raccogliere popolazione negativa CD45 in una sterile tubo da 15 ml in polistirolo contenente 2 ml di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 integrato con il 10% FBS.
6. Centrifugare la sospensione di cellule tumorali della prostata filtrate a 400 xg per 3 min, quindi risospendere il pellet in 200 - 500 ml di RPMI supplementato con 10% FBS.

5. L'iniezione di CTC in topi e il monitoraggio dei xenotrapianto crescita

Nota:Condurre tutte le procedure animali in conformità con i protocolli approvati dal comitato di cura degli animali istituzionale. Questo protocollo è stato condotto presso la nostra istituzione, in virtù di un uso specifico protocollo animale approvato dal nostro Comitato Animal Care in conformità e il rispetto di tutte le pertinenti normative e istituzionali agenzie, regolamenti e linee guida.

1. Mescolare la prostata sospensione cellulare tumorale filtrate con matrice extracellulare in un rapporto 1: 1 e posto sul ghiaccio.
2. Anestetizzare topo prima dell'impianto sottocutaneo in una camera di alimentazione 5% (v / v) isoflurano inalato in 1 L / min di ossigeno. Assicurare anestesia appropriata controllando per la perdita dei riflessi della cornea e punta nel topo.
3. Utilizzando un ago G 25 e una siringa da 1 ml, iniettare 250 ml di cellule tumorali della prostata e della matrice extracellulare sospensione cellulare per via sottocutanea in entrambi i fianchi superiori di 8-10 settimane vecchio mouse immunodeficienti maschile. Iniettare 250 microlitri indipendentemente dalla concentrazione di CTC come il volume di iniezione è l'iValore mportante. Amministrazione massima SQ nel topo non è superiore a 1 ml.  
4. Monitorare topi eseguendo la palpazione settimanale di siti di iniezione del mouse per la crescita della densità nodulari sottocutanei e misurando topi peso due volte a settimana.
5. Euthanize topi di anidride carbonica asfissia seguita da dislocazione cervicale e raccolta sottocutaneo prostata umano xenotrapianti tumorali quando la dimensione del tumore è più di 0,5 cm e meno di 1 cm di diametro per assicurare tessuto tumorale sufficiente per analisi molecolari e di passaggio seriale. Euthanize topi con segni di sofferenza o di perdita di peso del 15%, nonostante nessun tumore è palpabile.

Risultati

Questo protocollo porterà alla generazione di modelli PDX da isolati CD45 prostata negativo CTC cancro. Sulla base del metodo di selezione negativa utilizzata nel nostro protocollo è necessario escludere le cellule morte mediante colorazione DAPI. La percentuale di cellule CD45 negative rilevata mediante citometria di flusso è variabile e dipende dal carico tumorale del paziente (Figura 1A). Immunofluorescenza di cellule CD45 e non ordinati utilizzando DAPI (per identificare nuclei cellulari) rivela ...

Discussione

Questo manoscritto descrive un metodo per la generazione di cancro della prostata modelli PDX da CTC. L'uso di CTC per la generazione di PDX modelli ha diversi vantaggi potenziali importanti rispetto ai metodi esistenti. Innanzitutto, raccolta accessibile delle CTC dal sangue periferico consente la generazione di modelli sperimentali dallo stesso paziente a diversi stadi della malattia. In secondo luogo, la raccolta di sangue rappresenta un metodo sicuro ed economico per isolare le cellule tumoral...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe