O uso de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imagem de órgãos inteiros e Histologia Tissue quantitativa para determinar o Bio-distribuição das moléculas fluorescente etiquetado

Resumo

Ex vivo de imagens de órgãos todo é um método rápido para a determinação das concentrações relativas dos compostos marcados com fluorescência no interior e entre os tecidos ou os grupos de tratamento. Por outro lado, a histologia quantitativa de fluorescência, enquanto que mais trabalho intensivo, permite a quantificação dos níveis absolutos de tecido de moléculas marcadas.

Resumo

Rotulagem fluorescente é um processo bem estabelecido para examinar o destino de moléculas marcadas sob uma variedade de condições experimentais in vitro e in vivo. As sondas fluorescentes são particularmente úteis para determinar a biodistribuição das moléculas grandes administradas, em que a adição de um marcador fluorescente de pequena molécula não é susceptível de afectar a cinética ou bio-distribuição do composto. Uma variedade de métodos existentes para analisar bio-distribuição que variam de forma significativa na quantidade de esforço necessária e se as medições resultantes são completamente quantitativa, mas usando vários métodos de conjugação pode proporcionar um sistema rápido e eficiente para a análise bio-distribuição.

Ex vivo de imagens de órgãos todo é um método que pode ser utilizado para comparar rapidamente as concentrações relativas das moléculas fluorescentes dentro de tecidos bem como entre vários tipos de tecidos ou os grupos de tratamento. Usando um plat de imagemformulário concebido para live-animal ou de imagem de órgão inteiro, fluorescência dentro de tecidos intactos pode ser determinada sem processamento adicional, economizando tempo e trabalho ao fornecer uma imagem precisa da bio-distribuição geral. Este processo é ideal em experiências de tentativa de determinar a especificidade de tecido ou de um composto de comparação de vários compostos diferentes. histologia do tecido quantitativa por outro lado, requer processamento adicional extensa de tecidos, a fim de criar uma medida quantitativa dos compostos marcados. Para avaliar com precisão bio-distribuição, todos os tecidos de interesse deve ser cortado, digitalizado e analisado em relação a curvas padrão, a fim de fazer comparações entre os tecidos ou grupos. histologia tecido quantitativa é o padrão ouro para determinar as concentrações de compostos absolutos dentro dos tecidos.

Aqui, nós descrevemos como ambos os métodos podem ser utilizados em conjunto de forma eficaz de avaliar a capacidade de diferentes métodos de administração, umaND modificações compostos alvo e entregam moléculas marcadas com fluorescência para o sistema nervoso central ^1.

Introdução

rotulagem fluorescente é um método eficaz e facilmente utilizado para a determinação do bio-distribuição de compostos, utilizando uma gama de equipamento que é comum para muitos laboratórios. Os fluoróforos estão amplamente disponíveis, relativamente barato, e vem em uma variedade de comprimentos de onda, de tal forma que várias moléculas rotulados podem ser utilizados simultaneamente sem interferência. A maioria dos fluoróforos tem uma gama de produtos químicos para a conjugação com diferentes grupos reactivos em compostos alvo, e o processo de conjugação é geralmente simples para a maioria dos tipos de locais reactivos. Além disso, o equipamento necessário para as medições de compostos marcados com fluorescência são comuns em muitos laboratórios. microscópios fluorescentes, geradores de imagens, e scanners de slides podem ser usados ​​em circunstâncias diferentes, tornando o uso de marcação fluorescente altamente acessível. Os marcadores fluorescentes são frequentemente utilizados para determinar a biodistribuição e a cinética de compostos tanto in vivo como ex vivo com dispositivos de imagens ao vivo, como o IVIS Spectrum Imager, e por histologia tecido quantitativa ^2,3.

O uso de ex vivo de imagem de órgão inteiro usando dispositivos de geração de imagens ao vivo tem aumentado ao longo do tempo devido à sua facilidade de uso e capacidade de criar rapidamente uma comparação precisa das concentrações relativas de compostos marcados sem exigir que o tratamento posterior de tissues4. No entanto, enquanto ex vivo de imagens de órgãos conjunto pode permitir a fácil análise e comparação, não se gera uma medida quantitativa das concentrações de compostos dentro de um tecido absolutos. Isto é devido aos efeitos de dispersão de luz dentro de órgãos intactos. Desde que a dispersão de luz (e, em menor grau, absorvância) varia de acordo com o tamanho e densidade dos tecidos, imagiologia de órgãos todo pode subestimar níveis de tecido em órgãos grandes ou densos. Formulação de normas adequadas para medições de concentração absoluta também é difícil porque é preciso imitar a espessurae a densidade de cada órgão individual. Por outro lado, a imagem de órgão inteiro é um método rápido de obtenção dos níveis teciduais relativas de um agente, e que é ideal para comparar a bio-distribuição relativa de várias moléculas relacionadas (por exemplo, em estudos de selecção de medicamentos). Uma estratégia alternativa é utilizar histologia fluorescência quantitativa, uma técnica derivada a partir do método de autoradiografia quantitativa, para se obter os níveis absolutos de tecido de um agente de teste ^5,6. Ao invés de colocar um animal ou órgão inteiro em um dispositivo de imaginação, a histologia do tecido quantitativa exige que cada tecido ser cortado, montadas em lâminas, digitalizados e analisados ​​individualmente. Padrões de o agente de teste são preparadas e cortadas com a mesma espessura como as amostras de órgãos. Ao cortar todos os órgãos e as normas para a mesma espessura, a variabilidade devido à dispersão da luz ou absorvância é eliminada, e a intensidade de fluorescência do tecido pode ser apto para a curva padrão para determinar concent absolutaração. Enquanto este método, quando feito corretamente, é quantitativa, mas também é trabalho intensivo e facilmente mal utilizado. Dada a natureza mais complexa da histologia quantitativa e significativamente maior custo do trabalho, quando comparado à imagem do órgão inteiro, torna-se útil analisar em que cada processo é mais prático para usar quando se examina o bio-distribuição de compostos marcados com fluorescência. Este protocolo fornece uma descrição detalhada de como estes métodos podem ser usados ​​em conjunto para comparar de forma eficiente a bio-distribuição do marcada com rodamina elastina como polipéptido (ELP), com ou sem a adição dos péptidos de penetração de células SynB1 ou Tat, através do intranasal (IN) e intravenosa (IV) vias de administração.

Protocolo

Nota: Todos os uso de animais nesse protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Mississippi Medical Center.

1. O tratamento de animais e tecidos

1. Administração e Sacrifício
   1. Anestesiar os animais utilizando 3% de isoflurano durante 5 min e verificar a profundidade da anestesia através da observação da ausência do reflexo do pé-de aperto. Aplicar pomada veterinária aos olhos para evitar a secura e sob anestesia.
   2. Pesar o animal e pipetar um dose de 50 mg / kg de ELP quer rodamina-rotulado, SynB1-ELP, ou Tat-ELP para um tubo de 1,5 mL. Guardar a 100 ul dos compostos marcados administrados para a formulação de curvas padrão em etapas posteriores.
      Nota: É importante que os padrões de ser feita a partir do mesmo lote de proteína marcada administrada aos animais de modo a evitar diferenças devido à variabilidade na eficiência de marcação fluorescente. A fim de remover adequadamente FLUORES fundocência a partir de medições de fluorescência posteriores, um animal não tratado deve ser sacrificado usando os mesmos métodos / reagentes como os animais tratados.
   3. Administrar uma injecção IV, tal como anteriormente descrito utilizando ^um quer da veia da cauda ou na veia femoral (que é acedido através de uma de 1 cm da incisão na virilha). Para analgesia, se fazer uma incisão na virilha, administrar por via subcutânea, carprofeno, a uma dose de 5 mg / kg, e aplicar sensorcaine para o local da incisão antes do fecho com um grampo de feridas. Para administrar por via intranasal (IN), colocar o animal em decúbito dorsal.
   4. Com uma pipeta de 2 ml, elaborar uma queda de 1 mL de composto marcado. Resumidamente deslizar a cabeça do animal a partir do colar anestesia para permitir o acesso às narinas.
   5. Colocar a ponta da pipeta para a abertura de uma única narina e lentamente o êmbolo, permitindo que a gota corra ao longo do nestejam para dentro da cavidade nasal. Repetir a cada 1 min, alternando narinas cada gota até que a dose completa é administrou.
      Nota: O volume máximo administrado via não deverá exceder 10 - 15 mL para os ratos.
   6. Deixar os animais em decúbito dorsal sob anestesia por 10 minutos após a administração final antes de movê-los cada um em uma gaiola individual.
      Nota: Não deixar os animais sem vigilância até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
   7. 1 h após a administração, re-anestesiar os animais como antes e sacrificam-los através de perfusão transcardial com PBS (210,0 mg / L KH ₂ PO _4, 9,000.0 mg / L de NaCl, 726 mg / L de Na ₂ HPO ₄ .7H ₂ O), 10 mL / min durante um total de 20 mL.
      Nota: a perfusão dos animais no sacrifício para remover todo o sangue a partir dos tecidos é necessário para determinar as concentrações extravasculares dos compostos marcados. reagentes de perfusão pode resultar em alterações a fluorescência de fundo e devem ser mantidos consistentes. O método de sacrifício deverá ser consistentedentro dos grupos. Diferentes métodos de sacrifício pode resultar em diferentes níveis de sangue no interior da vasculatura, mudando a fluorescência de fundo dos tecidos.
2. Coleção de tecidos
   1. Prepare PBS como descrito acima para enxaguar os tecidos removidos.
      Nota: Se existir outro tampão foi utilizado como o líquido de perfusão, lavar tecidos no mesmo tampão.
   2. Remover do coração, pulmões, estômago, fígado, baço, rins e por meio de dissecção simples. Resumidamente lavar em PBS antes de usar laboratório limpa para pat seco ou afastar a humidade em excesso e colocar os tecidos sobre o tapete de imagem.
   3. Decapitar o mouse e remover a parte superior do crânio usando cortadores de osso ou fórceps. Utilizando uma pinça, retire cuidadosamente o cérebro, mantendo os bulbos olfatórios intacta. Lavar, secar, e colocá-lo na esteira de imagem fornecidos.
   4. Para remover a medula espinhal através rápida de ejeção ^7, encher uma seringa de 10 ml com PBS e anexar uma agulha de calibre 18 entorpecido.
      Nota: 18 encaixa calibreo adulto canal espinhal de muitas linhas de rato. O diâmetro necessário irá variar com o tamanho do animal.
   5. Colocar o animal em decúbito ventral, assegurando que a abertura do canal medular no local decapitação é claramente marcados e livre de sangue.
   6. Retire a pele em torno da coluna vertebral. Usando cortadores de ossos pontiagudos ou tesoura, corte através da coluna vertebral na seção lombar diretamente rostral para os quadris.
   7. Resumidamente enxaguar com PBS para visualizar o canal medular. Insira com cuidado a agulha no canal medular.
      Nota: A agulha deve se sentir confortável e pode exigir algum rolamento lenta e para trás durante a inserção. Caso a agulha sentir-se solta, um corte mais rostral pode ser feita ou uma agulha de diâmetro maior pode ser necessário.
   8. Usando o polegar eo dedo indicador, aplicar pressão sobre a coluna vertebral em torno da agulha inserida. O êmbolo com pressão moderada e constante. A medula espinhal ejecta-se intacta da abertura rostral na espinalcoluna.
      Nota: A remoção completa, a lavagem e secagem de todos os principais órgãos podem ser razoavelmente concluído em 5-7 min. Este curto tempo evita a necessidade de armazenamento alargado em PBS, o que poderá resultar na exposição excessiva à luz e a lixiviação de proteínas marcadas a partir do tecido.

2. Whole-órgão Ex Vivo Fluorescência de imagem

1. Parâmetros de imagem
   1. Inicie o software de aquisição de imagem. No canto inferior direito do painel de controle de aquisição, clique em "inicializar".
   2. Em "modo de imagem", selecione a opção "fluorescente". Em "tempo de exposição", selecione "AUTO".
   3. Em "binning", selecione "pequeno" e definir o F / Stop para 2.
   4. Escolha de excitação de 535 nm e filtros de emissão de 580 nm.
      Nota: Isto irá variar dependendo do marcador utilizado.
   5. Selecione "Campo de visão B" e defina o target altura de 0,3 cm.
      Nota: Isto irá variar dependendo do tecido a ser visualizado.
   6. Uma vez que o indicador de temperatura fica verde (o que significa que a máquina está totalmente inicializado), colocar os tecidos para o tapete fundo preto fornecida, garantindo que os tecidos estão completamente separados um do outro. Coloque a esteira no gerador de imagens, garantindo que todos os tecidos estão dentro da grade área seleccionada. tecidos maiores e não-homogéneas, tais como o fígado inteiro, deve ser disposto de modo a reduzir a sobreposição dos lobos.
      Nota: Os tecidos podem ser dispostos em conjunto num único grupo, permitindo que uma imagem para acomodar um único animal ou todos os tecidos de um tipo semelhante. Isso faz com que a análise e organização mais fácil depois. Se grandes diferenças na intensidade da fluorescência estão presentes entre os vários tecidos, que é melhor para a imagem-los individualmente ou em grupos do mesmo tipo de tecido, como um único tempo de exposição pode não ser ideal para todas as intensidades de tecido.
   7. Clique em "Adquirir".
   8. Depois de imagem, remover os tecidos imediatamente e armazenar ou congelá-los para histologia quantitativa, conforme descrito na etapa 4.

3. Normas e Processamento de Imagem

1. Padrões
   1. Em PBS, criar duas diluições em série de cada proteína utilizada no tratamento dos animais, a partir da concentração original, com um total de 15 diluições.
      Nota: O intervalo de concentração deve apontar para incluir as concentrações nos tecidos esperados e pode exigir diluições adicionais da amostra original, dependendo da concentração de partida.
   2. Pipetar 100 L de cada padrão em cada poço de uma placa de 96 poços preta. Incluir um poço de PBS puro para se obter uma medida de fluorescência de fundo.
   3. Imagem os padrões com os mesmos parâmetros utilizados para a imagiologia de tecidos.
   4. No software de aquisição de imagem "Paleta de ferramentas" em "Ferramentas de ROI", selecione a "região de interesse (ROI) "Círculo e desenhar o ROI em torno de um bem. Copie esse ROI a todos os outros poços cheios e clique em "medir o ROI."
   5. Subtrair o valor da eficiência radiante média do PBS puro a partir dos valores das normas de outros; isto elimina a fluorescência de fundo. Traçar os valores contra a concentração conhecida em um gráfico de dispersão.
      Nota: A equação resultante da linha de tendência linear pode então ser usado para calcular o valor da fluorescência relativa.
2. Processamento de imagem
   1. No software de aquisição de imagem, selecione a ferramenta ROI de forma livre e desenhar ROIs em torno de cada um dos tecidos individuais. Clique em "medida".
   2. Com a média de medidas de eficiência radiantes resultantes, subtrair os valores medidos a partir do animal sem tratamento para cada tipo de tecido e traçar esses valores na curva padrão criado anteriormente.
      Nota: Os valores de fluorescência relativa resultantes fornecem uma visão rápida e precisa dobiodistribuição do composto marcado.

4. Histologia Tissue Quantitative

1. Preparação e Congelamento de tecidos para corte
   1. Criar ou comprar recipientes de tamanho suficiente para congelar os tecidos escolhidos e criostato para ser utilizado. Envolvendo a folha de alumínio em torno de um objeto de tamanho adequado e em forma funciona bem.
   2. Prepara-se uma mistura de isopropanol e gelo seco, preenchendo metade de um copo de 500 mL com a adição de gelo seco e ~ 350 ml de isopropanol de modo que haja quantidade suficiente de líquido acima do gelo seco para submergir parcialmente o recipiente de congelação.
      Nota: azoto líquido resulta muitas vezes na fractura do composto de temperatura óptima de corte (OCT), e tecidos embutidos e deve ser evitado.
   3. Encha o recipiente de congelamento parcial com OCT, garantindo que não há bolhas de presentes. Se houver bolhas, trabalhar as bolhas para fora da solução usando uma pinça ou implementar um similar.
   4. Remover o tecidode PBS e secá-la completamente, quer por batendo suavemente com um laboratório de apagamento ou tocando as bordas de tecidos delicados para um laboratório de limpeza e permitindo que o líquido para afastar.
   5. Colocar o tecido suavemente para a OCT no interior do recipiente de congelação, garantindo a não introduzir bolhas por baixo do tecido. Uma vez que o tecido está no lugar, adicionar outubro até que o tecido está completamente coberta.
   6. Submergir o recipiente de congelação é, tanto quanto possível sem permitir a isopropanol para entrar em contacto com a OCT exposta no interior do recipiente. Permitir 30 - 90 s (ou potencialmente mais para os tecidos maiores) para a OCT e tecido para congelar completamente antes de armazenar a -80 ° C durante o tempo que for necessário.
2. Elaboração de normas para corte.
   1. Preparar e rotular apropriadamente de 1 ml de uso único seringas, removendo a extremidade do cano, de tal modo que todo o comprimento da seringa tem um diâmetro. Isto irá permitir que o cilindro congelado para ser empurrado para fora mais tarde.
   2. Nosing outubro, criar um 15-passo dupla diluição em série de compostos administrados, como foi feito com PBS anteriormente, mas com um volume final de 1 ml resultando. Incluir uma amostra de pura outubro para a remoção de valores de fluorescência de fundo.
   3. A viscosidade de outubro faz a mistura adequada difícil. Inverta os tubos e permitir que o OCT para resolver completamente antes de inverter novamente. Repetir este 10 - 20 vezes para assegurar uma mistura uniforme. Manter as soluções padrão a 4 ° C e ao abrigo da luz durante a mistura.
   4. Após a mistura, novamente preparar uma mistura de isopropanol e gelo seco, como antes.
      Nota: O nitrogénio líquido também pode ser utilizado no lugar da mistura de gelo isopropanol / seco, desde que as seringas são rapidamente removido depois de terem congelado.
   5. Desenhe o padrão de outubro para dentro da seringa, tendo o cuidado de apresentar como algumas bolhas quanto possível. Após a elaboração da solução de outubro, mergulhe imediatamente a seringa diretamente no isopropanol e permitir que a solução para congelar completamentedentro da seringa por 10 - 20 s. Armazenar as seringas a -80 ° C durante o tempo necessário.
3. De corte de tecidos e Normas
   1. Colocar ambos os tecidos e padrões de -20 ° C e permitir tempo suficiente para que todas as amostras atingir a temperatura.
      Nota: A temperatura ideal de corte geralmente cai em torno de -10 ° C intervalo para a maioria dos tecidos, mas em última análise, depende do tamanho do tecido e teor de gordura e deve ser refinado empiricamente.
   2. Usando um criostato, cortar tecidos em fatias grossas 20 mícrons e montá-los em lâminas, como descrito anteriormente ^8. Armazenar as lâminas a -20 ° C e mantê-los ao abrigo da luz tanto quanto possível durante o corte e que a digitalização.
      Nota: É importante aqui que as secções a serem medidos são adequadamente distribuída por toda a espessura do tecido.
   3. Para montar as normas sobre o mandril criostato, pegue a seringa do freezer e aquecer o exterior para 3 - 5 s por holding-lo na mão. Empurrar o êmbolo até que uma pequena secção de (~ 1 cm) do cilindro de outubro está fora da seringa.
      1. Usando uma lâmina de barbear, cortar através do cilindro e coloque a seção de cilindro resultando perpendicularmente sobre o mandril, usando OCT para segurá-la no lugar. Esta configuração deve resultar em círculos bem definidos que está sendo cortado.
   4. Corte os cilindros a 20 uM, colocando uma fatia de cada diluição para uma única lâmina, de modo que uma lâmina representa toda a curva padrão. Armazenar os slides a -20 ° C até que esteja pronto para a digitalização.
4. Digitalização e quantificação
   1. Inicie o software matriz de digitalização e clique em "543 a laser" para iniciar o procedimento de inicialização laser. Espere por 15 min para o laser para ficar pronto.
   2. Uma vez que o laser está pronto, remover as lâminas entre -20 ° C e movê-los para um grande recipiente, luz-protegido para atingir a temperatura e a secar durante 3 min. Isso vai evitar o acúmulo de umidade na SLIde scanner.
   3. Carregue a lâmina no receptáculo de slides sobre o scanner de slides. Clique em "scan" e selecione "executar verificação fácil."
   4. Defina a resolução de digitalização para 50 mm.
   5. Selecione a primeira opção "Use" em "Fluoróforo" e selecione "TRITC." Defina o Ganho PMT para 80%.
      Nota: Estas configurações irão variar dependendo do fluoróforo e a concentração das moléculas marcadas.
   6. Do lado da mão esquerda, garantir que a área de digitalização inclui toda a lâmina. Clique em "Iniciar".
   7. Após a digitalização, selecione "Arquivo" e "salvar como", e em seguida, salvar a imagem como um .tif.
      Nota: Slides de tecidos e padrões devem ser verificados nas mesmas opções.
   8. Carregar as imagens resultantes em ImageJ e selecione ROIs em torno dos tecidos e padrões. Sob a guia "analisar", selecione "definir medidas" e selecione "significa valor de cinza." Click220; medida ".
      Nota: Tal como acontece com a técnica anterior, fluorescência de fundo deve ser subtraída de todos os valores medidos.
   9. Traçar as mensurações de valor cinza médios das normas contra a concentração conhecida para criar uma curva padrão.
      Nota: As medições resultantes dos tecidos deve ser calculada a média dentro de cada tecido e representados graficamente em que a curva padrão para determinar a concentração no interior do tecido.

Resultados

Os dados abaixo descrevem a entrega de três compostos: um vector de entrega de droga conhecida como PEL e duas versões do PEL modificado com péptidos de penetração de células (SynB1-ELP e Tat-ELP) ^9. Todos os três compostos foram marcadas com tetrametilrodamina-5-maleimida e entregue através de duas vias de administração (EM e IV). O objectivo destas experiências foi o de determinar qual composto e via de administração resultaria na melhor penetração no sistema nervoso central (SNC) ^3.

Discussão

Enquanto ex vivo de imagem de órgão inteiro é geralmente simples, a adesão a alguns conceitos e técnicas básicas podem melhorar a precisão das medições de bio-distribuição. comprimentos de onda curtos da luz experiência um elevado grau de espalhamento e a absorvância na maioria dos tecidos, o que tem um impacto significativo a utilidade dos fluoróforos de curto comprimento de onda. Estes fluoróforos têm aplicação em estudos de tecidos profundos limitado, mas eles têm sido usados ​​com efi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)	Thermo Fisher	T6027, A20342	Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling
Phosphate Buffered Saline	Sigma	1002243569	PBS Buffer for rinsing
Optimal Cutting Temperature Compound	Tissue-Tek	4585	Used for freezing and mounting
Equipment
IVIS Spectrum	Perkin Elmer		For ex vivo whole organ imaging
Cryomicrotome	Thermo		For cryosectioning
Fluorescence slide scanner	Perkin Elmer		For slide scanning