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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Peptidi virali-derivati accoppiati a anticorpo-coniugati (ACs) è un approccio guadagnando slancio a causa del potenziale di trasporto molecolare payload con accumulo di cellule aumentata del tumore. Utilizzando metodi comuni per valutare la coniugazione di peptide, AC e accumulo intracellulare di payload e targeting tumorale, questo protocollo consente ai ricercatori durante le fasi iniziali di sviluppo chiave.

Abstract

Anticorpo-coniugati (ACs) modificati con peptidi derivati da virus sono potenzialmente potente classe di agenti di consegna delle cellule tumorali per molecolare payloads utilizzati nel trattamento del cancro e di imaging dovuto accumulazione cellulare aumentata sopra SCA corrente. Durante primi AC in vitro sviluppo, tecniche di fluorescenza e metodiche radioimmunologiche sono sufficienti per determinare la localizzazione intracellulare, efficienza di accumulo e specificità delle cellule bersaglio. Attualmente, non ci è consenso su metodi standardizzati per preparare le celle per valutare la localizzazione e l'accumulo intracellulare di AC. La prova iniziale di ACs per volta con peptidi derivati da virus è fondamentale, soprattutto se sono stati costruiti diversi candidati. Determinare l'accumulo intracellulare di fluorescenza può essere influenzata da segnale di fondo da ACs alla superficie delle cellule e complicano l'interpretazione di accumulo. Per metodiche radioimmunologiche, cellule in genere trattate sono frazionate e misurata la radioattività in diversi compartimenti cellulari. Tuttavia, lisi cellulare variano da una cella a altra e spesso nucleari e citoplasmatici scomparti non sono adeguatamente isolate. Questo può produrre dati fuorvianti sulle proprietà di consegna del carico utile. L'iniezione endovenosa di radiomarcato virus-derivato del peptide-modificato ACs nel tumore topi seguiti da formazione immagine del radionuclide del cuscinetto è un potente metodo per la determinazione delle proprietà di recapito di targeting e capacità di carico del tumore alla fase in vivo della sviluppo. Tuttavia, si tratta di un progresso relativamente recente e alcuni gruppi hanno valutato virus-derivato di ACs di peptide-modificato in questo modo. Descriviamo il trattamento delle cellule trattate per valutare con maggiore precisione virus-derivato di accumulo di AC peptide-modificato quando si utilizza metodiche radioimmunologiche e microscopia confocale. In particolare, un metodo per trypsinizing cellule rimuovere la superficie cellulare associato ACs. Forniamo anche un metodo per migliorare il frazionamento cellulare. Infine, questo protocollo fornisce un metodo in vivo tramite tomografia a emissione di positroni (PET) per la valutazione iniziale del tumore come destinazione proprietà nei topi del tumore-cuscinetto. Usiamo il radioisotopo 64Cu (t1/2 = 12.7 ore) come un payload di esempio in questo protocollo.

Introduzione

Anticorpo-coniugati (ACs) sono prodotti biofarmaceutici che stanno maturando in una classe trasformativa di farmaci efficaci per individuare tumori e migliorare i trattamenti del cancro. Composto di un anticorpo monoclonale (mAb) coniugato al payload molecolare come radioisotopi, piccole molecole e tossine biologiche, ACs sono in grado di fornire questi carichi utili alle cellule tumorali con destinazione squisito antigene affinità e specificità. Quindi ACs hanno il potenziale di significativamente ridurre la tossicità aspecifica e aumentare l'attività di carico al luogo del tumore. Terapeuticamente, ACs trasporto citotossiche piccole molecole (comunemente indicate come anticorpo-farmaco coniugati) sono stati approvati per il trattamento di pazienti con cancro al seno e linfoma di Hodgkin che hanno fallito i trattamenti convenzionali 1, 2. Inoltre, radioisotopi trasporto ACs (riferiti a comunemente come radioimmunoconjugates) sono anche in fase di sviluppo. Un AC trasportando un radioisotopo per l'imaging è approvato per l'identificazione di metastasi di carcinoma della prostata 3. Con molti più terapeutico ACs sottoposti per approvazione 4, l'ottimismo è alta per il futuro di ACs per migliorare cancro cura 5.

Tuttavia, quando si consegnano chemioterapici o radioisotopi, ACs hanno difficoltà accumulando efficacemente questi carichi all'interno delle cellule bersaglio. Questo aspetto contribuisce in maniera significativa in molti casi l'impossibilità di ACs per fornire la sopravvivenza libera da malattia di lunga durata o tumore ad alto contrasto imaging 6,7. In generale, una volta ACs associare loro antigene bersaglio essi sono interiorizzati attraverso un processo noto come endocytosis ricevitore-mediato. L'ACs sono quindi intrappolato all'interno di endosomi e vittime della tratta ai lisosomi per degradazione e carico utile rilasciare 8. Il processo di traffico intracellulare pone sfide per ACs raggiungere una capacità di carico elevata specificità e l'efficacia contro le cellule tumorali bersaglio. Ad esempio, molti antigeni come Her2 (destinazione per terapeutica AC Trastuzumab-emtansine) può riciclare fino all'85% di anticorpi legati ai primi 30 min 9. Inoltre, una volta che si verifica degrado, rilasciato chemioterapici e radioisotopi possono essere attivamente esportati da aumentata espressione e/o attività di trasporto di membrana associato proteine 10,11. Degradazione del lisosoma ostacola anche la consegna di payload romanzo biologici quali gli enzimi terapeutici e oligonucleotidi che possono essere disattivato 12,13. In sostanza, la cellula tumorale è altamente efficace a abrogare l'accumulazione intracellulare necessario di payload consegnato da ACs.

Questo protocollo viene descritto come implementare il concetto di ACs-accoppiato ai peptidi derivati da virus, specificamente per la fuga endosoma allettamento e localizzazione al nucleo della cellula. Con tale sofisticazione di manipolare sistemi host cella, non è sorprendente che lo sviluppo di proteine derivate da virus e peptidi come potenziali biofarmaci lungo è stato radicato nella ricerca terapeutica 14. Per milioni di anni i virus hanno evoluto per acquisire un'eccezionale collezione di proteine in grado di sfruttare sistemi di cellule di mammifero fisiologico normale per entrare in modo efficace le cellule ospite. Per i virus che sono interiorizzati via endocytosis ricevitore-mediato, essi sono anche sfidati con l'escape di traffico per il lisosoma dove l'assalto di una concentrazione localizzata delle proteasi può essere problematico per la sopravvivenza. Un ben caratterizzato peptide virale-derivati utilizzato nella consegna della droga per sfuggire endosoma allettamento è il transactivator di virus dell'immunodeficienza umana di trascrizione (Tat) proteina 15. Tat è in grado di sfuggire l'allettamento endosoma rilevando il punto in cui cambiamenti conformazionali della proteina si verificano abilitazione Tat per inserirsi in e disturbare la membrana endosomal 16basso pH. In questo modo coniugati Tat-payload in grado di accedere il citoplasma. Il secondo elemento di manipolazione virale relazionato al presente protocollo è l'approccio utilizzato per fornire geni terapeutici e farmaci al nucleo 17. Virus si sono evoluti per manipolare correttamente macchina cellula ospite per progredire oltre la membrana nucleare passando attraverso il complesso del poro nucleare (NPC). Macromolecole cellulari contengono (o si legano proteine che contengono) proteine (ad es. karyopherins α e β), che forniscono i movimenti richiesti attraverso il NPC di trasporto segnali di localizzazione nucleare (NLSs) per l'associazione al nucleare. Virus hanno sviluppato le proteine per contenere sequenze NLS che forniscono loro la capacità di utilizzare proteine di trasporto cellula ospite per la spola nel nucleo 18.

ACs numerosi precedentemente sono stati funzionalizzati con peptidi derivati da Tat e NLS e testati per la loro capacità di accumularsi all'interno delle cellule tumorali e per individuare i tumori 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tabella 1). Consegna payload citotossici hanno dimostrato che ACs modificato con peptidi derivati da virus sono in grado di aumentare in modo significativo accumulo cellulare, citotossicità e tumore uccidendo più non modificato ACs 22,26. Una caratteristica comune per questa nuova classe di AC è la loro costruzione. In genere, peptidi contengono una cisteina terminale fornendo un gruppo solfidrilico libero. MAbs sono in primo luogo ha reagiti con un reticolante bifunzionale noncleavable contenenti N- Idrossisuccinimide (NHS) e gruppi di maleimide alle estremità opposte. Gli esteri di NHS reagiscono con le ammine primarie il mAb per formare legami ammidici. Il mAb ha reagito con maleimide gratis gruppi poi reagisce con i gruppi sulfidrilici sui peptidi per formare un legame tioestere e legando il peptide e mAb. Anche se crosslinkante reticolanti sono stati usati 28, eterobifunzionali crosslinker sono più comunemente utilizzati nella costruzione di virus-derivato del peptide-ACs 22,23,26, 31,32. Questo protocollo utilizza specificamente il reticolante Sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) cicloesano-1-carbossilato (sulfo-SMCC) per la sua facilità d'uso e perché viene usato nel coniugato anticorpo-farmaco approvato Trastuzumab-emtansine e in molti virus-derivato del peptide-ACs 8,22,23,26,31,32. Elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) è il metodo principale per determinare inizialmente coniugazione efficienza e per semi-quantificazione del numero di peptidi per mAb. Microscopia confocale utilizzando un anticorpo secondario marcato fluorescente specifico per il mAb è in genere il metodo per valutare inizialmente proprietà di distribuzione intracellulare del virus-derivato del peptide-modificato ACs. Finora, radioisotopi sono i payload primari consegnati da virus-derivato del peptide-modificato ACs. Radioisotopi sono vantaggiose perché radioattività nelle cellule è facilmente quantificati contando gamma. Inoltre, ACs che si traducono in modelli murini di cancri umani fornire ai ricercatori la possibilità di valutare il targeting tumorale utilizzando modalità di imaging molecolare come singola emissione del fotone tomografia computata e tomografia a emissione di positroni (PET) 23 , 32 , 33. In generale, la costruzione e la convalida di metodi principalmente utilizzati dai ricercatori di prova forniscono una valutazione molto buona di ACs per volta con peptidi derivati da virus durante la fase di sviluppo iniziale di immettere e fornire efficacemente il carico utile all'interno di cellule bersaglio e ai tumori di destinazione.

Tat - e NLS-modificato ACs hanno illuminati zone chiave per migliorare ulteriormente la consegna del carico utile all'interno di cellule tumorali e ai tumori. Rispetto per volta NLS ACs, l'efficienza in accumulo intracellulare può essere modesto 23,31,34. L'accumulo intracellulare inefficiente è causata dall'allettamento endosomal continuato. In vivo targeting tumorale può essere diminuito anche con entrambi Tat - e NLS-modificato ACs. Le sequenze attive di Tat e NLS contengono parecchi residui di caricate positive. Quando associata a anticorpi monoclonali, la carica nel complesso cationico può essere significativamente aumentato 35. Di conseguenza, il Tat - e NLS-modificato ACs hanno aumentato l'assorbimento nei tessuti sani e aumento del sangue rapido gioco.

Il nostro gruppo ha sviluppato un composito composto costituito da acido colico collegato a NLS (ChAcNLS; Figura 1). ChAcNLS-modificato ACs sono in grado di aumentare l'accumulo intracellulare di radioisotopi trasportati e migliorare il targeting tumorale rispetto al tradizionale e NLS-modificato ACs 33,34. Il meccanismo dietro l'acido colico è ispirato dalla possibilità di selezionare trattenere virus che non si basano sulla fusione della membrana di utilizzare acido colico per innescare endosoma fuga attraverso la formazione di ceramide. Ad esempio, suina virus enterici reclute acido colico che attiva sfingomielinasi, che catalizza l'idrolisi della sfingomielina in ceramide 36,37,38. Questo destabilizza membrana endosomal e permette per la fuga di virus. Così, acido colico è un'altra componente derivato da virus che complementa NLS.

Come questo campo si muove avanti e futuri avanzamenti si verificano nella consegna del carico utile da ACs modificato con peptidi derivati di virus, è il momento opportuno per fornire dimostrazioni visive delle loro caratteristiche biochimiche e funzionali durante lo sviluppo iniziale. Qui, descriviamo il nostro protocollo per la valutazione iniziale del virus-derivato del peptide-modificato ACs per la determinazione semplice ma efficiente di accumulo intracellulare e targeting tumorale durante la prima fase di sviluppo. Usiamo i mAbs commercialmente disponibili 7 3 e A14 come sistemi modello di esempio. Procedura 1 descrive l'uso di SDS-PAGE come un metodo che permette di ' go/no go' decisioni per ACs costruito. Procedura 2 descrive un metodo utilizzando trypsinization permettendo di migliorare la visualizzazione della distribuzione intracellulare di AC e di accumulo. Procedura 3 descrive un metodo per frazionamento migliorata intracellulare determinare con precisione la localizzazione nucleare. In questa procedura che utilizziamo il payload 64Cu (t1/2 = 12.7 ore) perché è vulnerabile a efflusso cellulare ed è un emettitore di positroni 10. Così, procedura 4 descrive in vivo del tumore targeting caratterizzazione da PET imaging per visualizzare captazione tumorale rispetto al fondo (cioè del nontarget tessuti sani) e determinare se l'esempio AC può specificamente ed efficacemente tumori di destinazione. Questi metodi sono sufficienti per gli investigatori lo sviluppo di ACs per volta con peptidi derivati da virus per identificare i candidati per l'ulteriore avanzamento.

Protocollo

In vivo esperimenti sugli animali descritti sono stati effettuati secondo un protocollo approvato e sotto le linee guida etiche del comitato etico di Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke per esperimenti di animali.

1. anticorpo Peptide coniugazione

Nota: ChAcNLS possono essere sintetizzati in qualsiasi produttore commerciale peptide o la piattaforma di servizi di sintesi del peptide di università-affiliato. La sintesi di ChAcNLS può essere trovata in riferimento 34. Per le procedure 1 e 2 utilizzare il mAb 7 3, che è specifico per l'antigene di leucemia IL-3Rα 39.

  1. In un tubo del microcentrifuge 1,7 mL, preparare un 10 mg/mL soluzione (anticorpo totale ~ 1 mg) di 3 di 7 in tampone fosfato salino (PBS), pH 7,6.
  2. Sciogliere sulfo-SMCC in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione di 5-10 mM. Vortex la soluzione accuratamente funziona meglio al fine di ottenere la completa dissoluzione.
  3. Aggiungere alla provetta contenente 7 3 la soluzione disciolti sulfo-SMCC (in genere tra 5-20 µ l a seconda il rapporto molare di sulfo-SMCC-a - 7 3 desiderato). Si raccomandano test sulfo-SMCC-a - 7 3 rapporti di 10 - 25- e 50-a-1. Incubare a temperatura ambiente per 1 h.
  4. Purificare e concentrare il 3 7 maleimide-derivatizzati utilizzando un cambio di dispositivo e buffer di ultrafiltrazione in PBS, pH 7.0. Centrifugare a 8.000 x g per circa 5 min. scartare flusso attraverso e riempimento con PBS, pH 7.0 e centrifugare nuovamente.
    1. Eseguire questo 7 - 8 volte di scambiare completamente nel buffer. Recuperare il concentrato 3 7 proteine inserendo il dispositivo di filtro upside-down in una microcentrifuga pulito. Centrifugare per 2 min 1.000 x g. volume di recupero dovrebbe essere di circa 0,3 mL
  5. Nella provetta contenente il 3 7 maleimide-attivato, aggiungere 2 volte eccesso molare di ChAcNLS riguardante il rapporto di sulfo-SMCC-- 7-3 utilizzato nel passaggio precedente e incubare per una notte a 4 ° C. Ad esempio, se è stato utilizzato un rapporto di sulfo-SMCC-a - 7 3 10-a-1, quindi utilizzare un rapporto di ChAcNLS-a - 7 3 20-a-1. Volume totale non deve essere modificato in modo significativo.
    Nota: Anche se ChAcNLS non provoca precipitazioni durante il processo di coniugazione, questa è una possibilità che potrebbe verificarsi con altri peptidi. Osservare il tubo durante la reazione per segni di precipitazione, che molto probabilmente è causato quando peptidi sono idrofobi. In questi casi può essere la pena di rivisitare il peptide di interesse al fine di progettare le modifiche per fornire maggiore idrofilia.
  6. Concentrare il 7G 3-ChAcNLS utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione a exchange di concentrazione e buffer desiderato in PBS pH 7.4 (Vedi punto 1.4). Il rendimento di recupero delle proteine totali deve essere ≥ 75% del materiale di partenza originale.
  7. Eseguire SDS-PAGE per valutare i candidati di 3-ChAcNLS 7G costruito utilizzando un gel di poliacrilammide del 12% (fornisce una separazione sufficiente del ChAcNLS coniugato pesante e catene da Peis catene leggere). Mix 10 μg di 7G 3-ChAcNLS nel caricamento pagina buffer contenente μL 2 β-mercaptoetanolo e caricare nel pozzo.
  8. Impostare la tensione appropriata (120 V per 1 h per un gel 12%) ed eseguire l'elettroforesi. Interrompere l'elettroforesi quando parte anteriore di tintura Coomassie raggiunge il fondo del gel.
    Nota: Non lasciare che il fronte di tintura Coomassie colare il gel.
  9. Rimuovere il gel da apparato elettroforesi e sciacquare con soluzione contenente 10% v/v di metanolo di v/v di acido acetico glaciale e 20% decolorante.
  10. Scattare una foto del gel e con un righello e misura la distanza (cm) migrati per gli standard e 7 3 coniugati. Calcolare il valore di fattore (Rf) di ritenzione, che è la distanza migrati diviso per la lunghezza del gel (da dove la proteina viene caricata alla parte anteriore di migrazione di Coomassie). Tracciare il peso molecolare (MW) nel registro contro i valori di Rf da ogni proteina standard ed estrapolare la dimensione del 3 7 coniugati.
  11. Calcolare il numero di peptidi per anticorpo dividendo la differenza di MW tra 7 3 coniugati e non modificato 7 3 da 1768.5 g/mol (MW di ChAcNLS).
  12. Prendere immagini digitali del gel tinto Coomassie ed eseguire analisi densitometria. A questo punto, selezione di un candidato di piombo può essere basata sull'AC con il numero massimo di molecole ChAcNLS che non contiene specie di aggregazione significativa.

2. microscopio confocale per accumulo intracellulare valutazione

Nota: È importante verificare la selettività delle cellule di accumulo intracellulare di mAbs peptide-modificato prima dello sviluppare formulazioni con un payload di interesse. Perché Tat ha anche dimostrato di avere una propensione per la penetrazione delle cellule non specifico, vale la pena di selettività intracellulare analyzing primo accumulo e cella prima passi costoso sviluppo impresa con payload costosi. Per questo motivo, procedura 1 dovrebbe anche modificare isotipo specifico controllo irrilevante mAbs. Per il resto del protocollo lavoreremo con ACs per volta con 10 ChAcNLS molecole per l'anticorpo. Un disegno schematico, compresi i passaggi chiave per procedure 2 e 3 è descritto nella Figura 2.

Attenzione: Questo passaggio del protocollo prevede l'utilizzo e manipolazione di paraformaldeide. Quando si gestisce, si prega di seguire le istruzioni del produttore.

  1. Trattare le cellule bersaglio TF-1a con 200 nM di 7G. 3-ChAcNLS compresi per volta controllo mAbs. Incubare 5 x 106 cellule antigene-positive con i coniugati per 1h a 37 ° C.
  2. Dopo 1 h, rimuovere il surnatante e lavare con 1 mL 3 x in PBS ghiacciata. Aggiungi media fresco e incubare per un'ora a 37 ° C.
  3. Dopo l'ora aggiuntiva, rimuovere il surnatante e lavare x 3 in 1 mL di PBS ghiacciata. Aggiungere 0,5 mL di PBS contenente 0,25% acido tripsina e acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) a 37 ° C per 3 fino a 30 min.
    Nota: Durante il test pilota iniziale si consiglia di non tripsinizzano le cellule al fine di determinare le differenze nell'accumulo intracellulare di AC. Questo protocollo promuove l'uso della tripsina e dimostriamo come questo migliora la valutazione dell'efficienza di accumulo intracellulare di diversi candidati di AC.
    1. Prova i diversi tempi per incubazione controllando visivamente per tutte le celle che si staccano. Inoltre, incubare le aliquote delle cellule con vitalità colorazione soluzioni ed eseguire analisi cytometric di flusso come descritto in precedenza 40.
    2. Neutralizzare la tripsina con 1,5 mL di coltura cellulare RPMI 1640 media/10% siero bovino fetale. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min, rimuovere il surnatante e lavare 3x in 0,5 mL di PBS ghiacciata.
  4. Cellule di correzione in 0,5 mL di PBS contenente 1% paraformaldeide e 1% di saccarosio in ghiaccio per 30 min lavaggio cellule 3x in 0,5 mL di PBS ghiacciata e centrifuga a 250 x g per 5 min Permeabilize le cellule in 0,5 mL di PBS contenente 0,15% Triton X-100 per 5 min sul ghiaccio. Lavare le cellule in PBS ghiacciata e ripetere la centrifugazione.
  5. Sospendere le cellule in 0,1 mL di PBS contenente 2 μg/mL (o il produttore concentrazione raccomandata) di un anti-murino (isotipo specifico) Fc anticorpo policlonale secondario coniugato a 647 AlexaFluor per 1 h a temperatura ambiente al buio.
    1. Centrifugare a 250 x g per 5 min e lavare le cellule 3x in 0,5 mL di PBS ghiacciata. Sospendere le cellule in 0,5 mL di PBS.
      PAUSA: Cellule possono essere riposto nel frigo.
      Nota: È necessario selezionare un anticorpo secondario che riconosce l'isotipo corretta del mAb di interesse. AF647 è selezionata a causa della sua emissione all'infrarosso lontano, che non interferisce con propidio ioduro (PI) del nucleo.
  6. Aggiungere PI ad una concentrazione di 10 μg/mL per il contenitore con le cellule. Successivamente, montare 1 x 105 celle su vetrini utilizzando mezzi di montaggio e coprire con un vetrino coprioggetti.
  7. Esaminare le cellule con un obiettivo a immersione in olio Plan Apo 60 X 1,42 NA su un laser invertito microscopio confocale a scansione. Rilevare la fluorescenza PI usando il laser di argon 488 nm e il prisma spettrale di scansione impostato per 600-650 nm. Per fluorescenza AF647 utilizzare il laser a elio-neon 633 nm e il prisma spettrale di scansione impostato per 650-700 nm. Raccogliere le emissioni di fluorescenza da PI e AF647 in sequenza.
    Nota: Utilizzare la stessa impostazione durante la valutazione e il confronto delle cellule. Tuttavia, sarà necessario regolare le impostazioni per le cellule tripsinizzate rispetto alle cellule non-tripsinizzate.
  8. Utilizzare software di microscopio per acquisire immagini. Raccogliere immagini utilizzando seriale orizzontale sezioni ottiche di 1.024 x 1.024 pixel con 2 X linea media prelevate a intervalli di 0,5 μm attraverso lo spessore della intera cella. Presentare le immagini impilate come z-le proiezioni da quattro fette consecutivi presso l'intensità di fluorescenza massima.
  9. Analizzare le cellule con software del microscopio. Registrare il modello di distribuzione cellulare dei coniugati. In particolare, valutare se è raggruppata intracellulare fluorescenza nel citoplasma e accanto alla cella superficiale o diffusa e omogenea. Anche valutare l'intensità di fluorescenza relativa per cella.

3. radioattivi AC costruzione e frazionamento cellulare per la valutazione dell'efficienza di consegna intracellulare Cu 64

Attenzione: Le procedure 3 e 4 prevedono l'utilizzo e manipolazione di radioattività. Prima di eseguire questi passaggi, i ricercatori avrebbe dovuto approvare la formazione sulla sicurezza e protocolli approvati dall'autorità di sicurezza di loro istituzione radiazione.

Nota: Per le procedure 3 e 4 usiamo il mAb A14, che è specifico per l'antigene del cancro invasivo della vescica IL-5Rα41. Inoltre, tutti gli esperimenti sono ora sensibile a causa della breve emivita di 64Cu. In generale, è meglio non aspettare oltre 1 settimana per effettuare esperimenti in vitro e non più di 72 h per studi in vivo .

  1. In un tubo di 1,7 mL sospensione 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic acido (NOTA-NHS) in DMSO ad una concentrazione di 10 mM.
  2. Reagiscono 50 volte eccesso molare di NOTA-NHS con A14 (2 mg di materiale di partenza) in bicarbonato di sodio 0,1 M a pH 8,6 per 1 h a temperatura ambiente in un volume ≤ 0,5 mL (il volume finale di NOTA-NHS non deve superare il 2% v/v del volume totale).
  3. Purificare e tampone-cambio NOTA-A14 utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione in PBS, pH 7,6 (Vedi punto 1.4).
  4. Per la successiva collocazione della ChAcNLS, passaggi 1.2-1.6.
  5. Reagire NOTA-A14-ChAcNLS (lotti di 250 μg) con 100 megabecquerel (MBq) di 64Cuclo2 a bicarbonato di sodio 0,1 M, pH 5.5 per 1h a 37 ° C ≤ 0,1 mL. 64 Cu è prodotto il ciclotrone TR-PET presso il CIMS 42.
  6. Concentrarsi 64Cu-A14-ChAcNLS in PBS pH 7.4 utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione fino alla concentrazione desiderata (Vedi punto 1.4).
  7. Determinare l'efficienza radiolabeling strisce di 64Cu-A14-ChAcNLS di cromatografia di strato sottile istantanea (ITLC) mediante cromatografia e 0,1 M, pH 5.5 sodio citrato (ITLC eluente) come solvente. Applicare 0,5 aliquota μL della soluzione di reazione alla striscia ITLC. Eseguire un autoradiograph della striscia e di ottenere un'immagine digitale.
    1. Eseguire densitometria per ottenere la quota di associazione e libero 64Cu. Se libero 64contenuto Cu è > 5%, tornare al passaggio precedente ed eseguire ulteriore purificazione.
    2. Inoltre, eseguire SDS-PAGE con Coomassie macchiatura per valutare aggregazioni. Eseguire una SDS-PAGE secondo seguito da un autoradiograph del gel per determinare se ci sono specie di aggregazione radiomarcato.
  8. Affinità vincolante punto di controllo di qualità: incubare 64Cu-A14 coniugati alle concentrazioni aumentanti (0-100 nM) in duplice copia con 1 x 106 cellule bersaglio / mL. Per stimare il legame non specifico, miscelare i campioni duplicati di 64Cu-A14 coniugati con cellule in presenza di eccesso molare di 100 volte di adenoide A14.
    1. Dopo 1 h di incubazione in ghiaccio, lavare le cellule e contare esempi di anticorpo rilegato totale e totale non specifico anticorpo rilegato in un gamma counter. Grafico grippaggio specifico (anticorpo rilegato totale - non specifico associato anticorpo) contro reattiva gratis 64Cu-A14 (nM) usato nell'analisi. Determinare la costante di dissociazione (Kd) di regressione non lineare utilizzando grafica software.
  9. Per gli studi di accumulo cellulare Cu 64: curare le cellule con 100 nM del 64con etichetta Cu A14 coniugati per 1 h, 6 h, e 24 h a 37 ° C come descritto in precedenza33. Includere ulteriori parametri quali il trattamento in presenza di A14 non modificato per bloccare IL-5Rα siti e a 4 ° C per bloccare l'internalizzazione del recettore-mediata.
  10. Al momento definito punti, come precedentemente descritto nel passo 2.3 - 2.3.2, aggiungere 0,5 mL di tripsina di PBS contenente 0,25% ed EDTA a 37 ° C seguita da neutralizzazione e lavaggio.
  11. Incubare le cellule in tampone di lisi della membrana plasmatica contenente 1% NP-40, Tris 10 mM pH 7.5, 10 millimetri di NaCl, 3 mM MgCl2 buffer in ghiaccio per 10 min. Centrifugare le cellule lisate membrana plasmatica a 90 x g per 5 min.
  12. Rimuovere il surnatante e collocare in provetta di fresco. Questo rappresenta la frazione citoplasmatica. Lavare i nuclei 3 x in PBS freddo e aggiungere lavaggi alla frazione citoplasmatica.
  13. Garantire flaconi contenenti le frazioni nucleari e citoplasmatiche sono sigillati. Poi metterli in un gamma counter calibrato per 64Cu allo scopo di convertire conteggi MBq.
  14. Determinare la qualità dell'isolamento di nuclei eseguendo analisi Western blot per lamina a/c, una proteina nucleare limitata e Rab7, una proteina citoplasmatica abbondante su tutta la cellula frazioni lisate, nucleari e citoplasmatiche.
    1. Trattamento 5 x 106 cellule con 500 μL di tampone del saggio (RIPA) radio-immunoprecipitazione e il buffer di lisi della membrana plasmatica in passo 3,12 contenente 1%, 2% e 4% NP-40. Inoltre, trattare i nuclei isolati in 500 μL di tampone di RIPA per ottenere proteine nucleari isolate.
    2. Precipitare le proteine delle cellule nucleari, citoplasmatici e intero isolato utilizzando 4 volte il volume del campione di acetone freddo per 60 min a-20 ° C. Centrifugare a 13.000 x g per 10 min e decantare il supernatante facendo attenzione a non staccare il pellet di proteina. Aggiungere 100 μL di PBS per dissolvere le proteine.
    3. Caricare 10 µ g di proteina in ogni pozzetto del gel di SDS-PAGE 10%. Eseguire l'elettroforesi come descritto in 1.7-1.9. Eseguire trasferimento di Western Blot come descritto in precedenza in refeference 43.
    4. Identificare la scala marcatori che meglio corrispondono a un MW di ~ 40 kDa. Tagliate la membrana in mezzo a questo indicatore. Sonda il blot contenenti le proteine MW superiore con gli anticorpi di lamina A/C-specifica. Sonda la membrana con le proteine inferiore MW con gli anticorpi specifici 7 di Rab. Western blot è una tecnica ben nota e non descritti nel presente protocollo.

4. PET Imaging valutazione di Targeting tumorale

Nota: Le tecniche di impiantare le cellule del tumore nei topi per generare gli xenotrapianti heterotopic sono ben note e maggior parte dei laboratori hanno protocolli interni su misura per il loro sistema di tumore. Così, questo non è coperto dal protocollo. Il modello di xenotrapianto sarà nonobese diabetico/topi immunodeficienti combinati severi (NOD/SCID) sopportano i tumori della vescica invasivo di IL-5Rα-positivo HT-1376 e HT-B9. Cellule del tumore della vescica invasivo IL-5Rα-positivi comprendono > 66% delle cellule totali in xenotrapianto. Al contrario, solo ~ 11% delle cellule HT-B9 IL-5Rα-positivi erano contenuti in xenotrapianti sviluppati41. Così questo modello rappresenta un eccellente esempio di valutazione AC targeting tumorale in due tumori che rappresentano l'eterogeneità del tumore paziente prevedibili.

  1. In gruppi contenenti ≥ 4 topi (NOD/SCID), iniettare 20-30 μg (6-9 MBq) di 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS e 64Cu-A14 nella vena caudale.
  2. Lo stesso giorno posto un fantasma cilindrico (24,8 mL) contenenti 5 MBq di 64Cu per convertire i conteggi radioattivi al secondo in dose iniettata per grammo di tessuto (%ID/g).
  3. Attendere 48 ore e poi anestetizzare topi inserendoli in un'aula di induzione con 1,5 L/min di ossigeno con 2% isoflurane. Applicare pomata oftalmica sterile per mouse occhi dopo induzione e prima del posizionamento in PET scanner.
  4. Trasferire rapidamente il mouse in una tabella di PET scanner in posizione prona headfirst con un cono di naso per isoflurano. Posizione la respirazione e sonde rettali e frequenza monitor di temperatura e la respirazione per mantenere condizioni fisiologiche durante l'esperimento come precedentemente descritto 44.
  5. Avviare l'acquisizione di dati PET utilizzando un'impostazione di modalità di campionamento regolare e una finestra di energia di keV 250-650. In genere, una scansione statica di 45 minuti per topo è sufficiente a fornire sufficienti eventi coincidenti per la ricostruzione e la produzione di immagini PET di alta qualità.
  6. Dopo la scansione di 64Cu-AC, rimuovere il mouse dallo scanner e posizionarlo nella gabbia. Consentire per il mouse sufficientemente recuperare prima di tornare all'alloggio degli animali.
  7. Ottenere immagini ricostruite utilizzando 20 iterazioni di un algoritmo di massima probabilità Expectation Maximization tridimensionale.
  8. Eseguire regione di analisi di interesse (ROI) del tumore e visivamente valutabili organi utilizzando il software di AMMIDE.
    1. Disegnare ROIs per ottenere dati quantitativi %ID/g utilizzando manualmente l'impostazione 3D strumento a mano libera e delineare con cura i tumori o il muscolo della coscia adiacente. I conteggi per pixel nel ROI si convertirà a %ID/g dal precedente punto 4.2.
  9. Confronta 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS immagini per contrasto del tumore e quantitativa ROI % ID/g e rapporti di tumore--fondo.

Risultati

Per procedura 1, la costruzione di 3 7 modificato con ChAcNLS usando sulfo-SMCC come un reticolante è molto affidabile. In genere, quando caricati su un gel di 12% e analizzati da SDS-PAGE, questo risultati in un aumento graduale distinguibile MW proporzionale all'aumento sulfo-SMCC-a - 7 3 rapporti utilizzati e permette per le catene pesanti e leggere essere valutati singolarmente per ChAcNLS Coniugazione (Figura 3). 7G 3 ha reagito a 10, 20, 25 e 50-a-1 sulfo-SMCC-a - ...

Discussione

Principali obiettivi di consegna sistemica di agenti anti-cancro sono di accumulo presso il sito del tumore e l'assorbimento all'interno delle cellule tumorali di aumentare e diminuire gli effetti collaterali indesiderati in tessuti sani. Consegna di AC mirati di payload molecolare alle cellule del tumore è un approccio molto promettente per trattare e rilevare i tumori. Tuttavia, la mancanza di efficacia causata dall'allettamento endosoma e giù degradazione lisosomiale flusso rimane una sfida importante. Mentre questo...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato finanziato dalla Cancer Research Society (Canada) e il CIMS. Gli autori ringraziano il Dr. Samia Ait-Mohand e Jean-Francois Beaudoin per assistenza. Dr. Angel Lopez (University of South Australia) per mAb A14.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Sulfo-SMCCThermo Scientific22122There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal FiltersEMD MilliporeUFC505096There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope StandardsBioRad1610375EDUMulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugateThermo ScientificA-212351 - 10 μg/mL recommended
NOTA-NHSCheMatechC100
Lamin A/C antibody (N-18)Santa Cruz Biotechnologysc-6215
Rab7 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-376362
A14 mAbBD Biosciences555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Thermo ScientificNP0007
2-MercaptoethanolSigma AldrichM3148-25ML
TF-1a cellsATCCATCC CRL-2003
RPMI 1640 mediumATCCATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction bufferThermo Scientific89900
AMIDE medical imaging softwareavailable at amide.sourceforge.netCompletely free download
FluoView FV1000 Confocal MicroscopeOlympus
Fluoview SoftwareOlympuswww.olympus-lifescience.com
ITLC stripsBiodex150-771

Riferimenti

  1. Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
  2. Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
  3. Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
  4. Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
  5. Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
  6. Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
  7. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  8. Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
  9. Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
  10. Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
  11. Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
  12. Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
  13. Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins--entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
  14. Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
  15. Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen, ., H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
  16. Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
  17. Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
  18. Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
  19. Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
  20. Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
  21. Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
  22. Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
  23. Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
  24. Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
  25. Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
  26. Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
  27. Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
  28. Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
  29. Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
  30. Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
  31. Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
  32. Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
  33. Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
  34. Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
  35. Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
  36. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
  37. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
  38. Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
  39. Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4 (2014).
  40. King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
  41. Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195 (2017).
  42. Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
  43. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  44. Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761 (2013).
  45. Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
  46. Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
  47. Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
  48. Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
  49. Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
  50. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).

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