L&#39;impiego di<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imaging Whole-organo e quantitativa Istologia del tessuto per determinare la Bio-distribuzione delle molecole fluorescente

Riepilogo

Ex vivo di imaging intero organo è un metodo rapido per determinare le concentrazioni relative dei composti fluorescente all'interno e tra tessuti o gruppi di trattamento. Al contrario, la fluorescenza istologia quantitativa, mentre più alta intensità di lavoro, consente la quantificazione dei livelli tissutali assoluti di molecole marcate.

Abstract

Etichettatura fluorescente è un processo ben consolidato per esaminare il destino di molecole marcate sotto una varietà di condizioni sperimentali sia in vitro che in vivo. sonde fluorescenti sono particolarmente utile per determinare la bio-distribuzione di grandi molecole somministrate, in cui è improbabile che possa influenzare la cinetica o biodistribuzione del composto l'aggiunta di una etichetta fluorescente piccola molecola. Una varietà di metodi esistenti per esaminare la biodistribuzione che variano in modo significativo la quantità di sforzo richiesto e se le misurazioni risultanti sono pienamente quantitativa, ma utilizzando diversi metodi in combinazione può fornire un sistema rapido ed efficace per analizzare bio-distribuzioni.

Ex vivo di imaging intero organo è un metodo che può essere utilizzato per confrontare rapidamente le concentrazioni relative di molecole fluorescenti all'interno dei tessuti e tra i diversi tipi di tessuti o gruppi di trattamento. L'utilizzo di un plat di imagingmodulo progettato per live-animale o di imaging intero organo, fluorescenza all'interno dei tessuti intatti può essere determinata come tali, risparmiando tempo e lavoro, fornendo un quadro preciso della bio-distribuzione complessiva. Questo processo è ideale in esperimenti tentano di determinare la specificità tissutale di un composto o per il confronto delle molteplici composti diversi. Quantitative istologia tessuto invece richiede una ulteriore elaborazione dei tessuti al fine di creare una misura quantitativa dei composti marcati. Per valutare in modo accurato bio-distribuzione, tutti i tessuti di interesse devono essere tagliati, la scansione, e analizzati relativi alle curve standard per fare confronti tra tessuti o gruppi. Quantitative istologico del tessuto è il gold standard per determinare le concentrazioni di composti assolute all'interno dei tessuti.

Qui, descriviamo come entrambi i metodi possono essere utilizzati insieme in modo efficace per valutare la capacità dei diversi metodi di gestione aND modifiche composti di indirizzare e fornire molecole fluorescente al sistema nervoso centrale ^1.

Introduzione

etichettatura fluorescente è un metodo semplice ed efficace utilizzato per determinare la biodistribuzione di composti, utilizzando una serie di apparecchiature che è comune a molti laboratori. Fluorofori sono ampiamente disponibili, relativamente poco costoso, e sono disponibili in una varietà di lunghezze d'onda, in modo tale che più etichettato molecole possono essere utilizzati contemporaneamente senza interferenze. La maggior parte dei fluorofori hanno una gamma di chimiche per coniugazione a diversi gruppi reattivi sui composti bersaglio, e il processo di coniugazione è generalmente semplice per la maggior parte dei siti reattivi. Inoltre, le attrezzature necessarie per le misure di composti fluorescente sono comuni in molti laboratori. microscopi a fluorescenza, imager e scanner di diapositive possono essere utilizzati in diverse circostanze, rendendo l'uso di marcatura fluorescente altamente accessibile. Etichette fluorescenti vengono spesso utilizzati per determinare la biodistribuzione e cinetica di composti sia in vivo ed ex vivO con dispositivi di imaging in tempo reale, come la Spectrum IVIS Imager, e di istologia del tessuto quantitativa ^2,3.

L'utilizzo di ex vivo di imaging intero organo utilizzando dispositivi di imaging dal vivo è aumentata nel corso del tempo a causa della loro facilità d'uso e la capacità di creare rapidamente un confronto accurato delle relative concentrazioni di composti etichettati senza richiedere l'ulteriore trattamento dei tissues4. Tuttavia, mentre ex vivo di imaging intero organo può consentire una facile analisi e confronto, non genera una misura quantitativa della concentrazione di composti assolute all'interno di un tessuto. Ciò è dovuto ad effetti di dispersione della luce all'interno organi intatti. Dal momento che la dispersione della luce (e, in misura minore, assorbanza) varia in base alle dimensioni del tessuto e la densità, l'imaging intero organo può sottovalutare livelli tissutali di organi di grandi dimensioni o densi. La formulazione di standard adeguati per misure della concentrazione assolute è anche difficile perché si deve imitare lo spessoree la densità di ogni singolo organo. D'altra parte, imaging intero organo è un metodo rapido per ottenere i livelli tissutali relativi di un agente, ed è ideale per confrontare la relativa biodistribuzione del correlata più molecole (ad esempio in studi di droga targeting). Una strategia alternativa è quella di utilizzare istologia fluorescenza quantitativa, una tecnica derivata dal metodo di autoradiografia quantitativa, per ottenere livelli tissutali assoluti di un agente di test ^5,6. Piuttosto che inserire un intero animale o di un organo in un dispositivo di immaginazione, l'istologia del tessuto quantitativa richiede che ogni tessuto essere affettato, montate su slitte, digitalizzati e analizzati singolarmente. Standards dell'agente di prova sono preparati e tagliati allo stesso spessore dei campioni di organi. Tagliando tutti gli organi e standard per lo stesso spessore, variabilità dovuta alla dispersione della luce o l'assorbanza viene eliminato, e l'intensità di fluorescenza del tessuto può essere in forma alla curva standard per determinare concent assolutarazione. Anche se questo metodo, se fatto correttamente, è quantitativa, è anche ad alta intensità di manodopera e facilmente maltrattato. Data la natura più complessa di istologia quantitativa e significativamente maggiore costo del lavoro rispetto all'imaging intero organo, diventa utile esaminare dove ogni processo è più pratico da utilizzare quando esame della biodistribuzione di composti fluorescente. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come questi metodi possono essere utilizzati insieme per confrontare efficacemente la biodistribuzione di rodamina marcato elastina come polipeptide (PEL), con o senza aggiunta di peptidi cellule penetrante SynB1 o Tat, tramite intranasale (IN) e (iv) vie di somministrazione per via endovenosa.

Protocollo

NOTA: Tutti gli usi degli animali in questo protocollo è stato approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della University of Mississippi Medical Center.

1. Il trattamento degli animali e tessuti

1. Amministrazione e sacrificio
   1. Anestetizzare gli animali utilizzando 3% isoflurano per 5 minuti e verificare la profondità dell'anestesia osservando l'assenza del riflesso toe-pinch. Applicare una pomata veterinaria agli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
   2. Pesare l'animale e pipetta 50 mg / kg la dose di entrambi rodamina marcato ELP, SynB1-ELP, o Tat-ELP in una provetta da 1,5 mL. Salva 100 ml di composti marcati somministrati per la formulazione delle curve standard in fasi successive.
      Nota: È importante che norme siano rese dallo stesso lotto di proteina marcata somministrata agli animali per evitare differenze dovute a variazioni di efficienza marcatura fluorescente. Al fine di rimuovere correttamente FLUORES sfondoscenza da misure di fluorescenza più tardi, un animale non trattato deve essere sacrificato utilizzando gli stessi metodi / reagenti come gli animali trattati.
   3. Somministrare una iniezione IV come descritto in precedenza ¹ utilizzando la vena della coda o la vena femorale (a cui si accede tramite un 1 cm incisione inguinale). Per analgesia, se fare una incisione inguinale, somministrare per via sottocutanea carprofen alla dose di 5 mg / kg, e applicare Sensorcaine al sito di incisione prima della chiusura con una clip ferita. Per amministrare per via intranasale (IN), collocare l'animale in posizione supina.
   4. Usando una pipetta 2 ml, elaborare un calo di 1 ml di prodotto marcato. Brevemente scorrere testa dell'animale dal collare anestesia per consentire l'accesso alle narici.
   5. Posizionare la punta della pipetta per l'apertura di un singolo nare e premere lentamente lo stantuffo, permettendo la goccia di scorrere al nare nella cavità nasale. Ripetere ogni 1 min, alternando narici ogni goccia fino a quando l'intera dose è annuncioservito.
      Nota: Il volume massimo somministrato attraverso IN non deve superare i 10 - 15 ml per i topi.
   6. Lasciare gli animali in posizione supina in anestesia per 10 minuti dopo la somministrazione finale prima di ogni movimento in una gabbia individuale.
      Nota: non lasciare gli animali incustoditi fino a che non hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
   7. 1 ora dopo la somministrazione, ri-anestetizzare gli animali come prima e sacrificare tramite perfusione transcardial utilizzando PBS (210.0 mg / L KH ₂ PO _4, 9,000.0 mg / L di NaCl, 726 mg / L di Na ₂ HPO ₄ 7H ₂ O) 10 ml / min per un totale di 20 ml.
      Nota: la perfusione degli animali al sacrificio per rimuovere tutto il sangue dai tessuti è necessaria per determinare le concentrazioni extravascolare dei composti marcati. reagenti perfusione possono causare modifiche a fluorescenza di fondo e devono essere mantenute coerenti. Il metodo di sacrificio deve essere coerenteall'interno dei gruppi. Diversi metodi di sacrificio può provocare diversi livelli di sangue all'interno del sistema vascolare, cambiando la fluorescenza dei tessuti sfondo.
2. Collezione di tessuti
   1. Preparare PBS come descritto sopra per il risciacquo dei tessuti prelevati.
      Nota: Se un altro tampone è stato utilizzato come liquido di perfusione, lavare tessuti nello stesso tampone.
   2. Rimuovere il cuore, i polmoni, stomaco, fegato, milza, reni e per semplice dissezione. In breve risciacquo in PBS prima di utilizzare salviette laboratorio di pat secco o liberano dal umidità in eccesso e mettendo i tessuti sul tappeto di imaging.
   3. Decapitare il mouse e rimuovere la parte superiore del cranio con frese ossee o Rongeurs. Utilizzando pinze, rimuovere con attenzione il cervello, mantenendo intatte le bulbi olfattivi. Risciacquare, asciugare, e posizionarlo sul tappeto di immagini fornite.
   4. Per rimuovere il midollo spinale attraverso una rapida espulsione ^7, riempire una siringa da 10 mL con PBS e inserire un ago 18-gauge smussate.
      Nota: 18 si adatta a scartamentol'adulto canale spinale di molte linee del mouse. Il diametro richiesto varierà con la dimensione animale.
   5. Posto l'animale in posizione prona, garantendo che l'apertura del canale spinale nel sito decapitazione è nettamente tagliata e priva di sangue.
   6. Rimuovere la pelle attorno alla colonna vertebrale. Utilizzando frese ossee affilate o forbici, tagliare la colonna vertebrale nella sezione lombare direttamente rostrale ai fianchi.
   7. Brevemente risciacquare con PBS per visualizzare il canale spinale. inserire delicatamente l'ago nel canale spinale.
      Nota: L'ago dovrebbe sentirsi comodo e può richiedere un po 'lento rotolamento avanti e indietro durante l'inserimento. Nel caso l'ago sentirsi sciolto, un taglio più rostrale può essere fatta o potrebbe essere necessario un ago di diametro maggiore.
   8. Utilizzando il pollice e l'indice, applicare pressione alla colonna vertebrale intorno all'ago inserita. Premere il pistone con una pressione moderata e costante. Il midollo spinale viene espulso fuori intatta dell'apertura rostrale del midollocolonna.
      Nota: La rimozione completa, risciacquo, asciugatura e di tutti i principali organi possono essere ragionevolmente completati in 5 - 7 min. Questo breve tempo evita la necessità di stoccaggio prolungato in PBS, che potrebbe comportare un'eccessiva esposizione alla luce e la lisciviazione di proteine ​​marcate dal tessuto.

2. Tutta-organo Ex Vivo imaging di fluorescenza

1. parametri di imaging
   1. Avviare il software di acquisizione delle immagini. In basso a destra del pannello di controllo di acquisizione, fai clic su "inizializzare".
   2. In "modalità di imaging", selezionare la casella di controllo "fluorescenti". In "tempo di esposizione", selezionare "AUTO".
   3. In "binning," selezionare "piccolo" e impostare la F / Stop per 2.
   4. Selezionare l'eccitazione 535 nm e filtri di emissione 580 nm.
      Nota: Questo può variare a seconda della etichetta utilizzata.
   5. Selezionare "Campo visivo B" e impostare il targealtezza t a 0,3 cm.
      Nota: Questo può variare a seconda dei tessuti da acquisire.
   6. Quando l'indicatore di temperatura diventa verde (cioè la macchina è completamente inizializzato), posizionare i tessuti sullo sfondo nero opaco disponibile, assicurando che i tessuti sono completamente separati gli uni dagli altri. Posizionare il tappetino nel imager, assicurando che tutti i tessuti sono all'interno della griglia area selezionata. tessuti maggiore e non omogenei, come il fegato intero, devono essere disposti in modo da ridurre la sovrapposizione dei lobi.
      Nota: I tessuti possono essere disposti in un unico gruppo, permettendo un'immagine ad accogliere un singolo animale o tutti i tessuti di tipo simile. Questo rende l'analisi e l'organizzazione più facile in seguito. Se grandi differenze di intensità di fluorescenza sono presenti tra vari tessuti, è meglio immagine singolarmente o come gruppi dello stesso tipo di tessuto, come un unico tempo di esposizione non può essere ideale per tutte le intensità dei tessuti.
   7. Fai clic su "Acquisire".
   8. Dopo l'imaging, rimuovere i tessuti immediatamente e memorizzare o congelarli per l'istologia quantitativa, come indicato al punto 4.

3. Norme e Image Processing

1. Standards
   1. In PBS, creare diluizioni doppie seriali di ciascuna proteina utilizzata nel trattamento degli animali, a partire dalla concentrazione originale, con un totale di 15 diluizioni.
      Nota: L'intervallo di concentrazione dovrebbero includere le concentrazioni tissutali attesi e può richiedere ulteriori diluizioni del campione originale, a seconda della concentrazione iniziale.
   2. Dispensare 100 ml di ogni standard in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti nero. Includere un pozzetto di pura PBS per ottenere una misura di fluorescenza di fondo.
   3. Immagine norme, con gli stessi parametri utilizzati per la imaging dei tessuti.
   4. Nel software di acquisizione delle immagini "tavolozza degli strumenti" sotto "Strumenti ROI", selezionare la "regione di interesse (ROI) "Cerchio e disegnare il ROI circa un bene. Ricevuto il ROI a tutti gli altri pozzi pieni e cliccare "misurare il ROI."
   5. Sottrarre il valore medio efficienza radiante del puro PBS dai valori delle altre norme; Ciò elimina la fluorescenza di fondo. Tracciare i valori contro la concentrazione nota su un diagramma a dispersione.
      Nota: L'equazione risultante della linea di tendenza lineare può quindi essere utilizzato per calcolare il valore di fluorescenza relativa.
2. Elaborazione immagini
   1. Nel software di acquisizione delle immagini, selezionare lo strumento ROI a mano libera e disegnare ROI attorno a ciascuna delle singole tessuti. Fai clic su "misura".
   2. Con le misurazioni efficienza radianti medi risultanti, sottrarre i valori misurati dal animale trattata per ogni tipo di tessuto e tracciare quei valori sulla curva standard creato in precedenza.
      Nota: I valori di fluorescenza relativi risultanti forniscono una fotografia istantanea rapida e precisa delbiodistribuzione del composto marcato.

4. Istologia tessuto Quantitative

1. Preparazione e congelamento dei tessuti per affettare
   1. Creare o acquistare contenitori di dimensioni sufficienti per congelare i tessuti scelti e criostato da utilizzare. Avvolgendo un foglio di alluminio intorno ad un oggetto di dimensioni adeguate e sagomato funziona bene.
   2. Preparare una miscela di isopropanolo e ghiaccio secco riempiendo metà di un bicchiere da 500 mL con ghiaccio secco e aggiungendo ~ 350 ml di isopropanolo in modo che vi sia sufficiente liquido sopra il ghiaccio secco per immergere parzialmente il contenitore di congelamento.
      Nota: L'azoto liquido spesso provoca la frattura del composto ottimale temperatura di taglio (OCT), e tessuti incorporati e dovrebbe essere evitato.
   3. Riempire il contenitore di congelamento parziale con Office, assicurando che non vi siano bolle presenti. Se ci sono bolle, lavorare le bolle di soluzione con una pinza o un simile attrezzo.
   4. Rimuovere il tessutoda PBS e asciugare accuratamente, sia tamponando delicatamente con un laboratorio wipe o toccando i bordi dei tessuti delicati a un laboratorio di pulire e permettendo il liquido per favorire la.
   5. Posizionare il tessuto delicatamente PTOM all'interno del contenitore congelamento, garantendo non introdurre bolle sotto il tessuto. Una volta che il tessuto è a posto, aggiungere ottobre finché il tessuto è completamente coperto.
   6. Immergere il contenitore congelamento per quanto è possibile senza che il isopropanolo a venire a contatto con i PTOM esposto all'interno del contenitore. Attendere 30 - 90 s (o potenzialmente più per i tessuti più grandi) per Office e tessuti di congelare completamente prima della conservazione a -80 ° C per il tempo necessario.
2. Preparazione degli standard per affettare.
   1. Preparare e opportunamente etichetta 1 mL siringhe monouso rimuovendo la fine della canna, in modo tale che l'intera lunghezza della siringa è un diametro. Ciò consentirà il cilindro congelato per essere spinto in seguito.
   2. Noiing Office, creare un 15-fase di diluizione seriale duplice di composti somministrati, come è stato fatto con PBS in precedenza, ma con un volume risultante finale di 1 ml. Includere un campione di pura ottobre per la rimozione di sfondo valori di fluorescenza.
   3. La viscosità dell'OCT rende adeguata miscelazione difficile. Invertire i tubi e consentire di Office per risolvere completamente prima di invertire di nuovo. Ripetere questo 10 - 20 volte per garantire una miscela uniforme. Conservare le soluzioni standard a 4 ° C e al riparo dalla luce durante la miscelazione.
   4. Dopo la miscelazione, ancora preparare una miscela di isopropanolo e ghiaccio secco, come prima.
      Nota: L'azoto liquido può anche essere usato al posto della miscela di ghiaccio isopropanolo / lavaggio, a condizione che le siringhe sono rapidamente rimossi dopo che sono congelati solido.
   5. Disegnare lo standard ottobre nella siringa, avendo cura di introdurre il minor numero possibile di bolle. Dopo aver disegnato la soluzione di Office, immergere immediatamente la siringa direttamente nel isopropanolo e consentire la soluzione di congelare completamenteall'interno della siringa per 10 - 20 s. Conservare le siringhe a -80 ° C per il tempo necessario.
3. Taglio di tessuti e Standards
   1. Posizionare entrambi i tessuti e gli standard a -20 ° C e lasciare il tempo sufficiente per tutti i campioni a temperatura.
      Nota: La temperatura di taglio ideale cade generalmente intorno al -10 ° C gamma per la maggior parte dei tessuti, ma dipende in definitiva dimensioni del tessuto e grassi e deve essere raffinato empiricamente.
   2. Utilizzando un criostato, tagliare i tessuti nel 20 micron fette spesse e montarli su vetrini, come descritto in precedenza ^8. Conservare i vetrini a -20 ° C e tenerli lontani dalla luce il più possibile durante il taglio e fino scansione.
      Nota: È importante che le sezioni da misurare sono distribuiti opportunamente tutto lo spessore del tessuto.
   3. Per montare le norme sul mandrino criostato, prendere la siringa dal congelatore e riscaldare l'esterno per 3 - 5 s di Holding in mano. Spingere lo stantuffo fino un breve tratto (~ 1 cm) del cilindro PTOM di fuori della siringa.
      1. Usando una lametta, tagliare attraverso il cilindro e posizionare la sezione cilindro risultante perpendicolarmente sulla mandrino, utilizzando Office per tenerlo in posizione. Questa configurazione dovrebbe tradursi in ambienti ben definiti da tagliare.
   4. Tagliare i cilindri a 20 micron, mettendo una fetta da ciascuna diluizione su una singola diapositiva, in modo che una diapositiva rappresenta l'intera curva standard. Conservare i vetrini a -20 ° C fino al momento per la scansione.
4. La scansione e quantificazione
   1. Avviare il software matrice di scansione e cliccare su "543 laser" per iniziare la procedura di avvio del laser. Attendere 15 minuti per il laser per essere pronti.
   2. Una volta che il laser è pronto, rimuovere i vetrini da -20 ° C e spostarli in un grande contenitore, protetta dalla luce raggiungono la temperatura ed asciugare per 3 min. Questo impedisce l'accumulo di umidità nel slide scanner.
   3. Caricare la slitta nella presa scorrevole sullo scanner diapositiva. Fai clic su "Scan" e selezionare "Esegui scansione facile".
   4. Impostare la risoluzione di scansione di 50 micron.
   5. Selezionare la prima casella di controllo "Use" sotto "Fluoroforo" e selezionare "TRITC." Impostare il guadagno PMT al 80%.
      Nota: Le impostazioni variano a seconda del fluoroforo e la concentrazione delle molecole marcate.
   6. Sul lato sinistro, in modo che l'area di scansione comprende l'intera diapositiva. Fai clic su "Start".
   7. Dopo la scansione, selezionare "file" e "salva con nome", e quindi salvare l'immagine come tif.
      Nota: Le diapositive di tessuti e standard dovrebbero essere analizzati sulle stesse impostazioni.
   8. Caricare le immagini risultanti in ImageJ e selezionare ROI intorno i tessuti e gli standard. Nella scheda "analizzare", selezionare "impostare le misure" e selezionare "valore medio grigio." Click220; misura ".
      Nota: Come con la tecnica precedente, fluorescenza di fondo deve essere sottratto da tutti i valori misurati.
   9. Tracciare le misure medie valore di grigio alle norme contro la concentrazione nota per creare una curva standard.
      Nota: Le misurazioni risultanti dai tessuti devono essere mediate all'interno di ogni tessuto e tracciati su quella curva standard per determinare la concentrazione nel tessuto.

Risultati

I dati che seguono descrivono la consegna di tre composti: un vettore somministrazione di farmaci nota come ELP e due versioni di ELP modificato con peptidi cellula-penetranti (SynB1-ELP e Tat-ELP) ^9. Tutti e tre i composti sono stati etichettati con tetramethylrhodamine-5-maleimmide e consegnati attraverso due vie di somministrazione (IN e IV). Lo scopo di questi esperimenti era determinare quali composto e via di somministrazione comporterebbe la migliore penetrazione nel sistema nervoso centrale (CNS)

Discussione

Mentre ex vivo di imaging intero organo è generalmente semplice, l'adesione ad alcuni concetti e tecniche di base può migliorare la precisione delle misure di bio-distribuzione. lunghezze d'onda corte di esperienza luce un alto grado di dispersione e di assorbanza nella maggior parte dei tessuti, che in modo significativo l'impatto l'utilità del fluorofori a breve lunghezza d'onda. Questi fluorofori hanno limitato l'applicazione negli studi profondo dei tessuti, ma sono stati utilizza...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)	Thermo Fisher	T6027, A20342	Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling
Phosphate Buffered Saline	Sigma	1002243569	PBS Buffer for rinsing
Optimal Cutting Temperature Compound	Tissue-Tek	4585	Used for freezing and mounting
Equipment
IVIS Spectrum	Perkin Elmer		For ex vivo whole organ imaging
Cryomicrotome	Thermo		For cryosectioning
Fluorescence slide scanner	Perkin Elmer		For slide scanning