급성 폐 손상의 열기 기관 절개 위산 흡인 쥐 모델은 최대한 급성 치명적 폐 손상의 결과

요약

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

초록

산성 폐렴 인간 멸균 급성 폐 손상의 주요 원인이다. 산 폐렴은 증상에서 폐포 상피 세포와 혈관 내피 세포 모두에 급성 호흡 곤란 호중구 폐포에 의해 특징 증후군 (ARDS), 부상에 대한 임상 스펙트럼에 걸쳐있다. 임상 적, ARDS는 저산소증의 급성 발병, 양자 누덕 누덕 기운 폐 침윤과 비 심인성 폐부종에 의해 정의된다. 인간의 연구는 부하 메커니즘에 대한 다양한 가설을 주도하고있다 ARDS에 의한 폐의 생리 및 염증성 변화에 대한 유용한 정보를 우리에게 제공하고 있습니다. 불행히도, ARDS의 병인, 병태 생리학뿐만 아니라 다양한 결정 어려움 치료 전략의 개발에 유용 할 수있는 중요한 정보의 부족에서 초래했다.

자신의 발병 기전 및 병태 생리를 정확하게 reproduc 때 번역 동물 모델은 가치가있다EA의 개념은 모두 생체 외 및 임상에서 입증. 큰 동물 모델 (예, 양) 인간의기도 - 기관지 나무의 해부학의 주 특성, 쥐 모델을 포함한 다른 장점 호스트 할 수 있지만 : 저렴한 비용; 더 큰 데이터 수집에 짧은 생식주기 대출 자체를; 잘 이해 면역 시스템; 그리고 잘 특징 게놈 유전자 결실 형질 전환 균주의 다양한 가용성 선도. 낮은 pH에 의한 급성 호흡 곤란 증후군의 강력한 모델은 주로 폐포 상피 세포, 이차적으로 혈관 내피 세포뿐만 아니라 작은기도가 폐포에 이르는를 대상으로하는 쥐 ALI가 필요합니다. 또한, 다른 해로운 비 유해한 모욕 사이의 다양한 차이 재현 부상 중요하다.

염산을 사용하여 여기에 제시된 쥐 위산 흡인 모델은 오픈 기관 절개술을 사용하고 낮은 pH의 pneumon을 재생하는 병원성 시나리오를 재현인간의 Itis 에너지 부상. 또한,이 모델은 다른 유해한 폐 (예를 들어, 음식 입자 병원균) 엔티티와 낮은 pH 비방의 상호 작용을 조사 할 수있다.

서문

ARDS는 광범위한 폐의 염증을 특징으로 임상 저산소 혈증과 호흡의 급성 곤란으로 볼 수있다. 이러한 현상은 종종 외상, 패혈증, 수혈 관련 반응 또는 흡입과 같은 선동 이벤트 이후 미만 24 시간을 발생합니다. 그것은 폐포 상피 세포와 단백질 누설이어서 유리 모양의 막 형성으로 이어지는 혈관 내피 세포에 지역화 된 호중구 폐포 (즉, 광범위한 염증)에 의해 병리 조직 학적 특징이있다. 흡인은 화학적 폐렴이나 흡인 성 폐렴으로 분류된다. ¹ 위 흡인의 산성 성분은 이차 세균성 폐렴을 개발하기 위해 폐렴과 취향에 모두 기여한다. 흡인 성 폐렴은 알리와 ARDS의 후속 개발을위한 주요 위험 요인 중 하나입니다. ^이

위의 열망은 t에서 물질의 흡입으로 정의 급성 이벤트그는 또는 성대 이상으로기도에 인두 식물없이 위장. 흡 내용은 낮은 pH의 위액, 박테리아, 혈액, 또는 식품 입자를 포함 할 수있다. 위 흡인들은 일반적으로 공복 상태에 따라서 산성화 된 위 내용물의 흡인을 제한하는 프로톤 펌프 억제제에 배치되는 중환자 실 환자 (ICU)에서 발생합니다. 일반 환자 인구에 비해 5 배 이상 - 미국에서 ICU 인구에있는 ALI의 발생 빈도는 2.5입니다. ³ 불행히도, 이러한 선행 조건은 종종 위 흡인 보조 세균성 폐렴의 개발을위한 독립적 인 위험 인자로, 흡인 이벤트 다음 폐에 더 심각한 후유증을 초래할 수 위의 세균 증식의 상태로 (SBP)를 리드 , 알리와 ARDS.

염산과 위 내용물, 또는 세균이 포함되어 있지 않을 수도 있습니다 위 흡인 두 가지 주요 구성 요소가 있습니다식품 미립자. 설치류 모델에서 단독 위산 흡인의 산 성분은기도 상피의 낮은 pH를 직접 부식 손상의 결과로서, 초기 염증 반응을 생성한다. 6 시간 - 이는 호중구 침윤 및도 4에서의 염증 반응으로 이어진다. ^4이 두 가지 요인은 궁극적으로하여 폐포와기도에 유체 및 단백질의 혈관 외 유출로 이어지는 폐 미세 혈관 무결성의 파괴로 이어집니다. 이러한 병태 생리를 이해하고, 가능한 다른 치료 개입을 조사하기 위해서는 개발과 관련된 기전을 해명 동물 모델을 특성화하는 것이 중요하다. 산성 흡인 혼자 부피 또는 호흡 트리의 완충 능력을 무시하고 폐포에 도달하기 위해 충분히 낮은 pH를 함께해야합니다. 이것이 발생하지 않는다면, 오직 과도 상부 전도성기도 부상 ARDS의 심각한 후유증으로 이어질 가능성이있는 일어난다. ^{5 <}/ SUP>

정확하게 부상 폐포 상피 세포와 함께 흡입 이벤트를 에뮬레이트하기 위해, 동물의 자연 방어를 우회하는 것이 중요하다. 인간에서 본 위산 부상을 모방 ALI 생산 마우스 흡입 모델을 사용하여, 하나의 기관 - 기관지의 차이를 설명한다. 이 방법을 이용하여 오픈 기관 절개 기술은 모두 생리 학적 및 조직 학적으로 ALI를 재생하는 방식으로 쥐와 인간의 호흡기 나무와 모델 사이의 차이 부상을 무시합니다. 역사적으로, 기관 내 삽관은 그러나이 후두 손상없이 마우스에서 수행하는 것이 곤란 생각된다 ALI를 생성하기 위해 사용되었다. 따라서,이 방법은 여러 연구를 통해 최소한의 절차에 의한 사망률과 일치하는 결과를 산출 한 잠재적 인 대안을 제공합니다.

프로토콜

모든 재료와 장비는 수집 적절히 절차 이전에 구성 될 필요가있다. 절차는 일관 재현 데이터를 제공하기 위해 다음의 하나의 단계에서 원활한 전환하여 수행하여야한다. 이 프로토콜은 버팔로 재향 군인 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회가 설정 한 기관의 정책을 따릅니다.
참고 : 남성과 여성 모두 C57BL / 6 마우스는이 프로토콜을 사용 하였다. 성간 알부민 누설 유의 한 차이가 없다.

1. 염산 준비

1. 4.72 mL의 멸균 생리 식염수 (SNS)에 1 N 염산 281 μL를 추가하여 56.2 mM의 염산이 _{멸균합니다.} 1 N 염산 (- 50 μL ≈ 0)으로 pH 1.25로 적정한다.
2. 부상이 준비 신선한 이전합니다. 으로 낮은 pH SNS는 염산 부상 모욕은 일시적인 보장 버퍼링되지 않습니다.

2. 마취 및 기관 노출 기법

노트:부상 절차가 마취 가스 청소에 대한 숯 필터링 흄 후드에서 실시되어 있는지 확인합니다. 이것은 생존 수술이기 때문에 멸균 조건의 유지 관리는 필수적이다. 멸균 장갑을 사용하여 이전에 각 동물에 수술에 유리 구슬 수술기구 소독에있는 모든 악기를 소독. 수술 부위를 분리 커튼의 사용은 불임을 유지하도록 권장한다. 이 마취 빠른 유도뿐만 아니라 손상 후 빠른 회복을 허용하는 비교적 낮은 혈액 가스 용해도를 제공하기 때문에 마취 가스로 이소 플루 란을 사용한다.

1. 2 L / 분의 유량으로 산소를 2.75 %의 이소 플루 란 마취 챔버 내에 유도하여 시작한다.
2. 마우스가 적절하게 (피부에 휴식 또는 깊은 조직 손상을 유발하지 충분히 강한 핀치 발끝까지 응답) 마취되면, (60)에 앙와위에서 1-0 꼰 실크 봉합사의 15cm 길이 우수한 앞니로 마우스를 일시 중단 ^오 경사 절개 보드.
3. 있는지 확인 마취는 코 콘을 통해 이소 플루 란을 제공함으로써 수술을 통해 유지된다. 건조 함을 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의학 연고를 적용합니다.
4. 전기 트리머와 목의 복부 부분을 면도하고 국소 소독액 (즉, 포비돈 - 요오드)를 적용합니다. 거즈를 초과하는 방부제를 제거하고 건조하게 (~ 15-30들).
5. 100 μL 0.5 % bupivacaine을 함께 턱의 열등한 부분에 흉골 노치에서 목의 중간 선을 침투 (사전 수술 주변 및 수술 후 진통제를 제공하기 위해).
6. 메스 또는 곡선 미세 가위로 목에 1.5 cm 길이 방향의 중간 선 절개 - 1을 만듭니다. (흰색 연골 고리로 식별) 기관을 노출이 곡선 톱니 모양의 집게와 무딘 절개에 의한 타액선 사이의 근막 막을 침투.
7. 아직도 2 톱니 모양의 집게를 사용하여 뮤스 사이 해부 동안 paratracheal 근육의 한쪽을 잡고 옆으로 당겨기관에 길이 방향으로 다음 CLE 섬유.
8. 절개면이 확립되면, 집게의 제 쌍의 기관에 따라 작동되는 것과 paratracheal 근육 수축 계속한다. 포셉의 팁에 1-0 꼰 실크 봉합사의 15cm 가닥을 놓고기도 뒤에 봉합을 배치 이겨낼 이러한 집게를 사용합니다.

3. 인트라 기관 점적 절차

1. 염산 3.6 ㎖ / ㎏ 다음에 공기 0.2 mL로 22 G 바늘에 부착 된 0.5 ML의 주사기를 작성하여 부상 점안 주사기를 준비합니다. 공기는 마취 투여시 무기폐 후의 수도 이들 폐포에 대한 차량의 분산뿐만 아니라 치조골 채용 조종을 돕기 위해 작용할 것이다.
   주 : 수술 후 통증에 대한 지역 IACUC 지침에 따라 해당 지역의 수의사에게 문의하십시오. 고용하기 전에 항 염증 어떤 진통제 사용에 대한주의멸균 폐 손상의이 모델을 보내고.
2. 부상을 관리하려면 먼저 이소 플루 란 투여를 중단. 그것은 집게 발가락 핀치에 반응하기 시작 때까지 15 초 - 마우스의 마취 깊이는 약 10 상승 할 수 있습니다.
3. 바로 부상의 점안 단계를 시작합니다. 마취 깊이가 너무 깊은 경우 동물은 염산 포함 부상에 특히 사실이다 상해 점안 후에 자발적으로 호흡하지 않습니다.
4. 조수가 중요한 용량을 추방하기 위해 흉곽을 짜내 있습니다.
5. 우량 잡아 당겨 트랙션을 제공하고 1 ^차 및 2 ^차 후두 아래의 연골 고리 사이의 기관에 주사기 바늘을 삽입하는 기관 주위에 이전 배치 1-0 꼰 실크 봉합사를 사용합니다. 경사 그냥 가능한 기관과 병렬로 바늘 기관지나 때까지 바늘 경사는 외과 의사와 사전에 직면한다.
6. 단지의 일시 투여하기 전에 가슴을 해제말초기도 및 폐포로 분산 증착을 보장하기 위해 염산. 0.75의 - 약 0.5의 덩어리를 입금. 첫 번째 자발적 호흡이 전체 부상 러스 볼륨이 폐에 흡입 될 수 있도록 촬영 될 때까지 기관에서 바늘을 유지합니다.
7. 2 피부 스테이플 또는 봉합사 - 1을 사용하여 닫기 절개.

4. 복구

1. 26 G 바늘 5 ML의 주사기를 사용하여 유체 소생을위한 목의 목덜미에 피하 1 mL의 SNS를 주입. 수술 다음 절차를 수행하는 동안 최소한의 유체 손실을,이 있지만 마우스를 마시지하는 경향이 잠재적으로 탈수 할 수 있습니다. 또는, 복강 내 주사를 통해 SNS를 제공합니다.
2. 37 ° C에서 가열 챔버에 넣어 마우스는 100 % O ₂ 관류. 마우스가 적절하게 하우징에 다시 배치되기 전에 복구되어 있는지 확인합니다. 동물을 모니터링하고 외래 충분히 연구 할 때까지이 시간 동안 방치하지 않는다ecovered.

5. 기관지 세척 및 폐 처리

1. 유도 및 단계 2.1에 기재된 바와 같이 이소 플루 란 마취를 유지하고 2.2 단계. 단계 2.2에 설명 된 발가락 핀치 방법을 사용하여 마취의 적절한 비행기를 확인합니다.
2. 해부 보드에 부정사 위치에 안전하고 목을 확장하는 우수한 앞니에 걸려 1-0 꼰 실크 봉합사의 루프를 사용합니다. 건조 함을 방지하기 위해 눈에 수의학 연고를 적용합니다.
3. 목 피부 스테이플을 제거한 후, 가위로 하악에 이전 목 절개를 통해 하복부 벽으로부터 피부를 통해 중간 선 세로 절개를합니다.
4. 가위로 복막 근육의 정중선 절개를 확인하고 복막 공간을 노출하는 스폰지와 복부 장기를 철회. 혈액이 필요하다면,이 때의 복부 대동맥 또는 하대 정맥으로부터 수집한다.
5. abdom을에 병행하여 방혈을 통해 동물을 안락사원고 판 대동맥과 대정맥. IACUC 지침에 의해 설립에 따라 다음 단계에서 양측 개흉술을 이용하여 안락사의 보조 확증 방법은 인도적으로 완료됩니다.
6. 폐 붕괴를 야기 할 수있는 진동판을 관통. 그런 다음 다이어프램을 절단하고 및 흉골의 양쪽에있는 흉곽과 평행을 통해 절단 가위 절단 뼈를 사용. 폐 혈관을 세척하기 위해 우심실에 칼슘과 마그네슘 5 mL의 따뜻한 (37 ° C) 행크의 균형 소금 용액을 주입 용이하게하기 위해 흉골 플랩을 철회 잠금 지혈제를 사용합니다.
   1. 대동맥으로부터 혈액이 문서에서 기술 된 절차에 앞서 주변 사이토 카인 수준을 평가하기 위해 획득 될 때, 혈액은 혈액을 얻는 아니더라도 적절 플러시 폐 혈관을 순환을 남기는 좌심실에 작은 절개가 필요한 유출을 제공 할 수 있도록 .
7. 60 ° 경사에 해부 보드 소품과 번째 사용전자 절차는 1-0 봉합사로 20 G X ½ "스테인레스 스틸 기관의 정맥과 보안을 삽입 촉진하기 위해 단계 2.2에 설명.
8. 수평으로 절개 보드를 올려 놓고 기관지 세척액 (BAL)을 수행합니다.
   1. 기관지 폐포는 3 방향 스톱 콕 두 개의 5 ML의 주사기를 첨부 수행합니다. SNS의 5 mL를 하나의 주사기를 입력하고 꼭지의 포트에 나사. 2 ^{차 포트에} 빈 5 ML의 주사기를 연결하고 마지막 단계 5.6에 배치 내 기관 캐뉼라에 콕의 열린 포트에 연결합니다. 두 번째 주사기와 폐 세척에 NS 1 ㎖를 주입.
   2. 이 기관을 찢어지지 않도록 기관 캐 뉼러는 기관에 보안 및 병렬 유지 (5) 총 1 mL의 NS의 instillations이 조심 반복합니다.
9. 조직 학적 분석을 위해, 단계 5.7에서와 같이 기관을 cannulate. 24 시간 동안 20cm의 H ₂ O에서 10 % 중성 완충 포르말린으로 insufflating하여 폐를 수정합니다.
10. 각각의 폐 로브 caref를 제거ully 폐문 근처 기관지에 병행하여 가위와 집게를 사용. 이전 파라핀에 포함되는에 조직학 카세트의 각 폐 엽 (5 총)을 놓습니다. 마이크로톰으로 5 μm의 조직 섹션을 절단하고, 헤 마톡 실린 및 에오신 표준 조직 학적 기법을 이용하여 얼룩. ⁶ Morphometrics은 염증 정도를 정량화하는 조직 학적 슬라이드에 대해 수행 될 수있다. ⁴
11. 4 ° C에서 3 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리하여 회수 된 BAL을 처리합니다. 미래 분석을위한 2.0 ML의의 microcentrifuge 튜브에 해당하는 양의 무 세포 BAL의 상층 액을 나누어지는. -80 ° C에서 보관하십시오.
12. 알부민 ELISA에 의해 농도, 또는 관심의 다른 생물학적 제품에 대한 BAL을 분석합니다. 기관지 폐포 ¹¹ 펠렛 세포 카운트 cytoslide 표본 생성, 폐 '를 평가하는 백혈구 세포 미분 계수 결정 용 라이트 - 김사 기반 염색을 할 수있다염증 반응.

결과

산성 흡인 폐렴 모델 쥐의 폐 조직 병리학

상기와 폐, 24 시간 후 낮은 pH의 모욕을 제거 절단 및 H & E (그림 1) 염색으로 마우스가 부상을 당했다. 괴사 세포, 폐 실질의 구조, 세포 파편 공극 내에서 상당한 PMN 침투의 손실이 명확하게 관찰된다. 임상 적 흡인과 마찬가지로, 고르지 PMN 침윤 및 단백질 섬유소 침착 영...

토론

대물 밀접 산성 폐렴 이후 ARDS 개발 중에 인체에서 발생하는 병리 유사한 위산 흡인을 이용하여 ALI 동물 모델을 개발 하였다. 모델을 개발, 우리는 인해 저렴한 비용, 짧은 생식주기 및 조사 도구 (즉, 단일 클론 항체, 유전자 변형)의 풍부한 잘 이해 면역 시스템에 높은 처리량 데이터 수집을 제공하는 동물 종을 선택했다.

ALI 인간 caustically 손상 혈청 단백질의 누출...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
syringe, 1 cc	Becton Dickinson	309628
syringe, 5 cc	Becton Dickinson	309646
needle, 22 G x 1 1/2"	Becton Dickinson	305159
needle, 26 G x 1 1/2"	Becton Dickinson	305111
1-O Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	517730
3" Curved tissue serrated forceps	Fine Science Tools	11065-07
3" Curved tissue "toothed" forceps, 1 x 2 teeth	Fine Science Tools	11067-07
4" curved micro dissecting scissors	Fine Science Tools	14061-10
bone cutting spring scissors	Fine Science Tools	16144-13
3 1/2" curved locking hemostat	Fine Science Tools	13021-12
Disposable Skin Stapler	3M	DS-25
tracheal cannula (20 gauge x 1/2" stainless steal tubing adapter)	Becton Dickinson	408210
60-degree Incline Dissection Board
0.5% Bupivacaine
Isoflurane
Betadine and "Q-tip" cotton applicator