Hybrid-Cut: Un metodo sezionamento migliorato per Recalcitrante tessuti vegetali Campioni

Riepilogo

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Abstract

Mantenere l'integrità sezione di impianto è fondamentale per lo studio delle strutture anatomiche dettagliate al cellulare, tissutale, o addirittura a livello di organi. Tuttavia, alcune cellule vegetali hanno pareti cellulari rigide, fibre dure e cristalli (ossalato di calcio, silice, ecc), e alto contenuto di acqua che spesso distruggono l'integrità del tessuto durante il sezionamento tessuto vegetale.

Questo studio stabilisce un metodo semplice di sezionamento del tessuto Hybrid-Cut. Questo protocollo modifica una tecnica di sezionamento a base di paraffina e migliora l'integrità di sezioni di tessuto di piante differenti. tessuti vegetali sono stati inclusi in paraffina prima di sezionamento in un criostato a -16 ° C. Sezionamento a basse temperature irrigidito l'blocchi di paraffina, ridotta lacrimazione e graffianti, e una migliore integrità dei tessuti in modo significativo. Questo protocollo è stato applicato con successo al calcio tessuti orchidea Phalaenopsis ricchi di ossalato, nonché tessuti recalcitranti, come orga riproduttivans e foglie di riso, mais e grano. Inoltre, l'alta qualità di sezioni di tessuto da Hybrid-Cut potrebbe essere utilizzato in combinazione con ibridazione in situ (ISH) fornire modelli di espressione spaziale di geni di interesse. In conclusione, questo protocollo è particolarmente utile per tessuti vegetali recalcitrante contenente alto cristallo o contenuto di silice. sezioni di tessuto di buona qualità permettono studi biologici morfologici e altri.

Introduzione

Il metodo sezionamento a base di paraffina è una tecnica largamente usata per studi anatomici. Conservazione di anatomia tessuto intatto è importante per gli studi morfologici e biologici. La tecnica di sezionamento incluso in paraffina è vantaggioso perché paraffina-embedding conserva cellule e dei tessuti morfologia. Inoltre, i blocchi di paraffina possono essere immagazzinati convenientemente per lunghi periodi di tempo. Tuttavia, sezionamento inclusi in paraffina non è adatto per tessuti vegetali contenenti cristalli intracellulari. I cristalli all'interno delle cellule spesso strappano nastri di paraffina e l'integrità dei tessuti danni durante il sezionamento.

A differenza di sezionamento paraffina, criosezionamento è relativamente veloce e sezioni può essere ottenuto senza fissazione, disidratazione serial o mezzo di inclusione infiltrazione ^1. Criosezioni sono compatibili con molte applicazioni, come l'immunoistochimica, ibridazione in situ, e l'enzima istochimica. L'altro vantaggio di criosezionamento èche questo metodo non passa attraverso un potenziale di processi di denaturazione quali temperatura elevata e trattamenti chimici, le molecole in modo cellulari sono ben conservati all'interno delle sezioni di tessuto ^2. Criosezionamento è generalmente preferiti a base di paraffina sezionamento per studi in tessuti animali. Tuttavia, criosezionamento non è la prima scelta in piante perché la temperatura di congelamento volte provoca la formazione di cristalli di ghiaccio che influenzano la qualità di integrità sezione. Anche se osmoregulation quali soluzioni di saccarosio, glicole polietilenico (PEG), o glicerolo ³ sono stati riportati per ridurre la formazione di cristalli di ghiaccio in condizioni di congelamento, il miglioramento è meno che ottimale.

Per adattarsi a diversi ambienti, piante diverse hanno spesso distinte cellule trama del tessuto e vegetali si sono evoluti in modo da formare pareti rigide cellulari, fibre dure e cristalli ^4,5. Ad esempio, cristalli di ossalato di calcio insolubile e corpi di silice sono abbastanza comuni inpiante ^6. Corpi di silicato / cristalli sono stati segnalati per aiutare a mantenere l'architettura dell'impianto, erectness, e prevenire le malattie o parassiti in piante di cereali ^7-9.

Le orchidee in vaso e di mercato orchidea fiori recisi è fiorente, ed è un settore in crescita. Phalaenopsis (falena orchidea) è uno dei più importanti di esportazione piante ornamentali in Taiwan. Notevoli sforzi sono stati fatti per comprendere i cambiamenti morfologici e fisiologici dei processi di fioritura di orchidee Phalaenopsis. Picchi floreali di orchidee Phalaenopsis sono avviate da gemme ascellari alla base delle foglie. Dopo un periodo di temperatura ambiente fresco (circa un mese e mezzo), gemme ascellari ingrandire, rompere dormienza, e sporgono dalla base foglia di trasformarsi in giovani punte floreali. Per capire il fisiologico, cellulare, e processi molecolari di picco iniziazione, è necessario sviluppare un robusto tecnica anatomica visuatessuti Lize o marcatori in modo tempestivo. Tuttavia, la presenza di cristalli onnipresenti nei tessuti orchidea, particolarmente in gemme ascellari, rende il lavoro anatomica difficile.

Qui abbiamo cercato di migliorare la sezione integrità dei tessuti vegetali recalcitranti che sono stati considerati finora tecnicamente impegnativo. Qui vi mostriamo un miglioramento del protocollo chiamato Hybrid-Cut. Si tratta di un metodo di sezionamento a base di paraffina che viene eseguita utilizzando un criostato. incorporamento paraffina risolve elevato contenuto di acqua nei tessuti vegetali. Sezionamento a basse temperature indurisce il blocco di paraffina, riduce cristallo lacrimazione problema, e migliora in modo significativo l'integrità dei tessuti. Questo protocollo migliora notevolmente l'integrità dei tessuti per i campioni di piante recalcitranti.

Protocollo

1. Fissazione e Embedding

1. preparazione dei reagenti
   1. salina 10x fosfato-tamponata (PBS)
      1. Aggiungere 80 g di NaCl, KCl 2 g, 14,4 g di Na ₂ HPO _4, e 2,4 g KH ₂ PO ₄ in 800 ml di acqua bidistillata (DDH ₂ O) e regolare il pH a 7,4 con HCl. Aggiungere DDH ₂ O per un volume totale di 1 L, quindi aggiungere 1000 ml dietilpirocarbonato (DEPC) e agitare vigorosamente. Conservare PBS notte a temperatura ambiente e in autoclave a 121 ° C per 20 min del giorno successivo.
   2. 1x PBS
      1. Diluire lo stock 10x PBS a rapporto 1:10 in DDH ₂ O per ottenere una concentrazione finale di 0,01 M Na ₂ HPO _4, 0,002 M KH ₂ PO _4, 0,003 M KCl, e 0,13 M di NaCl.
   3. Paraformaldeide (PFA) fissativo
      Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Preparare sotto una cappa aspirante. Indossare i guanti.
      1. Per preparare 250 ml PFA fissativo, riscaldare 100ml 1x PBS a 70 - 80 ° C e aggiungere 1.750 ml di NaOH. Quindi aggiungere 10 g di paraformaldeide e mescolare accuratamente fino alla dissoluzione. Posizionare la soluzione su ghiaccio e poi regolare il pH a 7,2 con H ₂ SO ₄ (260 - 270 ml per 100 ml) dopo il raffreddamento.
      2. Regolare il volume a 250 ml con PBS 1x, aggiungere 625 microlitri glutaraldeide ad una concentrazione finale di 0,25%. Aggiungere 250 microlitri Triton X-100 e 250 microlitri Tween 20 per facilitare l'infiltrazione del fissativo.
         NOTA: Il fissativo PFA può essere conservato a 4 ° C per un mese, senza perdere la sua capacità di fissaggio.
   4. Preparare diverse concentrazioni di etanolo (30%, 50%, 70%, 85%, e il 95%) con acqua DEPC-trattata.
2. raccolta dei campioni delle piante
   1. gemme ascellari
      1. Utilizzare maturi piante di orchidea Phalaenopsis in fase di quadrifoglio. Rimuovere con cura le foglie strappando la foglia in seguito alla nervatura centrale con le mani.
      2. Utilizzare un bisturi affilato per Carefrimuovere ully gemme ascellari dalla base della terza o quarta foglia sul gambo monopodial.
   2. campione del seme
      1. Raccolto maturi baccelli del seme orchidea a 4 mesi dopo l'impollinazione. Tagliare baccelli del seme longitudinalmente con un bisturi. Agitare il baccello del seme di apertura delicatamente e rilasciare i semi secchi su carta da filtro.
   3. Protocorm
      1. Seminare orchidee maturi su un 1 / 2x Murashige e Skoog piastra di agar, e crescere in un ambiente di coltura tissutale in un periodo di 12 ore di luce e temperatura costante di 25 ° C. Assaggiate protocorm verde a 7 settimane dopo la semina.
   4. corpi Protocorm-like (PLB)
      1. Grow PLBs orchidea su T2 rigenerante piastre di agar come descritto in precedenza ¹⁰ e posto sotto le stesse condizioni di crescita, come nel passo 1.2.3.1. Raccogliere 10 PLBs ad un'altezza di 5 - 8 mm.
   5. campione foglia
      1. Raccogliere il tessuto foglia da un maturo pianta di orchidea Phalaenopsis come descritto al punto1.2.1.1.
      2. Utilizzare un bisturi affilato per tagliare un piccolo pezzo di tessuto fogliare (7 mm Larghezza di lunghezza x 5 mm) dalla seconda foglia di nuova concezione.
   6. campione di Root
      1. Utilizzando lo stesso impianto descritto nel passaggio 1.2.1.1, sezionare 1 cm di lunghezza del tessuto punta della radice con un bisturi affilato.
   7. Giovane picco
      1. Utilizzare un bisturi affilato per tagliare il tessuto giovane picco dalla parte di punta del fiore gambo 10 cm di lunghezza.
   8. Germoglio
      1. Asportare un piccolo bocciolo di fiore di 5 mm di diametro da stelo orchidea. Tagliare parte del tessuto bocciolo di fiore longitudinalmente (3 mm di spessore).
   9. tessuti fogliari e tessuti Spikelet di cereali
      1. Tagliare 1 centimetro foglia lunghezza tessuto lama dalle prime foglie di nuova concezione da piante di riso, grano e mais.
      2. Raccogliere 10 spighette da piante (riso, frumento e mais) un giorno prima antesi.
3. Fissazione
   1. Fissare campioni vegetali immediatamente il loro trasferimento in un flaconcino di vetro scintillazione contenente 15 ml ghiacciata fissativo PFA.
   2. Applicare il vuoto (~ 720 millimetri Hg) di campioni di piante in un locale fresco 4 ° C. Tenere il vuoto per 15 - 20 min (piccole bolle dovrebbero essere rilasciati dai campioni). Ripetere questa operazione fino a quando la maggior parte dei tessuti caduta dopo il rilascio del vuoto. Mantenere il vuoto per una notte e rilasciare il vuoto lentamente il giorno successivo.
4. Disidratazione
   NOTA: Utilizzare lo stesso flacone dalla fissazione con i punti di infiltrazione. Versare o utilizzare una pipetta per lo scarico della soluzione nel passaggio precedente e sostituire con 15 ml di soluzione nel flaconcino. A seconda della struttura dei tessuti, trattare tessuti duri come germoglio orchidea ascellare, seme, protocorm e PLB, e la spighetta di riso, grano, mais e per un tempo più lungo; trattare i tessuti più morbidi come orchidea bocciolo di fiore, giovane punta, foglia e radice, e la foglia di riso, grano, mais e per un tempo più breve.
   1. Dopo la fissazione, immergere il campione in 15 ml 1x PBS per 10 min in ghiaccio.
      1. Disidratare campioni in serie etanolo 15 ml a temperatura ambiente come segue: 30% di etanolo per 30 min, 50% di etanolo per 30 min, 70% di etanolo per 1 ora, 85% di etanolo per 54 min per i tessuti duri e 30 min per i tessuti morbidi, 95% di etanolo per 54 min per i tessuti duri e 30 min per i tessuti morbidi e 100% etanolo due volte per 54 min per i tessuti duri e 30 min per i tessuti morbidi.
         NOTA: campioni vegetali possono essere conservati in etanolo al 70% a 4 ° C per diversi mesi.
5. infiltrazione di paraffina
   1. Infiltrati campioni con 15 ml di etanolo e xilene miscela sostituto per 54 min ciascuno per tessuti duri e 30 min per i tessuti morbidi, a temperatura ambiente come segue: etanolo / sostituto di xilene (2: 1, v / v), etanolo / sostituto di xilene (1 : 1, v / v), sostituto etanolo / xilene (1: 2, v / v), e puro sostituto di xilene due volte. Attenzione: xilene è tossico. Fare questo passo nella cappa.
   2. Infiltrati campione nella fiala con 15 ml di xilene sostituto e la miscela di paraffina in stufa a 60 ° C, overnight per i tessuti duri, e per 60 min per i tessuti morbidi come segue: sostituto di xilene / paraffina (2: 1, v / v), xilene sostituto / paraffina (1: 1, v / v), e sostituto di xilene / paraffina (1: 2, v / v).
   3. Infiltrati campione con 15 ml paraffina pura due volte al giorno e incubare a 60 ° C in un forno.
   4. Ripetere il punto 1.5.3 il giorno successivo.
6. Tissue incorporamento
   1. Inserire la tensione del tessuto incorporamento centro 1 ora in anticipo per sciogliere la cera nel serbatoio di paraffina prima di incorporare tessuti in un blocco di paraffina.
   2. Riscaldare gli stampi in metallo (dimensioni della base 3,3 centimetri di larghezza di lunghezza x 2 cm) sul vassoio di riscaldamento a 62 ° C, e versare circa 13 ml di cera fusa nella base stampo.
   3. Trasferire un campione di tessuto dalla sezione 1.5.4 nello stampo con una pinza riscaldate e orientarlo nella posizione desiderata.
   4. Spostare lo stamposul piatto freddo con attenzione, e lasciare che la cera si solidifica.

2. tessuto sezionamento

1. Metodo di sezionamento paraffina
   1. Effettuare una base di cera inserendo una cassetta incorporamento sulla parte superiore di uno stampo (stesse dimensioni nella sezione 1.6.2), riempire con cera fusa e rimuovere lo stampo dopo la cera è solidificato.
      NOTA: La cassetta embedding formerà una base di cera per ancorare il blocco del campione di paraffina.
   2. Tagliare il blocco di paraffina in una forma e dimensioni adeguate, e mettere alcuni pezzi di cera su una spatola piatta. Riscaldare i pezzi di cera utilizzando un bruciatore di alcol fino a quando la cera si scioglie e quindi inserire la cera fusa sulla base di cera al punto 2.1.1 di aderire al blocco. Fissare nel microtomo.
   3. Inserire una nuova lama sul microtomo, e regolare l'angolo di 5 gradi per facilitare il taglio nel microtomo.
   4. Tagliare il blocco di paraffina campione a fettine sottili (10 micron), come descritto in precedenza ^11.
   5. Hybrid-Cut metodo sezionamento
      1. Tagliare il blocco di paraffina campione dal punto 1.6.4 a una colonna con una superficie trapezoidale nella parte superiore per una dimensione appropriata utilizzando una lama di rasoio.
      2. Aggiungete un po 'ottimale composto da taglio temperatura (OCT) al centro della scena criostato. Fissare il blocco di paraffina alla fase criostato e quindi orientare rapidamente il blocco di tessuto nella posizione desiderata.
      3. Trasferire la paraffina blocco / palco per una camera criostato. Consentire di Office per solidificare sulla barra di congelamento rapido a -42 ° C per 10 min. Non spostare il blocco durante la solidificazione di OCT (Figura 2C).
      4. Lasciare l'adattatore criostato e temperatura della camera di raffreddare fino a -20 ° C e -16 ° C, rispettivamente, prima di fissare la paraffina blocco / palco per l'adattatore criostato. tessuti Sezione a 10 micron di spessore.
      5. Raccogliere sezioni di tessuto con una pinza. Float sezioni di acqua DEPC trattati con 800 ml in un poli - L - coa lisinaTed scivolo e trasferire le diapositive su un piatto caldo a 42 ° C.
      6. Lasciare le sezioni per appiattire su acqua DEPC trattati a 42 ° C. Utilizzare carta filtro per drenare l'acqua dal bordo.
      7. tessuto Montare sulla slitta, ponendo il vetrino su una piastra calda a 42 ° C durante la notte.

   3. Tessuto di colorazione

   1. Sparaffinatura
      1. Raccogliere le diapositive dalla piastra calda e metterli in un rack colorazione. Aggiungere 150 ml di xilene in una vaschetta di colorazione in cappa e immergere il rack in xilene per 5 min.
   2. reidratazione
      1. Preparare diverse concentrazioni di soluzioni di etanolo (100%, 95%, 70%, 50% e 30%) in acqua trattata con DEPC e riempire 150 ml di soluzione in distinte vaschette di colorazione, rispettivamente.
      2. Reidratare i campioni attraverso una serie di diminuire la concentrazione di etanolo, ogni passaggio per 3 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini nella colorazione cremagliera un vaso ad un altro barattolo contenente dLe concentrazioni di etanolo ifferent: 100% di etanolo, 95% di etanolo, 70% di etanolo, 50% di etanolo e 30% di etanolo.
      3. Dopo la reidratazione, immergere gli esemplari in DDH ₂ O per 3 min.
   3. ematossilina colorazione
      1. campioni di tessuto Stain di immergendo i vetrini di tessuto in soluzione ematossilina per 1,5 min.
      2. Sciacquare brevemente in DDH ₂ O contenente 1 - 2 gocce di 12 N di acido cloridrico (HCl) per alcuni secondi, e poi lavare brevemente in DDH ₂ O.
   4. Disidratazione
      1. Disidratare i campioni attraverso una serie di concentrazioni crescenti di etanolo per 3 minuti a temperatura ambiente: 30% etanolo, 50% etanolo, 70% etanolo, 95% etanolo e 100% etanolo. Cancellare i campioni con xilene nella cappa per 5 min.
   5. Montaggio
      1. Goccia opportunamente 600 ml di mezzo di montaggio a base di xilene sulla diapositiva. Posizionare con cura un vetrino sopra il campione. Evitare bolle d'aria che formano per ottenere immagini di buona qualità.
      2. Lasciare i vetrini all'aria secca durante la notte. Osservare il campione al microscopio il giorno successivo.
         Nota: Le immagini sono state catturate a 25X a 400X di ingrandimento a seconda delle dimensioni degli esemplari.

   4. In Situ Ibridazione

   1. sintesi della sonda
      1. Clone di Phalaenopsis actina gene specifico codifica sequenza usando primer 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'e 5'-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' (per ottenere 242 bp PCR amplicone) e CyclinB1; 1 gene specifico sequenza codificante utilizzando primer 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 ' e 5'-ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 '(per ottenere 327 bp dell'amplicone PCR) come descritto ^12.
      2. Legare le sequenze codificanti specifici in vettori (ad esempio, pGEMT) secondo il protocollo del produttore.
      3. Genera digossigenina (DIG) etichettato sonde senso e antisenso usando SP6 / T7 DIG RNA kit di etichettatura secondo le istruzioni del produttoreS.
   2. In ibridazione in situ
      1. Tagliare il 2 ^° e 3 ^° fette di tessuto ascellare gemma (10 micron di spessore) generati utilizzando il metodo ibrido-Cut, e montare le fette su vetrino rivestito.
      2. Deparaffinare sezioni di tessuto in xilene (vedi 3.1.1), reidratare in concentrazioni decrescenti di etanolo (vedi 3.2.2), e digerire con 2 mg / ml proteinasi K a 37 ° C per 30 min.
      3. Eseguire ibridazione in situ secondo il protocollo precedentemente descritto ^11,13 con alcune modifiche, cioè, con la temperatura di ibridazione per actina come 59 ° C e 60 ° C per CyclinB1;. 1 ibridazione scorrevole con sonda RNA DIG marcato 40 ng.
      4. Utilizzare soluzione nitroblu tetrazolio / 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT / BCIP) per rilevare segnali di ibridazione come descritto ^11.

Risultati

Hybrid-Cut Migliora l'integrità del tessuto Sezioni

Capire l'anatomia della struttura floreale riproduttiva è importante per indagare il meccanismo alla base di fiore iniziazione orchidee. Tuttavia, l'accumulo di cristalli di ossalato di calcio intracellulare in orchidee Phalaenopsis rende tali studi un compito impegnativo. Per aggirare i problemi connessi con strappo causato da cristalli durante la procedura di taglio (figura 1), abbiamo sviluppato un sistema che abbiamo chiamato Hybrid-Cut. Questo protocollo combina le tecniche di paraffina e cryosection tradizionali. In primo luogo abbiamo testato Hybrid-Cut in gemme ascellari di orchidea Phalaenopsis, perché sono noti per la rigidità dei tessuti e ad alto contenuto di cristallo. tessuto gemma ascellare è stato fissato nel 4% PFA (vedi protocollo, passo 1.3). Dopo la disidratazione etanolo di serie e di paraffina i ceranfiltration, la gemma ascellare è stato incorporato in un blocco di paraffina. Il blocco è stato tagliato ad una dimensione adatta prima sezionamento (Figura 2A). Una piccola quantità di PTOM è stata poi applicata al centro della scena criostato (Figura 2B). Il blocco di paraffina è stato poi aderito alla fase tramite ottobre Lo stadio è stato incubato in un criostato per 10 minuti per permettere la completa solidificazione del PTOM prima della sezionamento (Figura 2C) e poi cryosection è stata eseguita in un -16 Camera ° C (Figura 2D).

A titolo di confronto, un blocco di paraffina contenente una gemma ascellare di orchidea Phalaenopsis è stato sottoposto a regolare sezionamento microtomo. Come mostrato in figura 1A, grave lacerazione dei nastri di paraffina è stata osservata dopo sezionamento microtomo. L'integrità del tessuto e struttura cellulare è stata compromessa anche (Figura 1B). Hybrid-Cut, d'altra parte,sezioni prodotte intatte di tessuto (Figura 3A) con preservata l'integrità strutturale (Figura 3B).

Applicazione della tecnologia Hybrid-Cut di vari tessuti di P. Afrodite

Per testare ulteriormente la riconducibilità di Hybrid-Cut, abbiamo testato diversi tessuti del orchidee Phalaenopsis. E 'spesso difficile ottenere sezioni di semi con buona integrità del tessuto a causa dei tegumenti induriti. Usando questo protocollo, le strutture dettagliate di semi sono stati conservati dopo sezionamento (Figura 4A). Come mostrato nella Figura 4A, corpi di proteine, i prodotti di storage comuni ^14, potrebbero essere chiaramente identificati. Hybrid-Cut anche lavorato con successo e ha mostrato le strutture dettagliate del meristema germoglio apicale di un mese, vecchio protocorm (la struttura germinato da un seme) (Figura 4B) eprotocorm-come-corpi (PLB, Figura 4C). I cristalli intracellulari sono stati osservati nelle sezioni di orchidee PLB. Phalaenopsis hanno foglie spesse e succulente e che svolgono Fotosintesi CAM (CAM) di tipo fotosintesi ^15. La sezione trasversale della lamina fogliare ha mostrato grandi cellule del mesofillo e fasci vascolari contenenti xilema e floema (Figura 4D). Sono state osservate poche aperture stomatiche sulla superficie del foglio abaxial durante il giorno (Figura 4D). In realtà, le piante CAM si sono evoluti per massimizzare il guadagno di carbonio, ma allo stesso tempo ridurre al minimo la perdita di acqua, aprendo i loro stomi nella notte in condizioni aride ^15,16. La radice meristema apicale di P. Afrodite è mostrato nella figura 4E. Le cellule radicolare sembravano contenere un numero significativo di cristalli, che erano molto ben conservati dopo sezionamento (figura 4E). Sezioni longitudinali di giovani punte floreali forniti informatione sull'architettura di giovani primordiali floreali (Figura 4F). Inoltre, sepali, petali, labello, e polliniche potrebbero essere chiaramente identificati dalla sezione longitudinale di giovani boccioli di fiori che hanno completato la differenziazione in questo 5 millimetri fiore gemma (Figura 4G). Si noti che i cristalli sono stati accumulati nei sepali di giovani germogli floreali. In breve, questo protocollo lavora costantemente per mantenere l'integrità dei tessuti e produce morfologia intatto consentendo studi cellulari anatomici e possibili.

Hybrid-Cut Mantiene Tissue Integrità nei cereali colture

Abbiamo anche testato Hybrid-Cut su colture di cereali come il riso, grano e mais che contengono alto contenuto di silice ^17,18. Come mostrato in Figura 5, l'integrità del tessuto delle sezioni trasversali di riso, frumento e foglie di mais sono stati significativamente migliorata dalla HyBrid-Cut metodo. cellule Xylem, floema, le cellule del mesofillo, stomi, e bulliform che controllano rotolamento della lamina fogliare per evitare la perdita di acqua sono stati chiaramente identificati da sezioni di foglie di riso. L'anatomia Kranz, le cellule del mesofillo e fasci vascolari della foglia di mais ^19,20 sono stati chiaramente identificati. E 'stato interessante trovare una alta densità di stomi su entrambi i lati adaxial e Abaxial di foglie di mais (Figura 5). Il rapporto tra stomi adaxial e abaxial di 0,7 nel mais è stato riportato in precedenza ^21. Inoltre, questo protocollo anche lavorato con successo per fornire la morfologia cellulare dettagliata di spighette da riso, frumento e mais (Figura 6). Spighette sono noti per contenere abbondante di silice ^9. Normalmente, che provoca difficoltà nella conduzione di sezionamento dei tessuti.

Ibridazione in situ

genomica e trascrittomica approcci sono comunemente usati per annotare le funzioni dei geni. Fornire distribuzione spaziale dei trascritti dei geni di interesse in contesti di sviluppo o ambientali è importante aggiungere una nuova visione delle possibili funzioni dei geni. Ibridazione in situ (ISH) è stato sviluppato per localizzare modelli di espressione genica a livello tissutale ^{11, 22-25.} Inoltre, ISH può fornire cellulare, e in alcuni casi sub-cellulare, la risoluzione della distribuzione mRNA in organismi multicellulari ^26. Durante ISH, RNA e l'integrità dei tessuti è essenziale per ottenere informazioni spaziali affidabili sul trascrizione selezionato. Abbiamo testato ISH utilizzando il protocollo Hybrid-Cut gene actina (PATC157348) è stato clonato usando primer 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'e 5'-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' per ottenere 242 bp PCR amplicone ciclina B1:.. 1 (PATC146999) gene specifico sequenza codificante utilizzando primer 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 'E 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3' per ottenere 327 bp amplicone PCR. Dopo ISH, actina e ciclina B1: 1 espressione genica è stata monitorata in giovani e mature gemme ascellari (Figura 7). Entrambi i geni sono stati espressi in cellule meristematiche di 2 ^° e 3 ^rd gemme ascellari, con segnali più forti rilevati in 3 ^rd gemme ascellari. Questi risultati hanno dimostrato che Hybrid-Cut mantenere buona anatomia e fornire spaziale pattern di espressione genica.

Figura 1: sezione di paraffina tradizionale Cause strappo grave di tessuto Un blocco di paraffina contenente una gemma ascellare di orchidea Phalaenopsis è stato sottoposto a regolare il sezionamento microtomo.. Strappo grave dei nastri di paraffina è stata osservata dopo tradizionale sezionamento microtomo (A) . L'integrità del tessuto e struttura cellulare è stata anche compromesse (B). Le frecce mostrano la grave lacerazione della fetta tessuti. Arrowhead mostra i corpi di cristallo. Barra della scala di 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2:. Hybrid-Cut sezionamento Metodo Un tessuto ascellare gemma è stato fissato in PFA e tessuti sono stati disidratati, infiltrati con cera di paraffina, e annegato in un blocco di paraffina. Il blocco di paraffina è stata tagliata per una dimensione appropriata (A). Optimal compound taglio temperatura (OCT) è stato applicato al centro della scena criostato (B). Il blocco di paraffina è stata allegata al ottobre sul palco criostato. Sotto bassa temperatura, il blocco di paraffina è stato aderito alla fase criostato tramite OCT (C). Fette di tessuto sono stati sezionati nella camera criostato a -16 ° C (D). Barre di scala rappresentano 0,5 cm (A), e 1 cm (BD). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Hybrid-Cut Migliora sezione Integrità Un blocco di paraffina contenente una gemma ascellare di orchidea Phalaenopsis è stato sottoposto a Hybrid-Cut sezionamento (A) e il metodo di Hybrid-Cut prodotta sezioni con l'integrità del tessuto eccellente (B).. La freccia mostra i corpi di cristallo endogeni incorporati nel tessuto ascellari nascere. barra della scala di 100 micron.rget = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Applicazione di Hybrid-tagliate in diverse sezioni di tessuto di orchidea Phalaenopsis orchidea diverso. tessuti sono stati sezionati con il metodo Hybrid-Cut, ad esempio la sezione longitudinale del seme orchidea durante la fase matura (A), sezione longitudinale di protocorm (B), sezione longitudinale dei corpi protocorm-like (PLB) (C), sezione trasversale lamina fogliare (D), sezione longitudinale della radice (e), sezione longitudinale di giovane fiore spike (F), e la sezione longitudinale di gemme a fiore giovani (G). Le sezioni di tessuto sono state colorate con ematossilina. SC, tegumento; PB, il corpo di proteine; M,meristem; MP, madre PLB; DP, figlia PLB; Ad, superficie fogliare adaxial; Ab, superficie fogliare abaxial; St, stomi; MC, cellule mesophyll; VB, fascio vascolare; RC, cap radice; fb, bocciolo di fiore; Se, sepal; Pe, petalo; La, labello; Po, polliniche; Ro, rostello; Ca, callo. Punte di freccia mostrano cristalli. Barre di scala rappresentano 20 micron (AE) e 200 micron (FG). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5:. Hybrid-Cut Mantiene Foglia Tissue Integrità nei Diverse colture di cereali Confronto di tessuto fogliare con il metodo tradizionale di paraffina (pannello di sinistra) e la tecnica ibrida-Cut sviluppato in questo studio (pannello di destra). Le immagini mostrano foglia sezioni trasversali di riso, grano, mais e. MC, cellule mesophyll; Ph, floema; St, stomi; AC, bu cell lliform. Le frecce mostrano la lacerazione della fetta tessuti. Punte di freccia mostrano corpi di silice. I blu tratteggiata cerchi indicano Kranz anatomia nel mais C4. Scala bar 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6:. Hybrid-Cut Mantiene Spikelet Tissue Integrità nei Diverse colture di cereali Confronto di integrità dei tessuti delle sezioni spikelet tra i metodi di paraffina e Hybrid-Cut tradizionali. Le frecce mostrano la lacerazione della fetta tessuti. Punte di freccia indicano corpi di silice. Scala bar 20 micron (riso), e 200 micron (frumento e mais). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: ibridazione in situ di actina e CyclinB1; 1 modelli di espressione nella ascellare Gemma di orchidea Phalaenopsis fette di ^tessuto, del ^RD ascellari bocciolo 2 ^° gemme ascellari e 3 sono stati preparati con il metodo Hybrid-Cut.. Un totale di 40 ng di actina e CyclinB1; 1 sonda di scavo marcati sono stati utilizzati per l'ibridazione. La sonda senso è stato utilizzato come controllo negativo. Le frecce indicano il meristema riproduttiva della gemma ascellare. Scala bar 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Le cellule vegetali hanno pareti rigide cellulari, fibre dure, cristalli, e alto contenuto di acqua che causano problemi di strappo dei tessuti durante il sezionamento tessuto vegetale. Anche se sezionamento a base di paraffina viene spesso utilizzato per tessuti vegetali, i cristalli endogeni spesso lacerare il tessuto vegetale durante sezionamento (Figura 1). A causa del contenuto intrinsecamente di acqua alta all'interno delle cellule vegetali, sezionamento criostato a base spesso induce le cellule rotte e sezioni di tessuto incrinate.

Nel presente studio, un combinato di paraffina-embedding e cryosection protocollo chiamato Hybrid-Cut è stato sviluppato e sezioni di tessuto di buona qualità sono stati ottenuti. Questo protocollo risolve il problema connesso con alto contenuto di acqua introducendo paraffina, e riduce l'effetto di strappo da indurimento paraffina a bassa temperatura durante sezionamento (Figura 3). Pertanto, questo protocollo modificato è vantaggioso su entrambi i sectio a base di paraffinaning o criosezionamento per preservare l'integrità dei tessuti della pianta.

Questo manoscritto dimostra che il metodo Hybrid-Cut preserva l'integrità dei tessuti in molti tessuti di orchidea Phalaenopsis, come gemma ascellare, seme, e PLB, ecc che contengono alti livelli di cristalli (figure 3-4). Inoltre, questo protocollo è suscettibile di cereali quali organi riproduttivi e foglie di riso, mais e grano che contengono alto contenuto di silice (figure 5-6). Presumibilmente, questo protocollo può essere applicato alle piante legnose contenenti alto contenuto di fibra.

In generale, il tessuto di fissaggio è completamente molto importante per la Hybrid-Cut. Abbiamo scoperto che l'acido formaldeide-alcol-acido (FAA) fissativo è meglio di PFA per preservare l'integrità dei tessuti di alcuni tessuti recalcitranti, come gemme assialmente, radici, ecc, tuttavia, PFA funziona meglio di FAA nel preservare l'integrità dell'RNA. Pertanto PFA si consiglia di fissarecampione per l'ibridazione in situ di lavoro (ISH). Il protocollo qui descritto è progettato per l'esperimento RNA ISH. Pertanto, tutti i reagenti sono stati preparati per evitare la degradazione dell'RNA eliminando la contaminazione RNasi dal trattamento DEPC. Se la sezione ibrida-Cut è per studi anatomici, osmosi inversa acqua normale (RO) e il suo tampone o reagenti derivati ​​sono accettabili.

Riduzione delle dimensioni del campione e lo spessore di meno di 3 mm è utile per l'infiltrazione. Inoltre, aumentando il tempo di immersione per la disidratazione e l'infiltrazione sono necessarie per i tessuti trama duri. Limitazione di questo protocollo potrebbe a causa di problemi causati dalla fissazione inadeguata, la disidratazione, e l'infiltrazione di campione. Pertanto, la regolazione del tempo di elaborazione per ogni passaggio è fondamentale per la produzione di blocco di paraffina di buona qualità. Normalmente, il tessuto più duro ha bisogno di più tempo di elaborazione rispetto al tessuto più morbido.

Inoltre, abbiamo dimostrato che Hybrid-Cut lavorato con successo in combinazione with ISH per fornire la distribuzione spaziale dei trascritti selezionati (Figura 7). In sintesi, questo protocollo è utile per lo studio dell'anatomia vegetale e fornisce una mappa RNA tessuto-specifica dei geni selezionati. Inoltre, può essere applicato ad altri studi molecolari come saggio terminale deossinucleotidil transferasi dUTP nick etichettatura estremità (TUNEL), ibridazione in situ fluorescente (FISH), e le tecniche di immunoistochimica. In conclusione, questo miglioramento protocollo tessuto sezionamento è sia utile e disponibile per i ricercatori in comunità vegetali.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Embedding Center model EC780-1	CSA
Microtome model RM2255	Leica
Cryostat model CM 1950	Leica
Axio Scope A1 microscope	Zeiss
Murashige & Skoog medium including vitamins	Duchefa Biochemia	M0222.0050
RNase free surface decontaminant	Apex	10-228
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Bio Basic Inc.	D801154
Sodium chloride (NaCl)	MDBio, Inc.	101-7647-14-5
Potassium chloride, crystal (KCl)	J.T. Baker	7447-40-7
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	7778-77-0
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	16005
Sodium hydroxide (NaOH)	Showa	19430160
Sulfuric acid (H2SO4)	Sigma-Aldrich	7664-93-9
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	111-30-8
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20)	J.T. Baker	9005-64-5
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100)	J.T. Baker	9002-93-1
Glass scintillation vials	Newastar	DG60805-00020
Desiccator vacuum	Violet Bioscience Inc.	TS-402030
Rotary vane pump RZ2.5	Vacuubrand	36149406
Ethanol	J.T. Baker	64-17-5
Sub-X	Leica Surgipath	3803670	Xylene substitute
Paraplast Plus	Leica Surgipath	39602004	Tissue embedding paraffin
SUPERFROST micro slide glass	Matsunami	S7441
FSC 22 Clear	Leica Surgipath	3801480	Optimal Cutting Temperature compound (OCT)
Xylenes, Purified	Leica Surgipath	3803665
Hematoxylin	Merck	HX305311
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma-Aldrich	7647-01-0
Micromount	Leica Surgipath	3801731	Mounting medium
pGEM T-easy vector	Promega	A1360
Proteinase K	Roche	3115879001
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit	Roche	11175025910
NBT/BCIP stock solution	Roche	11681451001