Aprire tracheostomia gastrico acido aspirazione Modello murino di lesioni polmonari acute Risultati in massima acuta non letale Lung Injury

Riepilogo

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Abstract

polmonite acido è una delle principali cause di sterile danno polmonare acuto (ALI) negli esseri umani. polmonite Acid estende lo spettro clinico da asintomatica alla sindrome acuta da distress respiratorio (ARDS), caratterizzata da alveolite neutrofila e danni fisici, sia dell'epitelio alveolare e endotelio vascolare. Clinicamente, ARDS è definita da un esordio acuto di ipossiemia, infiltrati polmonari bilaterali chiazze ed edema polmonare non cardiogeno. Studi sull'uomo ci hanno fornito informazioni preziose sui cambiamenti fisiologici e infiammatorie nei polmoni causate da ARDS, che ha portato a diverse ipotesi sui meccanismi subalterno. Purtroppo, le difficoltà determinano l'eziologia della ARDS, nonché una vasta gamma di fisiopatologia hanno portato ad una mancanza di informazioni critiche che possono essere utili nello sviluppo di strategie terapeutiche.

modelli animali traslazionali sono utili quando il loro patogenesi e fisiopatologia ripro precisioneEA concetto provato in entrambi in vitro e clinica. Anche se grandi modelli animali (ad esempio, pecore) le caratteristiche di condivisione di anatomia di albero di trachea-bronchi umano, modelli murini fornire una serie di altri vantaggi tra cui: basso costo; breve ciclo riproduttivo si presta ad una maggiore acquisizione dei dati; un sistema immunologico ben compreso; e un genoma ben caratterizzato porta alla disponibilità di una varietà di delezione genica e ceppi transgenici. Un modello robusto basso pH indotta ARDS richiede un murino ALI che colpisce principalmente l'epitelio alveolare secondariamente l'endotelio vascolare, nonché le piccole vie aeree che porta agli alveoli. Inoltre, una lesione riproducibile con ampie differenze tra insulti pregiudizievoli e non pregiudizievoli è importante.

Il modello di aspirazione acido gastrico murino qui presentata utilizzando acido cloridrico impiega un tracheostomia aperta e ricrea uno scenario patogeno che riproduce il basso pH pneumonitis lesioni negli esseri umani. Inoltre, questo modello può essere utilizzato per esaminare l'interazione di un basso pH insulto con altre entità polmonari pregiudizievoli (per esempio, particelle di cibo, batteri patogeni).

Introduzione

ARDS è caratterizzata da infiammazione polmonare diffusa ed è clinicamente visto come mancanza acuta di respiro con ipossiemia. Questi sintomi si verificano spesso meno di 24 ore dopo un evento incitamento, come un trauma, la sepsi, le reazioni correlate trasfusione di sangue o di aspirazione. E 'caratterizzata da istopatologico alveolite neutrofila (cioè diffusa infiammazione) localizzato dell'epitelio alveolare e endotelio vascolare che porta alla perdita di proteine e formazione di membrane in seguito ialina. L'aspirazione è classificato come polmonite chimica o polmonite da aspirazione. ¹ Il componente acida dell'aspirazione gastrica contribuisce sia la polmonite e predilezione per sviluppare una polmonite batterica secondaria. La polmonite da aspirazione è uno dei principali fattori di rischio per ALI e il successivo sviluppo di ARDS. ²

aspirazione gastrica è un evento acuto definito come l'inalazione di materiale da tegli stomaco con o senza flora orofaringea nelle vie aeree al di là delle corde vocali. I contenuti possono contenere aspirare fluido basso pH dello stomaco, batteri, sangue, o particelle di cibo. aspirazione gastrica spesso si verifica in pazienti nel reparto di terapia intensiva (ICU), i quali sono in genere in uno stato di digiuno e quindi posti su un inibitore della pompa protonica per limitare l'aspirazione del contenuto gastrico acidificato. L'incidenza di ALI nella popolazione terapia intensiva negli Stati Uniti è di 2,5 - 5 volte superiore rispetto alla popolazione generale dei pazienti. ³ Purtroppo, queste condizioni predisponenti spesso portano ad uno stato di proliferazione batterica nello stomaco che può portare a più gravi sequele nel polmone seguito di un evento di aspirazione, l'aspirazione gastrica è un fattore di rischio indipendente per lo sviluppo di polmonite batterica secondaria (SBP) , ALI e ARDS.

aspirazione gastrica ha due componenti principali: acido cloridrico e contenuto gastrico, che possono o non possono contenere batterio particelle di cibo. Nel modello di roditore la componente acida alone di aspirazione gastrica produce una risposta infiammatoria iniziale a seguito della lesione caustica diretta di pH basso sul epitelio delle vie aeree. Questo è seguito da una infiltrazione neutrofila e una risposta infiammatoria alle 4 - 6 h. ⁴ Questi due fattori in ultima analisi, portare alla distruzione di integrità microvascolare polmonare determinando in tal modo stravaso di liquidi e proteine in alveoli e le vie respiratorie. Per capire questo fisiopatologia e di approfondire i possibili interventi terapeutici, è importante sviluppare e caratterizzare un modello animale che chiarisce i meccanismi sottostanti coinvolti. Un aspirato acido da solo deve essere voluminoso o con un pH abbastanza basso per bypassare il potere tampone dell'albero respiratorio e raggiungere gli alveoli. Se questo non avviene, solo un transitorio superiore, conducendo lesioni airways verifica che è meno probabile che portare alla grave sequele di ARDS. ^{5 <}/ Sup>

Per emulare un evento di aspirazione accuratamente con ferito dell'epitelio alveolare, è importante bypassare le difese naturali di un animale. Usando un modello aspirazione mouse per produrre un ALI che imita il pregiudizio acido gastrico osservate nell'uomo, bisogna spiegare le differenze nella struttura trachea-bronchiale. La tecnica di tracheostomia aperta che questo metodo utilizza ignora le differenze tra murino e gli alberi delle vie respiratorie umane e modelli il danno in un modo che riproduce ALI sia fisiologicamente e istologicamente. Storicamente, intubazione endotracheale è stato utilizzato per generare ALI, tuttavia si ritiene difficile da eseguire in topi senza pregiudizio della laringe. Pertanto, questo metodo offre una potenziale alternativa che ha dato risultati coerenti tra più ricercatori e con procedura di mortalità attribuita minimo.

Protocollo

Tutti i materiali e le attrezzature devono essere raccolti e adeguatamente organizzata prima procedura. La procedura deve essere effettuata con le transizioni senza soluzione di continuità da un passo a quello successivo, al fine di fornire, i dati riproducibili coerenti. Questo protocollo segue politiche istituzionali fissati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali presso il Buffalo Veterans Affairs Medical Center.
NOTA: C57BL / 6 topi maschi e femmine sono stati utilizzati per questo protocollo. Non vi è alcuna differenza significativa di fuoriuscita di albumina tra i sessi.

1. Acido cloridrico Preparazione

1. Fare 56,2 mM HCl _sterile con l'aggiunta di 281 ml di 1 N HCl a 4,72 ml di soluzione fisiologica sterile (SNS). Titolare a pH 1,25 con 1 N HCl (≈ 0 - 50 mL).
2. Rendere questa preparazione fresco prima di infortunio. A partire pH SNS non è tamponato assicura la cloridrico insulto lesioni L'acido è transitorio.

2. Anestesia e Tecnica Esposizione tracheale

NOTA:Assicurarsi che la procedura di infortunio è condotta in una cappa aspirante con il filtraggio carbone per evacuazione gas anestetici. Mantenimento di condizioni sterili è essenziale in quanto questo è un intervento chirurgico di sopravvivenza. Utilizzare guanti sterili e sterilizzare tutti gli strumenti in una perlina di vetro strumento chirurgico sterilizzatore prima di un intervento chirurgico su ogni animale. L'uso di teli per isolare il sito chirurgico è raccomandato per mantenere la sterilità. Utilizzare isoflurano come gas anestetico quanto fornisce una solubilità relativamente bassa sangue gas consente una rapida induzione di anestesia, nonché rapido recupero dopo l'infortunio.

1. Inizia inducendo l'anestesia in una camera con 2,75% isoflurano in ossigeno con portata di 2 l / min.
2. Una volta che il mouse è adeguatamente anestetizzato (che non risponde ai piedi pizzico abbastanza forte per non rompere la pelle o causare danni ai tessuti profondi), sospendere il mouse, gli incisivi superiori con una lunghezza 15 cm da 1-0 sutura di seta intrecciata in posizione supina su un 60 ^{scheda a} microcontrollore pendenza dissezione.
3. Assicurarsi che l'anestesia sia mantenuto durante tutta la chirurgia, fornendo isoflurano attraverso un cono di naso. Applicare una pomata veterinaria sull'occhio del mouse per prevenire la secchezza.
4. Radere la parte ventrale del collo con un trimmer elettrico e applicare soluzione antisettica topica (cioè, iodopovidone). Rimuovere l'eccesso con una garza antisettica e lasciare asciugare (~ 15 - 30 s).
5. Infiltrarsi nella linea mediana del collo dalla tacca sternale a parte inferiore della mascella con 100 microlitri di 0.5% bupivacaina (per fornire l'analgesia pre-, peri- e post-operatorio).
6. Fare A 1 - 1,5 centimetri linea mediana longitudinale un'incisione nel collo con un bisturi o forbici sottili curve. Penetrare la membrana fasciale tra le ghiandole salivari per via smussa con 2 pinze dentellate curve per esporre la trachea (identificato dagli anelli di cartilagine bianchi).
7. Sempre con le 2 pinze dentellate, afferrare una parte della muscolatura paratracheale e tirarlo a lato, mentre la dissezione tra il Musfibre CLE longitudinalmente prossimi alla trachea.
8. Una volta aereo dissezione è stabilito, continuerà ritraendo il muscolo paratracheale come la seconda coppia di pinze viene lavorato sotto la trachea. Utilizzare queste pinze per posizionare un 15 centimetri filo di sutura 1-0 seta intrecciata nella punta della pinza e tirare attraverso posizionare la sutura dietro la trachea.

Procedura instillazione 3. intra-tracheale

1. Preparare la siringa pregiudizio instillazione riempiendo una siringa da 0,5 ml collegata ad un ago da 22 G con 0,2 mL di aria seguita da 3,6 ml / kg di acido cloridrico. L'aria agirà per facilitare la dispersione del veicolo, così come una manovra di reclutamento alveolare per quei alveoli che possono essere stati sottoposti atelettasia durante la somministrazione di anestesia.
   NOTA: Seguire le linee guida IACUC locali per quanto riguarda l'analgesia post-operatoria e consultare il proprio veterinario locale. Fate attenzione a utilizzare qualsiasi analgesici con proprietà anti-infiammatorie prima impiegoing questo modello di danno polmonare sterile.
2. Per amministrare l'infortunio, prima interrompere la somministrazione isoflurano. Lasciare profondità dell'anestesia del mouse per lievitare per circa 10 - 15 s fino a quando non comincia a reagire ad un pizzico punta pinze.
3. Immediatamente iniziare passi instillazione di lesioni. Se profondità dell'anestesia è troppo profonda l'animale non respirare spontaneamente dopo l'instillazione pregiudizio, che è particolarmente vero per le lesioni di acido cloridrico contenente.
4. Avere un assistente spremere la gabbia toracica di espellere capacità vitale.
5. Utilizzare la sutura di seta 1-0 intrecciata posto precedentemente intorno alla trachea per fornire la trazione tirandolo superiormente e quindi inserire l'ago della siringa nella trachea tra il 1 ^° e 2 ^° anelli cartilaginei sotto la laringe. La smussatura ago deve affrontare il chirurgo e avanzare fino alla smussatura è appena passato la trachea con l'ago come parallelo con la trachea possibile.
6. Rilasciare il petto appena prima della somministrazione del bolo diacido cloridrico per assicurare la dispersione e la deposizione nelle vie aeree distale e alveoli. Depositare il bolo in circa 0,5-0,75 s. Tenere l'ago nella trachea fino all'adozione il primo respiro spontaneo per assicurare che l'intero volume pregiudizio bolo viene inalato nei polmoni.
7. Chiudi incisione utilizzando sia 1 - 2 graffette cutanee o punti di sutura.

4. Recupero

1. Usando una siringa da 5 ml con un ago 26 G, iniettare 1 ml di SNS per via sottocutanea nella nuca del collo per rianimazione con fluidi. Anche se non vi è perdita di liquidi minima durante la procedura, dopo l'intervento il mouse tende a non bere e potenzialmente in grado di disidratarsi. In alternativa, fornire SNS tramite un'iniezione intraperitoneale.
2. Posizionare il mouse nella camera riscaldata a 37 ° C perfusi con 100% O _2. Assicurarsi che il mouse sia adeguatamente recuperato prima di essere rimesso in abitazioni. Monitorare gli animali e non lasciare incustoditi durante questo tempo fino ambulatoriale e completamente recovered.

5. lavaggio broncoalveolare e Lung Processing

1. Indurre e mantenere l'anestesia isoflurano come descritto al punto 2.1 e Step 2.2. Confermare un adeguato piano di anestesia utilizzando il metodo punta pizzico descritto al punto 2.2.
2. Fissare in posizione supina su un bordo dissezione e utilizzare un ciclo di 1-0 sutura di seta intrecciata agganciato incisivi superiori per estendere il collo. Applicare una pomata veterinario occhi per prevenire la secchezza.
3. Dopo aver rimosso le graffette di pelle di collo, fare una incisione longitudinale mediana attraverso la pelle dalla parete addominale inferiore attraverso la precedente incisione collo alla mandibola con le forbici.
4. Effettuare una incisione sulla linea mediana della muscolatura peritoneale con le forbici e ritrarre gli organi addominali con spugne per esporre lo spazio retroperitoneale. Se è necessario il sangue, raccogliere dall'aorta addominale o la vena cava inferiore a questo punto.
5. Eutanasia dell'animale mediante dissanguamento da sezionare il abdomdell'aorta inale e vena cava inferiore. Utilizzando una toracotomia bilaterale nel passaggio seguente un metodo di conferma secondaria dell'eutanasia sarà completata con umanità come stabilito dalle linee guida IACUC.
6. Perforare la membrana di causare il collasso del polmone. Quindi utilizzando osso forbici, tagliare la membrana e tagliare il gabbia toracica parallelo e su entrambi i lati dello sterno. Utilizzare un emostatico blocco per ritrarre il lembo sternale per facilitare l'iniezione di 5 ml di acqua calda (37 ° C) Soluzione salina bilanciata di Hank con calcio e magnesio nel ventricolo destro per irrigare il sistema vascolare polmonare.
   1. Come il sangue dall'aorta è ottenuta per valutare i livelli di citochine periferici prima della procedura descritta in questo documento, fare una piccola incisione nel ventricolo sinistro di fornire necessaria deflusso di sangue per lasciare la circolazione adeguata filo vascolare di polmone, se non il prelievo di sangue .
7. Prop la tavola di dissezione ad una pendenza di 60 ° e l'uso °procedimento e descritto al punto 2.2 per facilitare l'inserimento di un 20 G x ½ "cannula in acciaio inox nella trachea e sicuro con una sutura 1-0.
8. Posizionare la scheda dissezione in senso orizzontale ed eseguire un lavaggio broncoalveolare (BAL).
   1. Per eseguire la BAL collegare due siringhe 5 ml ad un rubinetto a 3 vie. Riempire una siringa con 5 ml di SNS e vite in porto di rubinetto. Collegare un vuoto siringa da 5 ml a una porta 2 ^° e infine collegare Port aperta del rubinetto per cannula intra-tracheale posizionato al punto 5.6. Instillare 1 ml di NS nei polmoni e lavanda con seconda siringa.
   2. Ripetere per 5 totale 1 instillazioni ml NS facendo attenzione che la cannula tracheale rimane protetto e parallelamente alla trachea in modo che non si strappa la trachea.
9. Per l'analisi istologica, cannulate la trachea, come nel passo 5.7. Fissare i polmoni insufflando con 10% formalina tamponata neutra a 20 cm H ₂ O per 24 h.
10. Rimuovere ciascun polmone lobo Carefully con le forbici e pinze da sezionare bronchi nei pressi del ilo. Posizionare ogni lobo polmonare (5 totale) in una cassetta istologia prima di essere inclusi in paraffina. Tagliare 5 micron sezioni di tessuto con un microtomo, e macchiare con ematossilina eosina utilizzando tecniche istologiche standard. ⁶ Morfometria può anche essere eseguite sui vetrini istologici per quantificare l'infiammazione severità. ⁴
11. Elaborare il BAL recuperato per centrifugazione a 1.500 xg per 3 min a 4 ° C. Aliquota il surnatante BAL privi di cellule in quantità equivalenti a 2,0 microprovette ml per analisi future. Conservare a -80 ° C.
12. Analizzare il BAL per concentrazione di albumina mediante ELISA, o qualsiasi altro prodotto biologico che interessa. ¹¹ Le cellule pellet dal BAL si contano, i campioni cytoslide generati, e colorati con macchie Wright-Giemsa-based per la determinazione bianco sangue conta differenziale delle cellule per valutare i polmoni 'reazione infiammatoria.

Risultati

Polmonare istopatologia del modello murino di acido polmonite

I topi sono stati feriti come descritto sopra e polmoni sono stati rimossi 24 ore dopo pH basso insulto, sezionati e H & E macchiati (Figura 1). cellule necrotiche, perdita di architettura del parenchima polmonare, cellule e detriti all'interno di spazi aerei e significative infiltrazioni PMN sono chiaramente rispettate. Simile all'aspirazi...

Discussione

L'obiettivo era quello di sviluppare un modello animale ALI utilizzando aspirazione acido gastrico che ricorda da vicino la fisiopatologia che si verifica negli esseri umani durante lo sviluppo di polmonite acido e successive ARDS. Nello sviluppo di un modello, abbiamo scelto una specie animale che offre alta l'acquisizione dei dati di throughput grazie al suo basso costo, ciclo riproduttivo breve, e un sistema immunitario ben compreso, con una grande varietà di strumenti di indagine (ad esempio,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
syringe, 1 cc	Becton Dickinson	309628
syringe, 5 cc	Becton Dickinson	309646
needle, 22 G x 1 1/2"	Becton Dickinson	305159
needle, 26 G x 1 1/2"	Becton Dickinson	305111
1-O Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	517730
3" Curved tissue serrated forceps	Fine Science Tools	11065-07
3" Curved tissue "toothed" forceps, 1 x 2 teeth	Fine Science Tools	11067-07
4" curved micro dissecting scissors	Fine Science Tools	14061-10
bone cutting spring scissors	Fine Science Tools	16144-13
3 1/2" curved locking hemostat	Fine Science Tools	13021-12
Disposable Skin Stapler	3M	DS-25
tracheal cannula (20 gauge x 1/2" stainless steal tubing adapter)	Becton Dickinson	408210
60-degree Incline Dissection Board
0.5% Bupivacaine
Isoflurane
Betadine and "Q-tip" cotton applicator