の用法<em&gt; ex vivoで</em&gt;全体の臓器イメージングと定量的組織組織学は、蛍光標識分子のバイオ分布を決定します

要約

エキソビボ全臓器のイメージングは、内および組織または治療群間で蛍光標識された化合物の相対濃度を決定するための迅速な方法です。逆に、蛍光組織学、定量的には、より労働集約しながら、標識された分子の絶対的な組織レベルの定量化を可能にします。

要約

蛍光標識は、 インビトロおよびインビボの両方の実験様々な条件下で標識された分子の運命を調べるための十分に確立されたプロセスです。蛍光プローブは、低分子の蛍光標識の付加は、反応速度や化合物の生体分布に影響を与えにくい投与巨大分子の生体内分布を決定する際に特に有用です。種々の方法は、必要な作業の量で、得られた測定値は完全に定量的であるが、一緒に複数の方法を使用して生体分布を分析するための迅速かつ効果的なシステムを提供することができるかどうかを著しく変化生体内分布を調べるために存在します。

エキソビボ全器官イメージングを迅速組織内および組織または処置群の複数の種類の間で蛍光分子の相対濃度を比較するために使用することができる方法です。イメージングPLATを使用生きた動物または全臓器のイメージングのために設計されたフォームは、無傷の組織内の蛍光は、全体的な生体分布の正確な画像を提供しながら、時間と労力を節約し、さらに処理することなく決定することができます。このプロセスは、化合物または複数の異なる化合物を比較するための組織特異性を決定しようとする実験に理想的です。一方、定量的組織の組織像は、標識化合物の定量的尺度を作成するために、組織の大規模な更なる処理を必要とします。正確に生体内分布を評価するために、関心のあるすべての組織が、スライススキャンされ、組織やグループ間の比較を行うために標準曲線と比較して分析する必要があります。定量的組織の組織学は、組織内の絶対化合物濃度を決定するためのゴールドスタンダードです。

ここでは、両方の方法は、異なる投与方法の能力を評価するために一緒に有効に使用することができる方法を説明しますND化合物の変更は、中枢神経系¹に蛍光標識分子を標的とし、提供します。

概要

蛍光標識は、多くの研究室に共通の装置の範囲を使用して、化合物の生体分布を決定するために容易に利用され、効果的な方法です。フルオロフォアは、比較的安価で広く入手可能であり、かつ複数の標識分子が干渉することなく同時に使用することができるような種々の波長を、来ます。ほとんどのフルオロフォアは、標的化合物上の異なる反応基への結合のための化学の範囲を持っている、および結合のプロセスは、反応部位のほとんどのタイプのため、一般的に簡単です。さらに、蛍光標識された化合物の測定に必要な機器は、多くのラボで共通しています。蛍光顕微鏡、イメージャ、およびスライドスキャナはすべて非常にアクセス可能な蛍光標識を利用して、さまざまな状況で使用することができます。蛍光標識は、しばしば、インビボおよびエクスビボVIV両方の化合物の生体分布および動態を決定するために使用されますこのようなIVISスペクトラムイメージャーなどのライブイメージングデバイス、とO、および定量的な組織の組織学^2,3によって。

ライブ画像化装置を用いてエクスビボ全臓器のイメージングの使用は、使用および迅速tissues4のさらなる処理を必要とせずに標識された化合物の相対濃度の正確な比較を作成することが容易に経時的に増加しています。 ex vivoで全臓器イメージングは簡単に分析し、比較を可能にすることができますしながら、しかし、それは組織内の絶対化合物濃度の定量的尺度を生成しません。これは、無傷の臓器内の光散乱効果によるものです。光散乱（及び、より少ない程度に、吸光度）が組織の大きさや密度によって変化するため、全体の臓器イメージングは​​、大規模または高密度の器官における組織レベルを過小評価することができます。 1の厚さを模倣する必要があるため、絶対濃度測定のための適切な基準を策定することも困難です各個々の器官の密度。一方、全臓器造影剤の相対的な組織レベルを得る迅速な方法であり、（例えば、薬物標的化の研究のように）多数の関連分子の相対的な生体分布を比較するために理想的です。別の戦略は、定量的な蛍光組織学、定量的オートラジオグラフィーの方法に由来する技術を利用する試験薬剤^5,6の絶対的な組織レベルを得ることです。むしろ想像デバイスに動物全体または器官を配置するよりも、定量的な組織の組織学は、各組織が、スライスされたスライド上に載せ、スキャンされ、個別に分析されている必要があります。試験物質の標準を調製し、臓器サンプルと同じ厚さにスライスします。同じ厚さに全ての器官および標準を切断することにより、光の散乱又は吸収に起因するばらつきが解消され、組織の蛍光強度は、絶対的なコンセントを決定するための標準曲線にフィットすることができ配給。適切に行われ、この方法は、定量的であるが、それはまた、労働集約的かつ容易に取り扱いを誤ったです。全臓器のイメージングと比較した場合、定量的な組織学及び労働の有意に高いコストのより複雑な性質を考えると、それは、各プロセスは、蛍光標識された化合物の生体内分布を調べるときに使用するのが最も実用的である場合を調べることは価値になります。このプロトコルを介して、SynB1又はTAT細胞透過性ペプチドの添加の有無にかかわらず、これらの方法は効果的にローダミン標識エラスチン様ポリペプチド（ELP）の生体分布を比較するために一緒に使用することができる方法の詳細な説明を提供します鼻腔内（IN）および静脈内（IV）投与経路。

プロトコル

注：このプロトコルのすべての動物の使用はミシシッピ大学医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

動物と組織の1治療

1. 管理および犠牲
   1. 5分間、3％イソフルランを使用して動物を麻酔し、つま先ピンチ反射の欠如を観察することによって、麻酔の深さを確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医の軟膏を適用します。
   2. 動物を秤量し、1.5 mLチューブにいずれかのローダミン標識ELP、SynB1-ELP、またはのTat-ELPの50mg / kgの投与量をピペット。後工程での標準曲線の定式化のために投与標識化合物の100μLを保存します。
      注：標準は、蛍光標識効率の変動に起因する差異を回避するために動物に投与される標識されたタンパク質の同じバッチから作られることが重要です。適切にバックグラウンド蛍光物質を除去するために、後で蛍光測定からcenceは、未処理の動物は、処置した動物と同じ方法/試薬を使用して犠牲にしなければなりません。
   3. 以前に尾静脈または（鼠径部に1 cmの切開を介してアクセスされる）大腿静脈のいずれかを使用して^1を説明したようにIV注射を管理します。鼠径部の切開を行う場合は、鎮痛のために、5mg / kgの用量でカルプロフェン皮下に投与し、創傷クリップで閉鎖する前に切開部位にsensorcaineを適用します。鼻腔内（IN）経路を介して管理するには、仰臥位で動物を配置します。
   4. 2-μLピペットを用いて、標識化合物の1-μLドロップを描きます。簡単に言うと鼻孔へのアクセスを可能にするために麻酔の襟から動物の頭をスライドさせます。
   5. 単一の鼻孔の開口部にピペットの先端を置き、ゆっくりと液滴が鼻腔内に鼻孔をダウンを実行できるように、プランジャーを押し下げます。全用量が広告になるまで、鼻孔ごとにドロップを交互に、1分ごとを繰り返しますミニストリー。
      注：INを介して投与された最大容量は10超えてはならない - マウスで15μLを。
   6. 個々のケージに各それらを移動する前に、最終投与後10分間麻酔下で仰臥位で動物を残します。
      注：彼らは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻してきたまでは無人の動物を放置しないでください。
   7. 投与後1時間、再麻酔動物の前などとでPBS（210.0 mg / LでKH ₂ PO _4、9,000.0 mg / LでのNaCl、726 mg / LでのNa ₂ HPO _{4・7H 2} O）を使用してtranscardial灌流を介してそれらを犠牲に20mLの合計10 ml /分。
      注：組織からすべての血液を除去するために犠牲にした動物の灌流は、標識化合物の血管外濃度を決定するために必要とされます。灌流試薬は、バックグラウンド蛍光の変化をもたらすことができ、一貫性が保たれるべきです。犠牲の方法は一貫している必要がありますグループ内。犠牲の別の方法は、血管系内の血液の濃度を変化させる組織のバックグラウンド蛍光の変化をもたらすことができます。
2. 組織のコレクション
   1. 採取した組織を洗浄するための上記のようにPBSを準備します。
      注：別のバッファは、灌流液として使用した場合に、同じ緩衝液中で組織をすすぎます。
   2. 簡単な切開によって心臓、肺、胃、肝臓、脾臓、および腎臓を削除します。ラボを使用して乾かすか、余分な水分を吸い上げると撮像マットの上に組織を配置するためにワイプする前に簡単に説明すると、PBSですすいでください。
   3. マウスを刎ねると骨カッターや鉗子を使用して、頭蓋骨の上部を取り外します。鉗子を使用して、慎重に無傷の嗅球を保ち、脳を削除します。 、すすぎ、乾燥、および備えた撮像マットの上に置きます。
   4. 急速な排出^7を介して脊髄を削除するには、PBSで10-mLシリンジを記入し、鈍っ18ゲージの針を取り付けます。
      注：18ゲージフィット多くのマウス系統の大人脊柱管。必要な直径は、動物の大きさに応じて変化します。
   5. 断頭サイトで脊柱管の開口部がきれいに切断され、血液の自由されることを保証する、腹臥位で動物を置きます。
   6. 脊柱の周りから肌を削除します。鋭い骨カッターやはさみを使って、腰への直接吻側腰部セクションの脊柱を切断。
   7. 簡単に言えば脊柱管を可視化するためにPBSでそれをすすいでください。静か脊柱管に針を挿入します。
      注意：針がぴったり感じるべきと前後に挿入中のいくつかのスローローリングが必要な場合があります。針が緩んで感じるべき、より吻側カットを行うことができるか、より大きな直径の針が必要になることがあります。
   8. 親指と人​​差し指を使って、挿入された針の周りの脊柱に圧力を適用します。中等度と一定の圧力でプランジャーを押し下げます。脊髄は、脊髄内の吻側開口部からそのまま排出されますカラム。
      注：合理的に5で完了することができ、すべての主要な臓器の完全な除去、すすぎ、及び乾燥 - 7分。この短い時間は、過度の光照射と組織からの標識されたタンパク質の浸出が生じる可能性がある、PBSに拡張ストレージの必要性を防ぐことができます。

2.全臓器生体外蛍光イメージング

1. 撮像パラメータ
   1. 画像取得ソフトウェアを起動します。取得制御パネルの右下には、「初期化」をクリックします。
   2. 下では「撮影モード」、「蛍光灯」チェックボックスを選択します。下では「露光時間」、「AUTO」を選択します。
   3. 以下の下で「ビニング」、「小」を選択し、2にF /停止を設定します。
   4. 535-nm励起および580 nmの発光フィルターを選択します。
      注：これは、使用されるラベルによって異なります。
   5. 「ビューBのフィールド」を選択し、タージェを設定0.3センチメートルにトンの高さ。
      注：これは、画像化される組織に依存して変化します。
   6. いったん温度インジケーターが緑色に変わり（マシンを意味することは、完全に初期化されている）、提供黒い背景のマットの上に組織を置き、組織が完全に互いに分離されることを保証します。すべての組織が選択した領域のグリッド内にあることを確認して、イメージャにマットを置きます。例えば、肝臓全体として大きく、不均一な組織、葉の重なりを低減するように、レイアウトされなければなりません。
      注：組織を一つの画像は、単一の動物または類似のタイプのすべての組織に対応することができ、単一のグループに一緒に配置することができます。これは、後で分析や組織が容易になります。蛍光強度の大きな違いは、様々な組織の中で存在している場合は、単一の露光時間は、すべての組織強度のために理想的ではないかもしれないとして、それは、画像、それらを個別に、または同じ組織型のグループなどに最高です。
   7. "取得"をクリックします。
   8. 撮影後、直ちに組織を除去し、ステップ4で概説したように、定量的な組織学のためにそれらを保存または凍結。

3.標準と画像処理

1. スタンダード
   1. PBSでは、動物の治療に使用される各タンパク質の二倍連続希釈を作成し、15希釈の合計、元の濃度から始まります。
      注：濃度範囲は、予想される組織濃度を含むことを目指すべきであり、出発濃度に応じて、元のサンプルのさらなる希釈を必要とし得ます。
   2. 黒色96ウェルプレートの各ウェルに各標準100μLを加えます。バックグラウンド蛍光の測定値を得るために、純粋なPBSの1つのウェルが含まれます。
   3. 画像組織イメージングのために使用したのと同じパラメータを持つ規格。
   4. 下の画像取得ソフトウェア「ツールパレット」の「ROIツール、「利息の「リージョンの選択（ROI）「円と1つのウェルの周りにROIを描きます。他の充填された全てのウェルに、そのROIをコピーし、クリックして "のROIを測定します。」
   5. 他の規格の値から純粋なPBSの平均放射効率の値を減算します。これは、バックグラウンド蛍光を除去します。散布図上の既知濃度に対する値をプロットします。
      注：線形トレンドラインの結果として得られる式は、相対蛍光値を計算するために使用することができます。
2. 画像処理
   1. 画像取得ソフトウェアでは、フリーフォームのROIツールを選択し、個々の組織の周囲のROIを描きます。 「測定」をクリックします。
   2. その結果、平均放射効率測定では、各組織型のため、未処理動物からの測定値を減算し、以前に作成した標準曲線にそれらの値をプロットします。
      注：結果の相対蛍光値は、迅速かつ正確なスナップショットを提供します標識化合物の生体内分布。

4.定量的組織組織学

1. スライスの準備と組織の凍結
   1. 選択された組織を凍結し、使用するクライオスタットのに十分な大きさの容器を作成するか、または購入。適切なサイズと形状の物体の周りにアルミ箔をラップすると、うまく動作します。
   2. ドライアイスで500 mLビーカーの半分を充填し、部分的に凍結容器を沈めるためにドライアイス上記の十分な液体が存在するように、イソプロパノール〜350ミリリットルを追加することにより、イソプロパノールとドライアイスの混合物を準備します。
      注：液体窒素は、多くの場合、最適な切削温度化合物（OCT）、および包埋組織の破壊をもたらし、避けるべきです。
   3. 現在気泡がないことを確認して、10月に部分的に凍結容器を満たします。気泡がある場合は、ピンセットを用いて溶液から泡を動作または同様の実装。
   4. 組織を取り除きますPBSから、ゆっくりとラボでそれを撫でいずれかによって、それを徹底的に乾燥ワイプや研究室への繊細な組織の縁に触れることによって、ワイプ、液体が吸い取るすることができます。
   5. 組織の下に気泡を導入しない確実に、冷凍コンテナ内のOCTにやさしく組織を置きます。組織が配置されると、組織が完全に覆われるまで、10月を追加します。
   6. イソプロパノールは、容器内部の露出した10月に接触させることなく、可能な限り多くの冷凍コンテナを水没。 10月、組織は必要な期間だけ、-80℃で保存する前に完全に凍結するために90秒（またはそれ以上の組織のための潜在的により） - 30を許可します。
2. スライスのための基準の準備。
   1. 準備し、適切にバレルの端部を除去することにより、1-mLの使い捨て注射器にラベルを付ける、注射器の全体の長さは1直径であるようになっています。これは、凍結されたシリンダーは、後に押し出されるようになります。
   2. 米国OCTをるが、1 mLの最終結果の体積と、以前にPBSで行ったように、投与される化合物の15ステップ2倍連続希釈を作成します。バックグラウンド蛍光値を除去するための純粋な10月の1サンプルが含まれます。
   3. 、OCTの粘度は、十分な混合が困難になります。チューブを反転し、10月には再び完全に反転する前に解決することができます。均一な混合物を確実にするために20倍 - この10を繰り返します。混合中に光から4℃、離れて標準溶液を保管してください。
   4. 混合した後、再び以前のように、イソプロパノールとドライアイスの混合物を調製します。
      注：液体窒素はまた、イソプロパノール/ドライアイス混合物の代わりに使用し、それらは、固体凍結した後、注射器を速やかに除去されている提供することができます。
   5. できるだけ少ない気泡を導入するように注意しながら、シリンジに10月の標準を描画します。 10月ソリューションを描画した後、直ちにイソプロパノールに直接注射器を浸し、溶液が完全に凍結することができます20秒 - 10のためのシリンジ内。必要な限りのために-80℃で注射器を保管してください。
3. 組織と規格の切断
   1. -20℃で両方の組織や基準を置き、全てのサンプルが温度に来るのに十分な時間をかけて。
      注：理想的な切削温度は一般的に、ほとんどの組織のために-10℃の範囲の周りに落ちるが、それは最終的に組織のサイズと脂肪含有量に依存し、経験的に洗練されなければなりません。
   2. クライオスタットを使用して、以前に^8に記載^{されている}よう^に 、厚さ20μmのスライスに組織を切断し、スライド上にマウントします。 -20℃でスライドを保存し、切断中に、スキャンされるまで離れて、できるだけ多くの光からそれらを保ちます。
      注：これは、測定されるべき部分が適切に組織の厚さ全体にわたって分布していることがここでは重要です。
   3. クライオスタットチャック上の基準をマウントするには、冷凍庫から注射器を取ると3のために外を温める - HOL 5秒手に鼎、それを。 10月のシリンダーの短いセクション（約1センチ）まで、プランジャーを押して注射器の外にあります。
      1. カミソリの刃を使用して、シリンダーを通って切断し、所定の位置に保持するためにOCTを使用し、チャック上に垂直に得られた円筒部を配置します。この構成ではカットされ、明確に定義された円を生じるはずです。
   4. 1スライドが全体の標準曲線を表すように、単一のスライド上に各希釈から1つのスライスを配置し、20ミクロンでシリンダーをスライス。スキャンの準備が整うまで-20℃でスライドを保存してください。
4. スキャンおよび定量
   1. スキャンアレイソフトウェアを起動し、レーザーの起動手順を開始するために「543レーザー」をクリックします。レーザーを準備するために15分間待ちます。
   2. レーザーの準備ができたら、-20℃からスライドを削除し、温度に来て、3分間乾燥させるために大規模な、光で保護されたコンテナに移動します。これは、SLIに水分の蓄積を防ぐことができますデ・スキャナ。
   3. スライドスキャナのスライドレセプタクルにスライドをロードします。 「スキャン」をクリックして選択し、 "簡単なスキャンを実行します。」
   4. 50μmのスキャン解像度を設定します。
   5. 「フルオロフォア」の最初の「使用」チェックボックスを選択し、選択して "TRITC」を80％にPMTゲインを設定します。
      注：これらの設定は、フルオロフォアと標識された分子の濃度に依存して変化します。
   6. 左側には、スキャン領域は、スライド全体が含まれていることを確認。 「スタート」をクリックします。
   7. スキャンした後、「ファイル」を選択し、「名前を付けて保存」してからの.tifとして画像を保存します。
      注：組織や基準のスライドは、同じ設定でスキャンする必要があります。
   8. ImageJのに得られる画像をロードし、組織や基準の周りのROIを選択します。 「分析」タブで、「測定値を設定」を選択し、選択して "グレイ値を意味する。」をクリックし220;測定」。
      注：以前の技術と同様に、バックグラウンド蛍光は、すべての測定値から差し引かなければなりません。
   9. 標準曲線を作成するために、既知の濃度に対する基準からの平均グレー値の測定値をプロットします。
      注：組織から得られた測定値は、各組織内で平均し、組織内の濃度を決定するために、標準曲線上にプロットされるべきです。

結果

細胞透過性ペプチド（SynB1-ELPおよび^Tat-ELP）9で修正されたELPおよびELPの2つのバージョンとして知られている薬物送達ベクター：以下のデータは3つの化合物の送達を説明します。すべての3つの化合物は、テトラメチルローダミン-5-マレイミドで標識し、2つの投与経路を介して送達した（INおよびIV）。これらの実験の目的は、中枢神経系^（CNS）3に最も良く浸透をもたらす、化?...

ディスカッション

ex vivoで全臓器イメージングは、一般的には簡単ですが、いくつかの基本的な概念や技術への付着は、生体内分布測定の精度を向上させることができます。光経験の短い波長ほとんどの組織で散乱し、吸光度の高い、大きな影響を及ぼし短波長蛍光体の有用性。これらのフルオロフォアは、深い組織の研究に適用が限定されているが、彼らは表面組織で、または眼に見ての実験で効果?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)	Thermo Fisher	T6027, A20342	Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling
Phosphate Buffered Saline	Sigma	1002243569	PBS Buffer for rinsing
Optimal Cutting Temperature Compound	Tissue-Tek	4585	Used for freezing and mounting
Equipment
IVIS Spectrum	Perkin Elmer		For ex vivo whole organ imaging
Cryomicrotome	Thermo		For cryosectioning
Fluorescence slide scanner	Perkin Elmer		For slide scanning