JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Вирусные производные пептиды, в сочетании с антител конъюгатов (ACs) — это подход, набирает обороты из-за возможности доставлять молекулярной аппаратуру с накоплением рост опухолевых клеток. Используя общие методы для оценки пептид спряжение, переменного тока и полезной нагрузки внутриклеточного накопления и опухоли таргетинга, этот протокол помогает исследователям на этапах первоначального развития.

Аннотация

Антитела конъюгатов (АКГ) изменен с пептидами, вирус производные являются потенциально мощный класс опухолевых клеток агентов доставки для молекулярной нагрузок используется в лечении рака и изображений из-за увеличения сотовой накопления над текущей ACs. Во время ранних переменного тока в vitro развития, методы флуоресценции и Радиоиммуноанализы достаточно для определения внутриклеточной локализации, накопление эффективность и специфики целевой ячейки. В настоящее время нет консенсуса на стандартизированные методы подготовки клетки для оценки AC внутриклеточного накопления и локализации. Первоначальное тестирование ACs с вирусом производные пептиды имеет решающее значение, особенно если были построены несколько кандидатов. Определение внутриклеточного накопления флуоресценции могут быть затронуты фонового сигнала от ACs на поверхности клеток и усложнить толкование накопления. Для Радиоиммуноанализы фракционированный обычно обработанные клетки и измерения радиоактивности в различных клеточных компартментов. Однако лизис клеток зависит от ячейки к ячейке и часто ядерные и цитоплазматические отсеков не адекватно изолированы. Это может производить вводящие в заблуждение данные о свойствах доставки полезной нагрузки. Внутривенные инъекции radiolabeled вирус производные пептид модифицированные ACs в опухоли, принимая мышей, следуют радионуклидной визуализации-это мощный метод для определения свойства доставки опухоли ориентации и полезной нагрузки в в естественных условиях этапа развития. Однако это относительно недавнее улучшение и несколько групп оценивается вирус производные пептид модифицированные ACs таким образом. Мы описываем обработки обработанные клетки более точно оценить вирус производные пептид модифицированные накопление переменного тока при использовании confocal микроскопии и Радиоиммуноанализы. В частности метод trypsinizing клетки, чтобы удалить поверхности клетки связаны ACs. Мы также предоставляют метод для улучшения клеточной фракционирования. Наконец этот протокол предоставляет метод в естественных условиях с использованием позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) для оценки первоначальной опухоли, ориентация свойства опухоли подшипник мышей. Мы используем радиоизотопные 64Cu (t1/2 = 12,7 ч) как полезные данные примера в настоящем Протоколе.

Введение

Антитела конъюгатов (АКГ) являются биофармацевтических препаратов, которые созревают в класс трансформативных эффективных препаратов для улучшения лечения рака и для обнаружения опухолей. Состоит из моноклональных антител (МАБ), конъюгированных с молекулярной полезных радиоизотопов, малые молекулы и биологических токсинов, ACs способны доставить этих полезных для раковых клеток с изысканной целевой антигена сродства и специфичностью. Таким образом ACs могут значительно сократить неспецифических токсичности и увеличения полезной деятельности на объекте опухоли. Терапевтически ACs, транспортировки цитотоксических малых молекул (обычно упоминается как антитела наркотиков конъюгатов) были одобрены для лечения пациентов с раком молочной железы и лимфомы Ходжкина, которые потерпели неудачу традиционные методы лечения 1, 2. Кроме того, перевозящих радиоизотопов ACs (обычно называют radioimmunoconjugates) также находятся в стадии разработки. Переменного тока транспортировки радиоизотопов для визуализации предназначено для выявления метастазов рака простаты 3. С многие терапевтический ACs, представленный для утверждения 4оптимизм является высоким для будущего ACs для улучшения рака уход 5.

Тем не менее при доставке химиотерапевтические или радиоизотопов, ACs испытывают трудности, эффективно накапливать эти полезных нагрузок внутри клеток-мишеней. Этот аспект значительно способствует во многих случаях в неспособности ACs предоставлять долгосрочные безвирусного выживания или опухоль высококонтрастных изображений 6,7. В общем после того, как ACs привязать их целевой антиген они являются внутренним через процесс, известный как рецептор опосредованный эндоцитоз. ACs затем ловушке внутри endosomes и торговли для лизосомы деградации и грузоподъемность выпуска 8. Процесс внутриклеточного торговли создает проблемы для ACs для достижения высокой полезной специфика и эффективность против раковых клеток-мишеней. Например, многие антигены например Her2 (целевой показатель для терапевтического AC трастузумаб emtansine) можно перерабатывать до 85% связанного антител в первые 30 мин 9. Кроме того после того, как происходит деградация, выпущенный химиотерапевтические и радиоизотопов могут активно экспортироваться увеличение выражение или активность мембранных связанные транспортных белков 10,11. Лизосома деградации также препятствует оказанию полезных новых биологических такие терапевтические ферментов и олигонуклеотиды, которые могут быть отключены 12,13. По существу раковые клетки очень эффективен при отмены необходимые внутриклеточное накопление полезных предоставляемых ACs.

Этот протокол описывает способы реализации концепции ACs связаны с вирусом производные пептиды, специально для побега endosome изобличения и локализации клеточное ядро. С такой сложности манипулировать принимающей ячейки системы это не удивительно, что развитие вируса производных белков и пептидов как потенциальных биофармацевтики давно были укоренившиеся в терапевтических исследованиях 14. За миллионы лет вирусы эволюционировали, чтобы приобрести исключительную коллекцию белки способны использовать нормальное физиологическое mammalian клетки систем для того, чтобы эффективно ввести клеток хозяина. Для вирусов, которые являются внутренним через рецептор опосредованный эндоцитоз они также сталкиваются с побега людьми Лизосома где натиском локализованных концентрации протеаз может быть проблематичным для выживания. Хорошо характеризуется вирусный производные пептид, используемых в доставки лекарств для экранирования endosome захвата является transactivator вирусом иммунодефицита человека транскрипции (ТАТ) белок 15. ТАТ состоянии избежать захвата endosome путем зондирования низкий рН в какой-то момент белка конформационные изменения происходят благоприятные ТАТ вставить себя в и сорвать от англ мембраны 16. Это приводит к Tat грузоподъемность конъюгатов возможность доступа к цитоплазме. Второй элемент вирусный манипуляции, связанные с этот протокол является подход, используемый для доставки терапевтических генов и наркотики ядро 17. Вирусы эволюционировали, чтобы успешно управлять принимающей ячейки машины для прогрессирует в прошлом ядерной мембраны, проходя через ядерные поры комплекс (NPC). Сотовый макромолекул содержат (или связываться с белками, которые содержат) ядерной локализации сигналов (ОУЖН), необходимые для привязки к ядерной транспорт белков (например karyopherins α и β), которые обеспечивают необходимые движения через NPC. Вирусы были разработаны протеины содержат последовательности NLS, которые предоставляют им возможность использовать принимающей ячейки транспортных белков для попеременно в ядро 18.

Многочисленные ACs ранее были функционализированных с ТАТ - и NLS-производные пептидами и испытаны для их способность накапливаться внутри раковых клеток и для ориентации опухоли 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (Таблица 1). Исследования, обеспечивая цитотоксических полезных показали, что ACs с вирусом производные пептиды способны значительно увеличить сотовой накопления, цитотоксичность и опухоли, убив над неизмененной ACs 22,26. Общей чертой для этого романа класса переменного тока является их строительства. Как правило пептиды содержат терминала цистеина, обеспечивая свободный сульфгидрильных групп. MAbs сначала отреагировали с noncleavable бифункциональных сшивателя, содержащей N- оксисукцинимидного (ГСЗ) и maleimide групп на противоположных концах. NHS эфиры реагируют с первичных аминов МАБ сформировать амидных связей. МАБ отреагировал с бесплатным maleimide группами затем реагирует с сульфгидрильных групп на пептиды, сформировать тиоэфиром Бонд и таким образом увязка пептида и МАБ. Хотя homobifunctional сшиватели используется 28, heterobifunctional сшивателя более широко используются в строительстве вирус производные пептид ACs 22,23,26, 31,32. Этот протокол использует специально сшивателя sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) циклогексан-1-карбоксилатных (сульфогруппу ККАП) за его простоту использования и потому, что он используется в утвержденных антитела наркотиков конъюгата трастузумаб emtansine и во многих вирус производные пептид ACs 8,22,23,26,,3132. Электрофорез геля полиакриламида сульфата натрия Додециловый (SDS-PAGE) является основным методом для первоначально определения эффективности спряжение и полу количественного определения количество пептидов в МАБ. Конфокальная микроскопия помощью дневно меченых вторичное антитело для mAb обычно является метод первоначально оценки свойства внутриклеточного распространения вируса производные пептид модифицированные АКГ. До настоящего времени радиоизотопов являются основной полезной нагрузки, выступил вирус производные пептид модифицированные ACs. Радиоизотопов, выгодно, потому что радиоактивности в клетках легко количественно подсчитывая гамма. Кроме того служба управления доступом, которые переводятся на мыши модели человеческого рака обеспечивают исследователей с возможностью оценить опухоли ориентации с использованием молекулярной визуализации формы, такие, как одиночных фотонов выбросов компьютерная томография и позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) 23 , 32 , 33. В целом, строительство и тестирование методов, в основном используется исследователями проверки обеспечивают очень хорошую оценку АКГ изменен с пептидами, вирус, полученных на этапе первоначальной разработки эффективно войти и доставить Полезная нагрузка, внутри клетки-мишени и целевой опухоли.

Tat-NLS-изменены и ACs есть Подсветка ключевых областей для дальнейшего улучшения доставки полезной нагрузки внутри клетки рака и опухолей. Отношении NLS-модифицированные ACs эффективность в внутриклеточного накопления может быть скромным 23,,3134. Неэффективные внутриклеточного накопления вызвана захвата продолжение от англ. В естественных условиях ориентации опухоли также может быть ослаблена с обеих ТАТ - и NLS-изменение ACs. Несколько положительных заряженных остатков содержат активные последовательности ТАТ и NLS. При подключении к mAbs, Общая катионного заряда может быть значительно увеличили 35. Как следствие ТАТ-NLS-изменены и ACs увеличили поглощения в здоровых тканях и увеличенный просвет быстрой крови.

Наша группа разработала композитные смеси состоящей из Холевая кислота связана с NLS (ChAcNLS; Рисунок 1). ChAcNLS изменение ACs способны увеличить внутриклеточного накопления поставленный радиоизотопов и улучшить опухоль ориентации, по сравнению с NLS-модифицированные и традиционных ACs 33,34. Механизм позади Холевая кислота вдохновлен способности выбора nonenveloped вирусы, которые не могут полагаться на мембраны Фьюжн использовать Холевая кислота для инициирования endosome бежать через формирование Церамид. К примеру свиного кишечного вируса новобранцев Холевая кислота, которая активирует sphingomyelinase, который катализирует гидролиз сфингомиелин в Церамид 36,,3738. Это дестабилизирует от англ мембраны и позволяет вирус побег. Таким образом Холевая кислота является другой вирус производный компонент, который дополняет NLS.

Как это поле движется вперед и будущих достижений происходят в полезных данных доставки службой ACs с вирусом производные пептиды, это подходящее время для обеспечения визуального демонстрации их биохимических и функциональных характеристик во время начальной разработки. Здесь мы описываем наш протокол для первоначальной оценки вирус производные пептид модифицированные ACs для определения эффективности еще простой внутриклеточного накопления и опухоли ориентации во время ранней стадии развития. Мы используем имеющиеся mAbs 7G 3 и A14 как пример модели системы. 1 процедура описывает использование SDS-PAGE как метод, который позволяет для «go/no go» решений для сконструированного ACs. Процедура 2 описывает метод, с помощью trypsinization, позволяя для улучшения визуализации AC внутриклеточного распределения и накопления. Процедура 3 описывает метод для повышения внутриклеточного фракционирование точно определить ядерной локализации. В этой процедуре мы используем грузоподъёмность 64Cu (t1/2 = 12,7 ч) потому что он уязвим для сотовых измеряем и позитрон излучателя 10. Таким образом процедура 4 описывает в vivo опухоли ориентации характеристика ПЭТ изображения для визуализации опухоли поглощения относительно фона (т.е. здоровых тканей nontarget) и определить, может ли пример переменного тока непосредственно и эффективно Целевой опухоли. Эти методы являются достаточно для следователей развивающихся ACs с вирусом производные пептиды для выявления кандидатов для дальнейшего продвижения.

протокол

В естественных условиях животных описал были проведены эксперименты согласно утвержденным протоколом и этические руководящие принципы Комитета по этике при университетский центр де Шербрук для экспериментов животных.

1. антитела пептида спряжение

Примечание: ChAcNLS может быть синтезирован в любой коммерческой пептид производителя или университет аффилированным пептидный синтез службы платформы. Синтез ChAcNLS можно найти в справочных 34. Для процедуры 1 и 2 Используйте МАБ 7G 3, которая является специфической для лейкемии антигена Ил 3Rα 39.

  1. В пробки microcentrifuge 1,7 мл Подготовьте 10 мг/мл раствора (~ 1 мг всего антитела) 7G 3 в фосфатный буфер (PBS), рН 7,6.
  2. Растворите сульфогруппу ККАП в диметилсульфоксида (ДМСО) в концентрации 5-10 мм. Vortexing решение тщательно лучше всего работает для достижения полного растворения.
  3. Добавьте в пробирку, содержащую 7G 3 растворенного сульфогруппу ККАП решения (обычно между 5-20 мкл в зависимости от молярное соотношение сульфогруппу ККАП к - 7G 3 желаемого). Рекомендуется тестирование соотношения сульфогруппу ККАП к - 7G 3 10 - 25-и 50-к-1. Инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч.
  4. Очищают и сконцентрировать дериватные maleimide 7G 3 с помощью ультрафильтрации устройство и буфер обмена в PBS, pH 7.0. Центрифуга на 8000 x g примерно 5 мин отклонения потока через и заполнить с PBS, pH 7.0 и центрифуги снова.
    1. Выполнить это в 7 - 8 раз полностью обменяться буфера. Восстановить в концентрированных 7G 3 белка, поместив фильтр устройства вверх ногами в чистой microcentrifuge трубки. Центрифуги для 2 мин на 1000 x g. тома для восстановления должно быть примерно 0,3 мл
  5. В пробирку, содержащую активированный maleimide 7G 3 добавить 2 раза Молярная избыток ChAcNLS относительно соотношение сульфогруппу ККАП к - 7G 3, используемых в предыдущем шаге и инкубировать на ночь при 4 ° C. Например если было использовано соотношение сульфогруппу ККАП к - 7G 3 10-в-1, затем используйте коэффициент ChAcNLS к - 7G 3 20-к-1. Общий объем должен быть существенно не изменилась.
    Примечание: Хотя ChAcNLS не вызывает осадков во время процесса конъюгации это вероятность того, что может произойти с другими пептиды. Наблюдать за трубу во время реакции на наличие признаков осадков, который скорее всего вызвана пептиды гидрофобны. В таких случаях он может быть стоит пересмотр пептид интерес с целью разработки изменения для обеспечения повышенной гидрофильность.
  6. Концентрат 7G 3-ChAcNLS с помощью ультрафильтрации устройство к желаемой концентрации и буфер обмена в PBS рН 7,4 (см. шаг 1.4). Доходность восстановления общего белка должно быть ≥ 75% первоначального исходного материала.
  7. Выполните SDS-PAGE для оценки построенных 7G 3-ChAcNLS кандидатов с помощью геля полиакриламида 12% (обеспечивает достаточное разделение ChAcNLS конъюгированных тяжелых и легких цепей от несопряженных цепи). Микс 10 мкг 7G 3-ChAcNLS в загрузки страницы буфера содержащий 2 мкл β-меркаптоэтанол и загрузить в колодец.
  8. Установите соответствующие напряжения (120 V на 1 ч для 12% гель) и запустите электрофореза. Остановите электрофореза, когда краситель фронт Кумасси достигает нижней части геля.
    Примечание: Не позволяйте Кумасси краситель передней бежать гель.
  9. Удалить из аппарат для электрофореза геля и сполосните минигелей решения, содержащие 10% v/v Ледниковая укусная кислота и 20% v/v метанола.
  10. Сделайте фотографию геля и с правителем и мера расстояния (cm) мигрировали для стандартов и 7G 3 конъюгатов. Вычислить значение удержания фактор (РФ), который представляет собой расстояние мигрировали делится на гель длиной (от где белок загружается на фронт Кумасси миграции). Участок молекулярный вес (МВт) в журнале против РФ значения из каждого стандарта белка и экстраполировать размер 7G 3 конъюгатов.
  11. Рассчитайте количество пептидов на антитела путем деления различие в МВт между 7G 3 конъюгатов и немодифицированные 7G 3, 1768.5 г/моль (МВт ChAcNLS).
  12. Цифровые изображения Кумасси окрашенных геля и выполнять анализ денситометрии. На данный момент выбор кандидата свинца может основываться на переменного тока с максимальным числом молекул ChAcNLS, не содержат значительные совокупные видов.

2. confocal микроскопии для внутриклеточного накопления оценки

Примечание: Важно протестировать клетки избирательность внутриклеточного накопления пептид модифицированные mAbs до разработки рецептуры с полезной интерес. Потому что ТАТ также было показано, имеют склонность для проникновения неспецифических клеток, стоит первый анализ внутриклеточного накопления и клеток избирательности до дорогостоящих развития предпринимает шаги с дорогим полезных. По этой причине процедура 1 следует также изменить mAbs изотипа определенного не значения элемента управления. Для остальной части протокола мы будем работать с ACs изменен с 10 ChAcNLS молекул на антитела. Схема, включая ключевые шаги процедуры 2 и 3 описана на рисунке 2.

Предупреждение: Этот шаг протокола включает обработки и манипуляции параформальдегида. Пожалуйста, следуйте инструкциям производителя при обработке.

  1. Относитесь к клеткам-мишеням TF-1a с 200 Нм 7G 3-ChAcNLS включая изменение управления mAbs. Инкубировать 5 х 106 антигена положительных клеток с конъюгатов за 1 ч при 37 ° C.
  2. Через 1 ч удалить супернатант и мыть с 1 мл раствора 3 x в ледяной PBS. Добавить свежие СМИ и проинкубируйте дополнительного часа при 37 ° C.
  3. После дополнительных часа удалить супернатант и мыть 3 x в 1 мл ледяной PBS. Добавьте 0,5 мл PBS, содержащий 0,25% трипсина и Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) при 37 ° C для 3 до 30 мин.
    Примечание: Во время первоначального пилотного тестирования рекомендуется не trypsinize клетки для того чтобы определить различия в AC внутриклеточного накопления. Настоящий Протокол поощряет использование трипсина и мы показываем, как это повышает оценку эффективности внутриклеточного накопления различных кандидатов переменного тока.
    1. Протестируйте различное время для инкубации, визуально проверка для отсоединения всех ячеек. Кроме того инкубации клеток аликвоты с жизнеспособностью, окрашивание решения и выполнять анализ потока гранулярных как описано 40.
    2. Нейтрализовать трипсина с 1,5 мл культуры клеток плода бычьим сывороточным RPMI 1640 media/10%. Центрифуга клетки на 500 x g 5 минут, удалить супернатант и мыть 3 x в 0,5 мл ледяной PBS.
  4. Исправить клетки в PBS 0,5 мл, содержащих параформальдегида 1% и 1% сахарозы на льду для стирки 30 мин клетки 3 x 0.5 мл ледяной PBS и центрифуги на 250 x g для 5 минут Permeabilize клеток в 0,5 мл PBS, содержащих 0,15% Тритон X-100 5 минут на льду. Вымыть клетки в ледяной PBS и повторите центрифугирования.
  5. Приостановить клетки в PBS 0,1 мл, содержащих 2 мкг/мл (или производителя, рекомендуется концентрации) в борьбе с мышиным (изотипа конкретных) ФК вторичного Поликлональные антитела спрягаются в AlexaFluor 647 за 1 ч при комнатной температуре в темноте.
    1. Центрифуга на 250 x g для 5 минут и смыть клетки 3 x 0.5 мл ледяной PBS. Приостановите клетки в 0,5 мл PBS.
      Пауза: Клетки могут храниться в холодильнике.
      Примечание: Важно, чтобы выбрать вторичное антитело, которое признает правильной изотипа МАБ интерес. AF647 выбирается из-за его дальнего инфракрасного выбросов, которые не мешают пропидий йодидом (PI) окрашивания ядра.
  6. Добавьте PI в концентрации 10 мкг/мл в контейнер с ячейками. Далее Подключите 1 х 105 клеток на стеклянных вставках, используя монтажные средства массовой информации и крышка с coverslip стекла.
  7. Изучите клетки с целью погружения Apo план 60 X нефти NA 1,42 на Перевернутый лазерный Сканирующий конфокальный микроскоп. Обнаружения PI флуоресценции, используя 488 нм Аргонового лазера и спектрального сканирования Призма для 600-650 Нм. Для AF647 флуоресценции используют 633 нм гелий неонового лазера и спектрального сканирования Призма для 650-700 Нм. Соберите флуоресценции выбросов от PI и AF647 последовательно.
    Примечание: Используйте те же настройки на протяжении оценки и сравнения клеток. Однако вам придется изменить настройки для trypsinized клеток, по сравнению с не trypsinized клеток.
  8. Используйте программное обеспечение микроскоп для получения изображений. Собирайте изображения с помощью серийный горизонтальных оптических разделы 1 024 x 1 024 пикселей с 2 X линии в среднем на 0,5 мкм интервалы сквозь толщу всей ячейки. Представить как сложены z прогнозы от четырех последовательных фрагментов изображения на максимум флюоресценции интенсивности.
  9. Анализ клеток с Микроскоп программного обеспечения. Запись сотовой распределение конъюгатов. Частности оценивают ли сгруппированных внутриклеточных флуоресценции в цитоплазме и возле клеток поверхности или диффузных и однородной. Также оцените интенсивность относительной флуоресценции в клетку.

3. radiolabeled AC строительство и клеточных фракционирование для оценки эффективности Cu внутриклеточных доставки 64

Предупреждение: Процедуры 3 и 4 включают обработки и манипуляции радиоактивности. Перед выполнением этих шагов, исследователи должны иметь утвердил обучение технике безопасности и протоколы, утвержденных от их дома институт радиационной безопасности.

Примечание: Для процедуры 3 и 4 мы используем МАБ A14, который специфичен для инвазивных мочевого пузыря рак антигена Ил 5Rα41. Кроме того все эксперименты являются время чувствительной за короткий период полураспада 64Cu. В общем это лучше не ждать 1 неделя для выполнения в vitro эксперименты и не более чем 72 h в vivo исследований.

  1. В 1,7 мл приостановить 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic кислоты (NOTA-NHS) в ДМСО до концентрации 10 мм.
  2. Реагировать производится Молярная избыток NOTA-NHS с A14 (2 мг исходного материала) в бикарбонат натрия 0,1 М при pH 8.6 за 1 ч при комнатной температуре в объем ≤ 0,5 мл (окончательный объем NOTA-NHS не должен превышать 2% v/v общего объема).
  3. Очищают и буфера обмена NOTA-A14 с помощью ультрафильтрации устройство в PBS, рН 7,6 (см. шаг 1.4).
  4. Для последующего крепления ChAcNLS выполните шаги 1.2-1.6.
  5. Реагировать NOTA-A14-ChAcNLS (250 мкг пакетов) с 100 мегабеккерель (МБК) 64CuCl2 в бикарбонат натрия 0,1 М, pH 5.5 для 1 ч при 37 ° C ≤ 0,1 мл. 64 Cu производится на TR-PET циклотрон CIMS 42.
  6. Концентрат 64Cu-A14-ChAcNLS в PBS рН 7,4, используя ультрафильтрации устройство к желаемой концентрации (см. шаг 1.4).
  7. Определите radiolabeling эффективность полосы 64Cu-A14-ChAcNLS путем мгновенного тонкослойной хроматографии (освоения) с использованием хроматографии и 0,1 М, рН 5,5 цитрат натрия (налогам элюента) как растворитель. Применить 0.5 мкл Алиготе реакции раствора к налогам газа. Выполните авторадиография полосы и получить цифровое изображение.
    1. Выполняют денситометрия для получения доли граница и бесплатно 64Cu. Если бесплатно 64Cu содержание > 5%, вернуться к предыдущему шагу и выполнения дополнительной очистки.
    2. Кроме того выполняйте SDS-PAGE с Кумасси, пятнать для оценки агрегатов. Выполните второй SDS-PAGE следуют авторадиография геля для определения, если есть radiolabeled совокупных видов.
  8. Сродство привязки качества КПП: инкубировать 64Cu-A14 конъюгатов на повышение концентрации (0-100 Нм) в двух экземплярах с 1 x 106 клеток-мишеней на мл. Для определения неспецифического связывания, смешать дубликатов образцов 64Cu-A14 конъюгатов с клетками в присутствии 100-кратного Молярная избыток немеченого A14.
    1. После инкубации 1 h на льду вымыть клетки и рассчитывать общее связанного антителами проб и всего неспецифических привязанных антитела в гамма счетчике. Граф конкретной привязки (всего связанного антитела - неспецифические связан антитела) против реактивной бесплатно 64Cu-A14 (Нм) используется в assay. Определите константу диссоциации (Kd), нелинейной регрессии с использованием графического программного обеспечения.
  9. Для исследования Cu сотовой накопления 64: лечить клетки с 100 Нм 64Cu меченых A14 конъюгатов за 1 ч, 6 и 24 ч при 37 ° C, как описано33. Включить дополнительные параметры, такие как лечение при наличии неизмененном A14 блока IL-5Rα сайтов и при 4 ° C для блокирования рецептор опосредованный интернализации.
  10. В назначенное время точки, как описано в шаге 2.3 - 2.3.2, добавить 0,5 мл PBS, содержащий 0,25% трипсина и ЭДТА при 37 ° C следуют нейтрализации и стирки.
  11. Инкубировать ячейки в буфер lysis плазматической мембраны, содержащей 1% NP-40, 10 мм трис рН 7,5, 10 мм NaCl, 3 мм MgCl2 буфера на льду на 10 мин центрифуга лизированы плазматической мембраны клетки на 90 x g за 5 мин.
  12. Место в свежих пробки и удалить супернатант. Это представляет собой цитоплазматических дроби. Вымойте ядра 3 x в ледяной PBS и добавить моет цитоплазматических дроби.
  13. Убедитесь, что флаконов, содержащих ядерные и цитоплазматические фракции являются запечатанными. Затем поместите их в счетчик калиброванные для 64Cu для того, чтобы преобразовать необработанные счетчики MBq гамма.
  14. Определить качество изоляции ядер, выполняя Западный анализ помаркой для Ламин A/C, ограниченных ядерных белков и Rab7 телефоны, обильные цитоплазматического белка на целом lysate, ядерные и цитоплазматические фракций.
    1. Лечить 5 х 106 клеток с 500 мкл буфера пробирного (RIPA) Радио иммунопреципитации и буфера lysis плазматической мембраны в шаг 3.12 содержащие 1%, 2% и 4% NP-40. Кроме того лечения отдельных ядер в 500 мкл Буфер RIPA для получения изолированных ядерных белков.
    2. Осадок белков изолированных ядерных, цитоплазмы и всей ячейки с помощью 4 x объем образца холодной ацетона для 60 мин при-20 ° C. Центрифуга на 13 000 x g 10 мин и сцеживаться супернатанта, стараясь не выбить Пелле белка. Добавьте 100 мкл PBS для растворения белков.
    3. Загрузка 10 мкг белка в каждой скважине геля SDS-PAGE 10%. Выполните электрофореза, как описано в 1,7-1,9. Переноса западной помарке как описано в refeference 43.
    4. Определите по лестнице, которую маркеры, которые лучше всего соответствуют МВт ~ 40 кДа. Пополам мембраны на этот маркер. Зонд помаркой, содержащие высокий белки МВт с Ламином A/C-специфические антитела. Зонд мембраны с нижней МВт белки с раб 7-специфические антитела. Западная помарка хорошо известный метод и не указанных в настоящем Протоколе.

4. PET изображений оценки ориентации опухоли

Примечание: Методы имплантации опухолевые клетки мышей для создания heterotopic ксенотрасплантатов хорошо известны и большинство лабораторий имеют собственные протоколы, специально для их системы опухоли. Таким образом это не рассматривается в протоколе. Гранулы ксенотрансплантата модель будет nonobese Диабетическая/тяжелой комбинированной иммунодефицитных (NOD/ТКИД) мышей подшипников IL-5Rα-позитивные опухоли инвазивных мочевого пузыря HT-1376 и HT-B9. Ил 5Rα-положительных инвазивных мочевого пузыря опухолевые клетки составляют > 66% от общего числа клеток в гранулы ксенотрансплантата. Напротив только ~ 11% HT-B9 Ил 5Rα-положительных клеток содержатся в развитых ксенотрасплантатов41. Таким образом эта модель обеспечивает отличный пример для оценки AC опухоли ориентации в две опухоли, которые представляют обозримом пациента тумора неоднородности.

  1. В группах, содержащие ≥ 4 (NOD/ТКИД) мышах, придать 20-30 мкг (6-9 MBq) 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS и 64Cu-A14 в Вену хвост.
  2. В тот же день место цилиндрических Фантом (24.8 мл), содержащие 5 MBq 64Cu для преобразования радиоактивных графов в секунду в вводили дозу в грамм ткани (%ID/g).
  3. Подождите 48 часов и затем анестезировать мышей, поместив их в камеру всасывание с 1,5 Л/мин потока кислорода с 2% изофлюрановая. Стерильные глазные мази можно обратиться мыши глаза после индукции и перед размещением в PET сканер.
  4. Быстро перенесите мыши таблицу PET сканер в лежачем положении вниз головой с носовой конус для изофлюрановая. Дыхание и Ректальные зонды и частоту монитора дыхания и температуры для поддержания физиологических условиях во время эксперимента, ранее описанные 44.
  5. Начните PET сбора данных, используя параметр режим регулярных выборочных и энергии окно 250-650 кэВ. Как правило достаточно для обеспечения достаточной совпадающих событий для производства ПЭТ изображений высокого качества и реконструкции 45-минутный статические проверки на мышь.
  6. После сканирования 64Cu-AC удалите мышь от сканера и поместить его обратно в клетке. Разрешить для мыши достаточно восстановить до возвращения в объекте животных.
  7. Получения восстановленных изображений с помощью 20 итераций алгоритм трехмерной максимальная вероятность максимизации ожидания.
  8. Выполняют региона интерес (ROI) анализа опухоли и визуально оценимый органов с использованием программного обеспечения Амида.
    1. Нарисуйте трансформирования для получения количественных %ID/g данных вручную с помощью параметра 3D карандаша и тщательно разграничить опухоли или прилегающих бедра мышцы. Отсчеты пиксел в ROI будут преобразованы в %ID/g от предыдущего шага 4.2.
  9. Сравнение 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS изображений для опухоли контраст и количественные ROI % ID/g и опухоли на фоне соотношения.

Результаты

1 процедура строительство 7G 3 изменена с ChAcNLS с помощью сульфогруппу ККАП как сшивателя является очень надежным. Как правило при загрузке на 12% гель и проанализированы SDS-PAGE, это приводит к различимых поэтапное увеличение МВт пропорционального увеличения соотношения су...

Обсуждение

Основными задачами системного доставки анти-рак агентов являются увеличить накопления на опухоли и поглощение в раковые клетки и уменьшить нежелательные побочные эффекты в здоровых тканях. AC целевой доставки молекулярных полезных для опухолевых клеток является весьма перспективным...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать

Благодарности

Эта работа финансировалась обществом исследований рака (Канада) и кису. Авторы благодарят д -р Самиа МТА-Моханд и Жан-Франсуа Beaudoin за помощь. Д-р Анхель Лопес (Университет Южной Австралии) для mAb A14.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Sulfo-SMCCThermo Scientific22122There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal FiltersEMD MilliporeUFC505096There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope StandardsBioRad1610375EDUMulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugateThermo ScientificA-212351 - 10 μg/mL recommended
NOTA-NHSCheMatechC100
Lamin A/C antibody (N-18)Santa Cruz Biotechnologysc-6215
Rab7 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-376362
A14 mAbBD Biosciences555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Thermo ScientificNP0007
2-MercaptoethanolSigma AldrichM3148-25ML
TF-1a cellsATCCATCC CRL-2003
RPMI 1640 mediumATCCATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction bufferThermo Scientific89900
AMIDE medical imaging softwareavailable at amide.sourceforge.netCompletely free download
FluoView FV1000 Confocal MicroscopeOlympus
Fluoview SoftwareOlympuswww.olympus-lifescience.com
ITLC stripsBiodex150-771

Ссылки

  1. Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
  2. Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
  3. Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
  4. Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
  5. Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
  6. Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
  7. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  8. Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
  9. Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
  10. Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
  11. Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
  12. Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
  13. Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins--entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
  14. Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
  15. Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen, ., H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
  16. Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
  17. Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
  18. Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
  19. Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
  20. Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
  21. Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
  22. Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
  23. Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
  24. Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
  25. Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
  26. Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
  27. Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
  28. Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
  29. Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
  30. Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
  31. Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
  32. Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
  33. Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
  34. Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
  35. Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
  36. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
  37. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
  38. Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
  39. Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4 (2014).
  40. King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
  41. Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195 (2017).
  42. Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
  43. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  44. Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761 (2013).
  45. Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
  46. Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
  47. Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
  48. Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
  49. Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
  50. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

133SDS PAGE64PET

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены