Imaging dei neutrofili phagosome e nel citoplasma utilizzo di un indicatore di pH Raziometrico

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare il pH phagosomal e zona così come il pH citoplasmatico di neutrofili umani e di topo usando l'indicatore raziometrico seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Ciò si ottiene mediante live-cell microscopia confocale a fluorescenza e analisi di immagine.

Abstract

I neutrofili sono cruciali per ospitare la difesa innata e, di conseguenza, costituiscono un importante settore della ricerca medica. Phagosome, compartimento intracellulare dove l'uccisione e digestione delle particelle inghiottito avvengono, è l'arena principale per neutrofili patogeno uccisione che richiede stretta regolazione. Phagosomal pH è un aspetto che è attentamente controllata, a sua volta regolare l'attività della proteasi antimicrobica. Molti coloranti pH-sensibile fluorescenti sono stati utilizzati per visualizzare l'ambiente phagosomal. S-1 ha diversi vantaggi rispetto ad altri coloranti pH-sensibile, compreso il suo spettro di emissione duplice, la sua resistenza a foto-candeggio, e la sua elevata pKa. Usando questo metodo, abbiamo dimostrato che phagosome neutrofili è insolitamente alcalino rispetto ad altri fagociti. Utilizzando differenti coniugazioni biochimici del colorante, phagosome può essere delineata dal citoplasma in modo che i cambiamenti nelle dimensioni e la forma del phagosome possono essere valutati. Questo permette di fo ulteriore monitoraggio del movimento ionico.

Introduzione

Il neutrofili è il più abbondante cellula immunitaria innata del corpo. La sua funzione principale è costituito pattugliano sangue e inghiottendo e digerendo le particelle estranee che potrebbe verificarsi in un processo noto come fagocitosi ^{1, 2.} Le particelle vengono degradati in un compartimento intracellulare chiamato phagosome. L'attivazione di neutrofili NADPH ossidasi, la NOX2 isoforma, avvia una cascata di reazioni biochimiche che culmina nella morte del patogeno. Subunità proteiche NOX2 procedere per formare un complesso di catena di trasporto degli elettroni nella membrana phagosomal ^3. Una volta attivato, trasporta elettroni dal NADPH attraverso la membrana all'ossigeno molecolare all'interno phagosome, producendo anioni superossido e specie di ossigeno reattive ulteriormente. Questo è noto come il burst respiratorio, ed è pensato per essere essenziale per un efficiente uccisione microbica e la digestione ² . Tuttavia, questo movimento esclusivo di carica negativa attraverso la membrana presto inattivare NOX2 se non fosse compensato da carica positiva trasferirsi e / o carica negativa muoversi dalla phagosome. È stato ben stabilito che la maggior parte di compensazione di carica nella neutrofili è effettuato dal canale protone HVCN1 ^{4, 5.} Questo canale permette il movimento passivo di protoni il loro gradiente elettrochimico dal citosol phagosome. concentrazione protonica è riflessa dal pH, quindi per un dato livello di attività ossidasi, misurando il pH nel phagosome può fornire informazioni sulla relativa partecipazione di percorsi protonici e non protonici a compensazione di carica.

Neutrofili phagosome umano ha un pH alcalino di circa 8,5 per 20-30 min dopo fagocitosi ^5. Ciò implica l'esistenza di ulteriori canali non-protone ioni di NOX2-indotta compensazione di carica, come la fusione e il rilascio del contenuto dei granuli acidi e suola compensazione di HVCN1 manterrebbe un ambiente acido, a differenza di quello osservato. Il movimento di ioni per compensare questa carica negativa possono anche esercitare cambiamenti nelle dimensioni fagosoma osmosi. Questi possono essere ioni presenti nel neutrofili ad alte concentrazioni fisiologiche: ioni potassio hanno dimostrato di trasferirsi nella phagosome ^6, e cloruro di movimento ionico è un altro candidato importante per la funzione dei neutrofili ^7.

La regolazione del pH nel phagosome è vitale per antimicrobica attività proteasica ^5. Mieloperossidasi (MPO) sembra avere attività ottimale a pH 6, mentre per catepsina G e elastasi, i livelli ottimali sono pH 7-9 e pH 8-10, rispettivamente ^5. Pertanto, il cambiamento transitoria del pH phagosomal può fornire nicchie di attività per i diversi enzimi per divertimentoction. Capire come il pH è coinvolto in neutrofili uccisione microbica può fornire informazioni utili per la progettazione di nuovi agenti microbici neutrofili-aumentare.

Il phagosome neutrofili è un ambiente altamente reattivo. Ciò rende difficile valutare con precisione pH, perché coloranti possono essere facilmente ossidati, portando ad artefatti tecnici. Storicamente, isotiocianato di fluoresceina (FITC) è stata la tintura di scelta per misurare intracellulare pH ^{8, 9.} Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi per il suo utilizzo nella misurazione del pH dei neutrofili phagosomal. Esso ha un pKa di 6,4 ^10, il che significa che si può solo accuratamente essere utilizzato per valutare i livelli di pH compreso fra 5 7.5 ^8, come si satura a pH <8 ^11. Come il pH dei neutrofili phagosomal può diventare molto più alcalino ^5, FITC non può catturare l'intera gamma di potenziali variazioni di pH. Un ulteriore signifiproblema sopraelevazione con FITC nel contesto di neutrofili è che è pensato per essere fotodecolorate da MPO ^12. L'inibitore MPO, azide di sodio, può essere utilizzato per limitare photobleaching ^13, ma è stato dimostrato che la sodio azide, riduce direttamente il pH phagosomal in modo MPO indipendente ed è quindi inadatto per l'uso in tali saggi ^5.

Rispetto ad altri coloranti intracellulari, S-1 ha una relativamente alta pKa di 7.5 ^10. In condizioni acide, la molecola è protonata e produce un segnale di emissione di 560 a 600 nm quando viene eccitato a 488 nm o superiore. Quando la molecola è deprotonato in condizioni più alcalini, la lunghezza d'onda di emissione è superiore a 600 nm. Un rapporto delle intensità di fluorescenza a queste due lunghezze d'onda indica lo spostamento di emissione, che è più affidabile rispetto sia singole misure di fluorescenza, come è influenzato dalla concentrazione fluoroforo e struttura cellulare. S-1 può essere coniugato a materiale antigenico, come zymosan ^14, anche se ucciso al calore (HK) Candida albicans è preferito, come la superficie maggiore dà una lettura di fluorescenza più coerente.

Abbiamo usato anche una variante di questo metodo per studiare variazioni temporali di pH (Figura 3) ^5. Questo metodo per la misura del pH citosolico può essere facilmente applicato ad altri tipi di cellule, come descritto altrove ^{15, 16,} e cellule con fagosomi più alcalini ^14.

Protocollo

dichiarazione etica: Tutto il lavoro animale è stato condotto con la licenza e l'approvazione del Regno Unito Home Office. partecipazione umana in questa ricerca è stato approvato dai comitati misti UCL / UCLH sul Etica della ricerca umana. Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato.

1. Preparazione di C. albicans

1. Crescere un disco Candida (vedi Materiali List) su un piatto YPD agar secondo le istruzioni del produttore. Scegli una colonia e aggiungerlo a 15 ml di YPD brodo. Incubare in un incubatore agitazione a 30 ° C e 200 rpm fino a quando il brodo è torbida (solitamente circa 2 giorni, o ad una concentrazione di circa più di 1 x 10 ⁹ / mL).
2. Centrifugare il mezzo Candida e risospendere in 50 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Centrifugare a 3.000 g per 10 min. Ripetere questa operazione due volte.
3. Posizionare la provetta contenente 50 ml di mezzo di PBS / Candida in un bagno di acqua preriscaldata a 60 ° C in modo che l'intero tubo è submerged per 1 h.
   1. Per confermare che il Candida sono ucciso al calore, consecutive un campione su una piastra YPD agar ed incubare una notte a 30 ° C. Regolare la concentrazione (HK) Candida ucciso al calore a 5-9 x 10 ⁸ / mL, a seconda della crescita Candida, e memorizzarlo in 1 mL aliquote in un congelatore a -20 ° C.
      NOTA: Tutte le conta di cellule in questo protocollo sono stati eseguiti utilizzando un contatore di cellule automatizzato.

2. S-1 accoppiamento al ucciso al calore (HK) Candida

1. Preparare un'aliquota di carbossi-S-1 succinimidil estere (50 ug) diluendo in 100 ml di alta qualità dimetil solfossido (DMSO). Vortex bene per amalgamare.
2. Preparare 1 ml di 1 x 10 ⁸ HK Candida in 0,1 M di bicarbonato di sodio (pH 8,3) in una provetta da 15 ml.
3. Aggiungere 100 ml di carbossi-S-1 una goccia alla volta per l'HK Candida mescolando in un vortice a circa 2,000 rpm (media ad alta velocità). Avvolgere FOI in alluminiol attorno al tubo e posizionarlo su un rullo a temperatura ambiente per 1 h.
4. Lavare la HK Candida- S-1 (HKC-S-1) tre volte per centrifugazione a 2.250 xg per 10 min ciascuno. Per i primi due lavaggi, risospendere il pellet in 15 ml di 0,1 M sodio bicarbonato (pH 8,3). Dopo il terzo lavaggio, risospendere in 1 ml di tampone di soluzione salina bilanciata (BSS) (vedi Tabella 1).
5. Trasferire i HKC-S-1 sospensione in provette in aliquote di 100 microlitri e conservarli a -20 ° C.
   NOTA: Usare tubi basso legame superficie del materiale, se possibile, come HKC-S-1 particelle possono aderire alla parete di provette da centrifuga normali.
6. Opsonize HKC-S-1
   1. Per i neutrofili umani, aggiungere 100 ml di siero IgG umana di 100 ml di scongelati HKC-S-1.
   2. Per i neutrofili topo, aggiungere 50 ml di siero normale di topo e 50 ml di topo Candida siero immune (generato da topi iniettati con C57B6 HK Candida) da ⁵ a 100 microlitridi HKC-S-1.
   3. Mescolare a fiamma-shaker a 37 ° C e 1100 rpm per 60-90 minuti, e poi su un rullo 4 ° C per 2 h.
   4. Lavare tre volte in tampone BSS per centrifugazione a 17.200 xg per 1 min ciascuna. Risospendere in 100 microlitri di tampone BSS.

3. Isolamento dei neutrofili

1. Per i neutrofili del sangue periferico umano, prendere 15 ml di sangue mediante venopuntura da un donatore sano e posizionarlo in una siringa da 20 ml contenente 90 ml di soluzione di eparina sodica 1.000 UI / ml (60 ml di eparina / 10 ml di sangue).
2. Usando una punta della pipetta, iniettare 1,5 ml di soluzione di destrano 10% nella siringa. Capovolgere delicatamente 3 volte e lasciarlo in piedi sul banco.
3. Attendere 30-60 minuti, fino a quando il sangue è diviso all'incirca a metà, con uno strato superiore buffy coat che è paglierino e uno strato inferiore contenente eritrociti.
4. spingere delicatamente lo strato superiore attraverso un ago o rimuovere con un puntale. Mettilo iTubo 15 ml na. Evitare di prendere lo strato rosso. Usando una pipetta mL 5, aggiungere 3-4 ml di media densità gradiente (vedi Lista dei materiali) al fondo della provetta sotto lo strato buffy coat avere due strati distinti. Centrifugare a 913 g per 10 min.
   NOTA: Se si utilizzano i neutrofili topo (vedi riferimento ¹⁷ per l'isolamento dei neutrofili topo), utilizzare la sospensione cellulare che è stata lavata dal midollo osseo invece.
5. Eliminare il surnatante, lasciando dietro di sé una pallina rossa. Delicatamente vortice per disturbare il pellet. Aggiungere 7 ml di acqua distillata, H ₂ O autoclavato al pellet e invertire per 20 s per risospendere il pellet. Aggiungere 7 ml di soluzione fisiologica 2x e capovolgere un paio di volte per mescolare, lisi i globuli rossi rimanenti.
6. Centrifugare a 300 xg per 5 min. Eliminare il sopranatante e risospendere il pellet in tampone BSS a circa 4 x 10 ⁶ / ml.
   NOTA: Per la microscopia ottimale delle cellule, mantenere la concentrazione sospensione cellulare tra 1,5-6 x 10 ⁶ / mL.

4. Preparazione di diapositive

1. Pre-trattamento di una piastra di microscopia 8 pozzetti (vedi Elenco materiali) con 200 ml di poli-L-lisina (soluzione 0,01%) in ciascun pozzetto per 40-60 minuti a temperatura ambiente.
2. Rimuovere la poli-L-lisina (può essere riutilizzato) e lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di H ₂ O distillata O.
3. Aggiungere 200 microlitri di sospensione cellulare preparata nella fase 3.6 a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 30-60 min.
4. Preparare un'aliquota di 5- (e-6) -carboxy S-1 acetossimetil (S-1-AM) estere (50 ug) aggiungendo 100 ml di alta qualità DMSO a un tubo. Vortex per miscelare. Quando non in uso, conservare a -20 ° C.
5. In un piccolo tubo, aggiungere 1,7 ml di tampone BSS e 20 ml di S-1-AM. Vortex per miscelare.
6. Lavare i pozzetti due volte con 200 ml di tampone BSS, e quindi sostituire il tampone con la soluzione S-1-AM. Fare attenzione a non disturbare il monostrato di cellule attaccate al fondo del pozzo delicatamente pipettandole pareti dei pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per almeno 25 min.
7. Lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di tampone BSS. Per provare un inibitore, costituiscono un "master mix" del farmaco appropriato in buffer di BSS. Lavare i pozzetti due volte nella soluzione inibitore.
   NOTA: Assicurarsi di utilizzare la stessa quantità di veicolo farmaco (ad esempio, DMSO o etanolo) nel pozzetto di controllo come è stato utilizzato per l'inibitore. Se testare l'effetto di cloruro di zinco, utilizzare BSS tampone privo KH ₂ PO ₄ (HEPES può tamponare la soluzione da solo), come zinco precipita con fosfato.
8. Sonicare il opsonizzati HKC-S-1 (paragrafo 6.2) per circa 3 s a 5 um ampiezza. Aggiungere 10 ml a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C per 15-20 minuti per consentire fagocitosi, rendendo le cellule pronti per essere ripreso per istantanee di fagocitosi.

5. Microscopia confocale

1. Utilizzando un microscopio confocale, regolare la lunghezza d'onda del laser in modo thle cellule sono eccitati a 555 nm e l'emissione viene rilevata da due canali, o rivelatori: 560-600 nm e oltre 600 nm.
   NOTA: I parametri specifici microscopio differiranno per ogni microscopio e devono essere ottimizzati dal ricercatore.
2. Visualizzare le cellule utilizzando un obiettivo 63X con l'olio. Utilizzare un'immagine di tegola-scan sulla regolazione continua per vedere la piastrella centrale. Utilizzando l'intensità di fluorescenza e il guadagno di canali del rilevatore, regolare il fuoco e l'intensità del laser e il guadagno dei due canali per ottimizzare l'immagine.
3. Suddividere l'immagine utilizzando le impostazioni per visualizzare entrambi i canali; controllare che non v'è alcuna saturazione di intensità di fluorescenza nel citoplasma o vacuoli. Saturazione appare come puntini rossi. Ridurre l'intensità del laser in modo che ci sia un numero minimo di punti rossi, ma le cellule e fagosomi sono abbastanza brillante da poter vedere chiaramente.
4. Al termine, clicca su "Avviare esperimento." Un'immagine scansione 9-tile viene generato. Salvare l'immagine come file complesso consigliato dail software che contiene un'immagine composita dei due canali (non jpeg o TIFF).

6. Esperimenti di calibrazione

1. Costruire la curva standard pH con sola Candida.
   1. Preparare i tamponi da pH 3,0 a 13.0 come da Tabella 1.
   2. Prendere un'aliquota (100 ml) di HKC-S-1. Spin giù per 1 min a 17.200 x g. Risospendere in 500 microlitri di buffer assegnato.
   3. A partire dal range di pH più basso, aggiungere la sospensione a un pre-trattati bene (dal punto 4.2). Posizionare il vetrino sul microscopio confocale su un palco riscaldato impostato a 37 ° C.
   4. Registrare la fluorescenza ogni minuto per 10 min. Ripetere per ogni buffer.
2. Saponina curva standard.
   1. Isolare 1 x 10 ⁷ neutrofili umani ⁵ e risospendere in 1 ml di tampone a pH più basso.
   2. Seguire il metodo descritto al punto 4 per misurare phagosomal pH nei neutrofili.
   3. Dopo l'incubazione con la sospensione Candida per 20 min, aggiungere 0,3% saponina (15 ml di 10% stock di un pre-trattati bene (dal punto 4.2)) al piatto, e incubare per 20 min a 37 ° C. Prendete un'immagine ogni minuto per 10 min. Ripetere per ogni buffer.
3. Curve citosolici titolate utilizzando la tecnica alta K ^{5, 18, 19 +} / nigericin.
   1. Portare i buffer descritti nella Tabella 1, da pH 4,0-13,0.
   2. Seguire i passaggi 4.1-4.7, lasciando solo i neutrofili nei pozzetti pre-trattati - ogni pozzetto per contenere un buffer diverso. Aggiungere la slitta nella fase riscaldata 37 ° C e registrare la fluorescenza ogni minuto per 10 min.
   3. Nota: Esso può richiedere molto tempo per il pH citosolico per stabilizzare la soluzione esterna, ma dopo questo punto, il valore del rapporto S-1 diventacostante. Misurando i extracellulari HKC-S-1 in ogni esperimento può servire come un controllo per verificare che i inibitori aggiunti non interferiscono con la fluorescenza emessa S-1 o alterare il pH del tampone.

Analisi 7. Immagine

NOTA: Qui, le istruzioni per l'analisi delle immagini (quantificazione della fluorescenza) utilizzando il software ImageJ è gratuito. Si consiglia l'uso di ImageJ.

1. Scaricare e installare la versione ImageJ> 1.46r secondo le istruzioni dello sviluppatore (https://imagej.nih.gov/ij/). Installare il file di codice aggiuntivo allegato al presente protocollo chiamato “misurazione Phagosomal.”
2. Apri immagine J e caricare il file di immagine scelta per l'analisi sulla barra degli strumenti. Per combinare i due canali, utilizzare Immagine> Colore> Crea Composite.
3. Tasto destro del mouse per scegliere un file in cui memorizzare i risultati.
4. Fare clic sullo strumento linea sulla barra degli strumenti e fare doppio clic per aumentare la larghezza a & #34; 2 ".
5. Tracciare una linea su tutta la larghezza di un phagosome, e quindi fare clic destro su "misura del pH". L'intensità media dei due canali è acquisito, e il loro rapporto è calcolato automaticamente dal file di codice in ImageJ.
6. Dopo aver terminato le misurazioni, fare clic destro per scegliere "salvare il file."
7. Per misurare l'area phagosome, utilizzare la quarta icona lungo la barra degli strumenti per disegnare a mano libera intorno alla zona. Tasto destro del mouse per selezionare "area di misura."
   NOTA: I risultati vengono salvati e un file di log viene generato nella directory selezionata. I risultati possono essere trattati con foglio, R, o un programma equivalente. Il rapporto tra il rapporto di fluorescenza a pH circa sigmoidale, e valori di rapporto generati dall'analisi ImageJ può essere convertito pH utilizzando una funzione logistica generalizzata o sigmoide o lineare o cubica interpolazione spline.
8. Per misurare il citoplasma, tracciare una linea attraverso il citoplasma e fare clic destro su “misura del pH”.

Risultati

Figura 1 presenta istantanee di neutrofili di diverse origini di dimostrare ambienti phagosomal variabili. Per facilitare l'analisi quantitativa, è importante dare dei pozzetti con un numero appropriato di cellule: troppi causerà le cellule a strato sopra l'altro, il che rende difficile visualizzare fagosomi allegate precisione; troppo pochi volontà, naturalmente, fornire un minor numero di risultati, in particolare per quanto non tutti i neutrofili si fagocitare. La figura 2 è un'immagine che è eccessivamente saturo; questo può essere valutata suddividendo l'immagine tra i due canali (utilizzando il software microscopio raccomandato nel Materials List o equivalente) - puntini rossi indicano quale sia stata rilevata la fluorescenza massima. Questo può essere contrastata riducendo l'intensità del laser. Le curve di calibrazione utilizzando i vari sistemi tampone sono mostrati in figura 3, adattato da Levine et al. ^{5 <}/ Sup>. Le barre di errore indicano che v'è qualche variazione nella fluorescenza tra le letture. La Figura 4 mostra un esempio di come i dati per phagosomal pH e zona potrebbero essere presentate. Questo approccio permette ad ogni singola misura da visualizzare con un diagramma a scatola over-posa. Tuttavia, i dati possono essere visualizzati in un istogramma istogramma.

Figura 1: immagini istantanee appropriate di neutrofili da esseri umani e topi. All'estrema destra è una chiave visiva qualitativa del colore approssimativa dei fagosomi S-1-colorati corrispondenti al pH. Il colore giallo indica più acidità, mentre il rosso indica più alcalinità. (A) mostra Hvcn1 ^{- / -} topo osso neutrofili midollo 20 minuti dopo la fagocitosi. I fagosomi appaiono molto rosso, alcalina, e gonfio. La freccia rossa nella parte in basso a destra dellaimmagine indica un Candida intracellulare, mentre la freccia nel sinistra sopra ad una particella extracellulare. (B) mostra neutrofili midollo osseo di topo di tipo selvatico che hanno ingerito Candida; sono molto meno alcalini di Hvcn1 ^{- / -} cellule. (C) mostra neutrofili del sangue periferico umano nello stesso punto dopo fagocitosi. Essi appaiono leggermente più alcalino rispetto alle cellule di tipo selvatico del mouse, ma i fagosomi non sono ancora così grande e rossa come il Hcvn1 ^{- / -} cellule. (D) mostra neutrofili umani che sono fagocitati Candida in presenza di 5 mM difenilen iodonio (DPI). Tutti i fagosomi sono molto acida, con un pH di 6 o meno; Il farmaco inibisce l'ossidasi NADPH, quindi non c'è alcun movimento di ioni di compensazione. I protoni rilasciati dai granuli acide che fondono al phagosome causare il pH acido ^20, e l'incremento delle assunzioni della V-ATPasi di the phagosomal membrana in seguito a trattamento con DPI ^9. Il citoplasma appare anche più alcalino rispetto alle cellule delle altre condizioni. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Over-saturazione di Hvcn1 ^{- / -} topo neutrofili midollo osseo. È importante escludere dalle immagini di analisi in cui i dati di fluorescenza sono troppo saturi. Come descritto nella sezione 5.3, l'immagine composita è divisa in due immagini (in alto a sinistra, freccia rossa) con entrambi i canali presentati singolarmente. In questo software, indicatore intervallo è selezionata (in basso a sinistra, freccia rossa), quindi tutti i pixel che sono troppo saturi sono rosso brillante. C'è sovrasaturazione presente in entrambi i canali (1 e 2). A magnificazione di alcune cellule ed extracellulare Candida è mostrato in basso a destra, con frecce rivolte alle aree colpite. Analizzando questi punti porterebbe ad una misurazione falsa raziometrico. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: curve di calibrazione standard per la conversione di S-1 rapporti di fluorescenza a misurazioni del pH. Le curve standard per Candida solo nei diversi tamponi (etichettati come "Tris") e quando le cellule vengono permeabilizzate con saponina ( "saponina") sono molto simili, dimostrando che l'S-1 lettura all'interno e all'esterno della cellula (phagosome ed extracellulare medio) sono paragonabili. Le barre di errore rappresentano la media ± SD. La curva S-1 ratio / pH viene accorciata quando testati in citoplasma ( "citoplasma"), che dovrebbe essere presa in considerazione nella analisi di immagini. Questo dato è stato modificato da Levine et al. ^5. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Quantificazione di phagosomal pH e zona. Questa figura presenta un esempio di presentazione dei dati. I grafici sono stati generati utilizzando il software di programmazione R. A: mostra rapporto phagosomal e pH corrispondente per A (Hvcn1 ^{- / -} topo neutrofili midollo osseo), B: tipo selvatico osseo di topo neutrofili midollo, C: neutrofili del sangue periferico umano, e D: umana neutrofili con 5 uM DPI n = 3/300. singole misurazioni sono mostrati come quadratini, con una sovrapposizione boxplot con mediuna e intervallo interquartile. Una barra rossa rappresenta la media. Come si vede nelle immagini in Figura 1, Hvcn1 ^{- / -} cellule hanno fagosomi molto alcalino rispetto al topo di tipo selvatico e neutrofili umani. Hanno anche un'area maggiore phagosomal (Figura 4B, n = 3/300). fagosomi neutrofili umani sono leggermente più alcalino e più grande di neutrofili tipo selvatico topo, mentre i neutrofili umani incubati con DPI sono fagosomi molto acide e piccoli. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Soluzione salina bilanciata (BSS) tampone
NaCl	156 mm
KCl	3 mM
MgSO 4	2 mM
KH 2 PO 4	1,25 mm
CaCl 2	2 mM
Glucosio	10 mM
Hepes	10 mM
pH 7,4 con NaOH o HCl
brodo YPD
brodo YPD	50 g
Acqua distillata	1 L
Autoclave a 121 ° C per 15 min
Per YPD agar: prima autoclave aggiungere 15 g / L di agar
10% soluzione di destrano
grado clinico Destrano		50 g
NaCl		4,5 g
Acqua distillata		500 mL
Aggiungere alla bottiglia di vetro e autoclave a 121 ° C per 15 min
Soluzione 2x Saline
NaCl		18 g
Acqua distillata		1 L
Aggiungere alla bottiglia di vetro e autoclave a 121 ° C per 15 min
10% saponina magazzino
tampone BSS		50 mL
saponina		5 g
Il calore del buffer BSS a 37 ° C, aggiungere saponina e mescolare.
Aggiungere 0,1% di sodio azide come conservante, miscela conservare a 4 ° C.
tamponi di calibrazione
Candida curva standard
Primo compongono 0,15 m stock di ogni buffer
Make up 0,15 soluzione M di NaCl
15 ml di volume finale: 5 mL 0,15 M di soluzione tampone + 10 mL di soluzione 0,15 M di NaCl
pH 3	100 mM NaCl	50 mM glicina
pH 4	100 mM NaCl	50 mM acetato
pH 5	100 mM NaCl	50 mM acetato
pH 6	100 mM NaCl	50 mM acetato
pH 7	100 mM NaCl	50 mM Tris
pH 8	100 mM NaCl	50 mM Tris
pH 9	100 mM NaCl	50 mM Tris
pH 10	100 mM NaCl	50 mM glicina
pH 11	100 mM NaCl	50 mM fosfato
pH 12	100 mM NaCl	50 mM fosfato
pH 13	100 mM NaCl	50 mM fosfato
Citosolico curva standard
Utilizzare precedentemente reso 0,15 M soluzioni tampone stock
Make up 0,15 soluzione M KCl
15 ml di volume finale: 5 mL di tampone 0,15 M soluzione + 10 mL di 0,15 M KCl desiderato
10 mM di nigericin in etanolo, aggiungere 15 microlitri di ogni soluzione volume finale
pH 3	100 mM KCl	50 mM glicina	10 micron Nigericina
pH 4	100 mM KCl	50 mM acetato	10 micron Nigericina
pH 5	100 mM KCl	50 mM acetato	10 micron Nigericina
pH 6	100 mM KCl	50 mM acetato	10 micron Nigericina
pH 7	100 mM KCl	50 mM Tris	10 micron Nigericina
pH 8	100 mM KCl	50 mM Tris	10 micron Nigericina
pH 9	100 mM KCl	50 mM Tris	10 micron Nigericina
pH 10	100 mM KCl	50 mM glicina	10 micron Nigericina
pH 11	100 mM KCl	50 mM fosfato	10 micron Nigericina
pH 12	100 mM KCl	50 mM fosfato	10 micron Nigericina
pH 13	100 mM KCl	50 mM fosfato	10 micron Nigericina
pH tutte le soluzioni di taratura sia con HCl o NaOH

Tabella 1: Composizione di buffer. Questa tabella descrive composizioni appropriate dei diversi buffer utilizzati nel protocollo.

File di codice supplementare. Questo file contiene una serie di macro, scritto da AP Levine, che sono necessari per l'analisi delle immagini. Gli autori sarebbero felici di cercare di affrontare qualsiasi domanda associati all'uso di questo codice. Cliccate qui per scaricare questo file.

Discussione

Una volta che i reagenti appropriati, impostazioni del microscopio, ed esperimenti di calibrazione vengono impostati, questo metodo è relativamente semplice da eseguire. I passaggi critici comprendono: etichettatura Candida con S-1 per garantire che non vi sia sovraccarico del colorante, taratura, e l'analisi dell'immagine.

S-1 è un reagente adatto a più ambienti a pH alcalino, che è particolarmente importante per i neutrofili ²¹ ma ne limita l'utilizzo in alcuni tipi di cellule. Per gli ambienti più acidi, come macrofagi, fagosomi SNARF-4, o S-4, è più adatto a causa della sua bassa pKa ^22. Inoltre, per le letture citoplasmatici più accurate, è meglio usare S-4, come curva standard per S-1 mostra che i rapporti di fluorescenza cominciano a pianoro sottostante pH 6 (figura 3). Altri coloranti, quali 2' , 7'-bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -Carboxyfluorescein (BCECF) o pHrodo Red possono anche essere più adatto in un context che dovrebbe essere acide. Ancora la colorazione citoplasma è ancora necessaria per la corretta individuazione dei fagosomi contenenti Candida.

Una caratteristica importante di un indicatore di pH phagosomal è che non trasformazione irreversibile dall'ambiente phagosomal reattivo. S-1 sembra essere resistente al milieu dei neutrofili. Ciò è dimostrato dal Levine et al. ⁵ (vedi complementare Video 4 su riferimento ^5), che dimostrano la fagocitosi e il successivo rilascio di una particella Candida S-1 marcato da un Hvcn1 ^{- / -} neutrofili. Quando fagocitati, la particella passa da giallo / arancio a rosso (neutro a pH alcalino), ma quando la particella viene rilasciato dal neutrofili, ritorna al suo colore originale.

È importante ricordare alcune delle limitazioni associate all'utilizzo S-1. Il fatto che questo colorante ha due spettri di emissione permettendo meas raziometricheurement è un vantaggio, ma attrezzature specialistiche è necessaria per acquisire immagini; il microscopio utilizzato per gli esperimenti deve essere in grado di registrare due immagini simultaneamente o con un ritardo insignificante. Gli autori supporre che il ricercatore di tentare questo protocollo ha esperienza usando la microscopia confocale, o ha accesso a un professionista qualificato. Non possiamo elencare tutti i parametri del microscopio specifici poiché essi variano per ciascun microscopio e devono essere ottimizzate dal ricercatore. L'estere acetossimetil coniugato S-1 che permette il colorante di diffondersi nel citoplasma cellulare è degradata da esterasi non specifiche nel citoplasma cellulare per formare la molecola fluorescente. Esterasi, quali fosfatasi alcalina, sono presenti nel siero umano e siero bovino fetale, che vengono utilizzati per integrare mezzi di coltura cellulare. Di conseguenza, il mezzo in cui le cellule vengono caricate con S-1-AM (paragrafo 4.5) non deve contenere siero. Questo potrebbe rivelarsi difficile se utilizzando cellule che richiedono una maggiore sostanza-rich di media per sostenere loro che la soluzione salina bilanciata utilizzata in questo protocollo. Analogamente, altri componenti medie fluorescenti, quali rosso fenolo, possono interferire con S-1 misurazioni.

Le barre di errore in figura 3 indicano che v'è una certa variazione nelle misurazioni del rapporto ad ogni pH. Un numero adeguato di ripetizioni di ogni esperimento (almeno n = 3) e sono necessari come molte misure individuali in ogni singolo esperimento per superare la variabilità inter-vacuolare. È pertanto consigliabile misurare il pH di almeno 100 fagosomi per ogni condizione e altrettante aree phagosomal che sembrano contenere un solo Candida. Fagosomi da misurare per la quantificazione dovrebbero essere quelli che hanno completamente inghiottito una particella Candida (cioè quelle completamente circondato da citoplasma). Per mitigare contro pregiudizi non intenzionali nella selezione di cellule / fagosomi per la quantificazione, tutte le analisi devono essere eseguite mentrecieco alle condizioni sperimentali.

Qui, descriviamo l'isolamento dei neutrofili per sedimentazione destrano di sangue intero e centrifugazione dello strato di plasma attraverso un gradiente di densità. Usiamo questa tecnica come modo rapido ed efficiente produce una popolazione puro (> 95%) di neutrofili, anche se ci sono altri metodi disponibili, come tutta la centrifugazione del sangue attraverso altre formule gradiente di densità o selezione negativa di neutrofili utilizzando kit specializzati con anticorpi o magnetico perline. Tuttavia, quest'ultimo può essere proibitivo per la maggior parte dei gruppi che isolano neutrofili di routine. Inoltre, usiamo l'eparina anticoagulante nel tubo di raccolta sangue, mentre altri ricercatori può essere più abituati a usare acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) o sodio citrato acido (ACD). Come ci sono molti metodi diversi tra cui scegliere, spetta alla preferenza personale del ricercatore.

Inoltre,quando isolare e manipolare neutrofili devono essere maneggiati con una certa cura per evitare eccessiva attivazione. misure precauzionali includono: solo con oggetti in plastica, nessun vetro; filtrata sterilizzare tutti i tamponi per rimuovere eventuali contaminanti endotossina; quando neutrofili filatura assicurarsi che la centrifuga è ben equilibrato per evitare vibrazioni eccessive; limitare il più possibile i neutrofili tempo rimangono in un pellet dopo centrifugazione; non mantenere in soluzione neutrofili superiore a 5 x 10 ⁶ / ml; ed eseguire l'esperimento non appena possibile dopo l'isolamento.

Questo metodo può essere atto a misurare variazioni dell'area di pH e phagosomal nel tempo utilizzando una scenografia riscaldata a 37 ° C sul microscopio e prendendo istantanee volta ogni 30-60 s dalla stessa posizione, come descritto per la fase di calibrazione. Potrebbe anche teoricamente essere adattato per esperimenti superiore throughput, come in piastre da 96 pozzetti, e per citometria a flusso esperimenti, dove S-1 puòessere usata come indicatore di pH ^23. Tuttavia, in queste impostazioni, l'accento sull'attività singola cella viene sostituito da un effetto più globale sulla popolazione di cellule.

Questo metodo ha lo scopo di fornire una relativamente semplice apparato sperimentale su cui i singoli ricercatori possono adattare alle loro area di interesse. Ricercatori potrebbe voler esplorare neutrofili phagosomal pH e la zona mentre anche misurando movimento di altri ioni, per esempio, la concentrazione di calcio intracellulare. Ci sono diversi fluorescenti Ca ²⁺ indicatori prontamente disponibili per la microscopia confocale, come indo-1, che ha anche spettri doppia emissione a 400 e 475 nm ^24. Queste lunghezze d'onda di emissione non si sovrappongono con S-1 spettri di emissione, ma la lunghezza d'onda di eccitazione è alla fine ultravioletta (UV) dello spettro, che possono essere dannosi per le cellule, e un laser UV non è comune a tutti i microscopi. Una rassegna completa dei diversi indicatorimisurare flusso di calcio intracellulare è coperto da Takahashi et al. ²⁵ e Hillson et al. ^26.

In conclusione, ci sono altri metodi disponibili per misurare il pH phagosomal utilizzando diversi coloranti fluorescenti come Nunes et al. hanno dimostrato ¹³ come pure altri gruppi ^{27, 28.} Altri ricercatori hanno utilizzato anche S-1 per misurare citosolico pH ²⁹ o phagosomal pH ^14. Tuttavia, questo protocollo è unica nel misurare simultaneamente il pH sia citosol e phagosome, che prevede la possibilità di osservare variazioni phagosomal sezione trasversale e distinguere tra tipo selvatico e Hvcn1 ^{- / -} neutrofili topo, e neutrofili umani con e senza lavorando NADPH ossidasi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids  80 CFU	Sigma-Aldrich	RQC14003-10EA	Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions
YPD broth	Sigma-Aldrich	Y1375	Follow manufacturer's instructions, various providers exist
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000	MP Biomedicals	2101514	Use gloves
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000IU/ml	Fannin, Wockhardt UK Ltd	FP1077	We purchased from UCH inpatient pharmacy
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging	Thermo Scientific/Invitrogen	SS22801	Use gloves
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate	Thermo Scientific/Invitrogen	C1272	Use gloves
Vivaglobin human IgG  160mg/ml solution	CSL Behring	received as a gift	Various providers exist
Normal mouse serum	Abcam	ab7486	Various providers exist
Lymphoprep (density gradient medium)	Alere Ltd	1114547	Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Toxic, use gloves, various providers exist
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Toxic, use gloves, various providers exist
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Toxic, use gloves, various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Various providers exist
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Various providers exist
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Various providers exist
Magnesium sulphate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506	Various providers exist
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Various providers exist
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Various providers exist
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434	Various providers exist
Absolute Ethanol	Sigma-Aldrich	2860	Various providers exist
Diphenylene iodonium (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Various providers exist
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	208086	Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate
Poly L lysine	Sigma	P4707	Various providers exist
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700)	Carl Zeiss		The microscope must be able to excite at 555nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600nm, >610nm)
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat	Thistle Scientific	IB-80826	Other appropriate imaging dishes can be substituted
Fluorodish Cell Culture Dish-35mm, 23mm well	World Precision Instruments	FD35-100	Other appropriate imaging dishes can be substituted, different sizes are available
Soniprep 150	MSE		Any appropriate sonicator will suffice
TC20 Automated Cell Counter	BioRad		Various providers exist
1.5ml Protein LoBind Tubes	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA	Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs