L'esposizione del Maiale CNS per l'analisi istologica: Un manuale per la decapitazione, Teschio di apertura, e Cervello di rimozione

Riepilogo

L'obiettivo di questo documento e video didattico è quello di descrivere come esporre e rimuovere il post-mortem del cervello di maiale e ghiandola pituitaria in uno stato integro, adatto per la successiva analisi macroscopica e istologica.

Abstract

Suini sono diventate sempre più popolari in larga animale ricerca traslazionale neuroscienze come sostituto economicamente ed eticamente fattibile primati non umani. La dimensione del cervello di grandi dimensioni del maiale permette l'utilizzo di convenzionali imager cervello clinica e l'uso diretto e la sperimentazione di procedure e attrezzature neurochirurgiche dalla clinica umana. Ulteriori analisi macroscopica e istologica, tuttavia, richiede l'esposizione post mortem del maiale sistema nervoso centrale (SNC) e successiva rimozione del cervello. Questo non è un compito facile, come il maiale CNS è incapsulato da una fitta, il cranio ossuto e della colonna vertebrale. L'obiettivo di questo documento e video didattico è quello di descrivere come esporre e rimuovere il cervello post-mortem di suini e la ghiandola pituitaria in uno stato integro, adatto per la successiva analisi macroscopica e istologica.

Introduzione

studi neuroscienze traslazionale nei suini sono diventati sempre più popolari nel corso degli ultimi due decenni. Le grandi dimensioni del cervello di maiale consente l'utilizzo di convenzionali imager cerebrali clinica e l'uso diretto e sperimentazione di procedure neurochirurgiche ed attrezzature dalla clinica umana ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.} Negli ultimi 20 anni, maiali, specialmente maialino (ad esempio, Göttingen cavia), sono stati utilizzati per esaminare modalità di trattamento neuromodulatori, come il trapianto di cellule staminali; Vettore virale trasfezione; e la stimolazione cerebrale profonda diretta verso il morbo di Parkinson, l'obesità, la depressione, e la malattia di Alzheimer ^{2, 6,}= "xref"> ^{9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} Questo è stato seguito dallo sviluppo di approcci stereotassica e chirurgici per manipolare cavia CNS ^{3, 18, 19, 20, 21.} I cambiamenti del SNC istituiti sono state valutate in animali vivi mediante imaging cerebrale (PET ^{10, 13, 22, 24} e MR ^23), cistometria ^{11, 12, 25,} analisi del passo^17, la valutazione neurologica ^{9, 17,} e l'esame autoptico basato su istologia e analisi stereologica ^{14, 15, 17, 26, 27, 31.} Tuttavia, l'analisi post-mortem richiede l'esposizione e la rimozione del cervello di maiale, che non è un compito facile, come una spessa cranio osseo e durale fibroso che copre circondano il cervello di maiale.

L'obiettivo di questo documento e video didattico è quello di descrivere come il cervello post-mortem di suini e dell'ipofisi possono essere esposti e rimossi in uno stato integro in 15-20 minuti utilizzando strumenti chirurgici non motorizzati. Il video didattico e illustrazioni fotografiche mostrano cavie di sesso maschile (età: 6 mesi, a corpo libero: 20-25 kg) utilizzato per uno studio anatomico sulla ghiandola pituitaria cavia.

Protocollo

anestesia degli animali e euthanesia è stata eseguita in conformità con i "Principi di laboratorio cura degli animali" (NIH pubblicazione n ° 86-23, rivisto 1985) e approvato dal Consiglio danese per la ricerca etica animale.

1. Strumenti

1. Raccogliere gli strumenti presentati nel video ed elencati nella tabella dei materiali.

2. Decapitazione

NOTA: L'anestesia è stata indotta mediante iniezione intramuscolare di 5 mL di midazolam (5 mg / ml) e 5 ml di ketamina (25 mg / mL). 5-10 minuti più tardi, quando l'animale era profondamente sedato, una vena dell'orecchio è stata incannulata e overdose letale (100 mg / kg di peso corporeo) di pentobarbital sodio (200 mg / ml) è stato somministrato per via endovenosa. Per garantire che l'animale è stato completamente eutanasia, il dolore riflesso interdigitale è stato testato come mostrato da Ettrup et al. (2011) ^20. euthanization completo è stato assicurato come descritto inl'istruzione etica sopra e seguita da una perfusione transcardial con 5 L di soluzione salina isotonica, come dimostrato da Ettrup et al. (2011) ^20. Tutte le procedure vengono eseguite dimostrate postmortem, precludendo la necessità per le precauzioni necessarie per l'anestesia benessere a lungo termine e la sopravvivenza postprocedurale.

1. Decapitare il maiale da un alto un'incisione circolare cervicale, utilizzando un bisturi chirurgico, appena sotto l'angolo mandibolare (Figura 1A).
2. Ancora con il bisturi chirurgico, continuare l'incisione anteriormente attraverso il tessuto molle del collo, compresa la laringe e dell'esofago, finché la colonna vertebrale ossea viene raggiunto, approssimativamente al livello della giunzione cranio cervicale.
3. Avanzare il taglio con un bisturi chirurgico dal lato anteriore della giunzione craniocervicale, sopra l'arco anteriore dell'atlante, e attraverso la membrana atlanto anteriore, esponendo così il canale vertebrale e il midollo spinale (Figura 1B). Allo stesso tempo chiedere un assistente di tirare il corpo del maiale lontano dalla testa di maiale per facilitare l'accesso tra la base del cranio e la prima vertebra cervicale.
4. Continuare l'incisione chirurgica attraverso il sacco durale e il midollo spinale (Figura 1B). Prestare particolare attenzione per garantire che una sezione trasversale completa del midollo spinale è raggiunto.
   NOTA: La mancata esecuzione del passaggio precedente può portare a trazione indesiderati sul midollo spinale e del cervello durante le seguenti fasi del processo di decapitazione.
5. Forza estendere la giunzione cranocervical a livello di sezione (Figura 1C). Al tempo stesso, utilizzare il bisturi chirurgico alla sezione restanti legamenti atlanto per rilasciare l'articolazione tra i condili occipitali e il processo articoli superiore dell'atlante. Separare la testa di maiale dal corpo.

Figura 1: minipig decapitazione. (A) del collo incisione (freccia, angolo mandibolare). (B) incisione attraverso i legamenti atlanto e il midollo spinale dura circondato (SC) alla giunzione craniocervicale (C1, arco anteriore dell'atlante, OC, condilo occipitale). (C) La parte posteriore dell'articolazione atlanto viene rilasciato da un'estensione forte (frecce) a livello di sezione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Teschio di apertura

1. Posizionare la testa di maiale su un tavolo.
2. Effettuare un'incisione longitudinale dorsale con un bisturi chirurgico attraverso la pelle e il tessuto molle sottostante dal retro del muso, sul vertice della testa, e giù attraverso la parte posterioreregione occipitale.
3. Esporre la parte dorsale e posteriore del cranio rimuovendo il tessuto molle situata lateralmente alla incisione iniziale con un bisturi chirurgico.
4. Rilasciare il muscolo temporale bilateralmente dal cranio (Figura 2A) con un bisturi chirurgico. Assicurarsi che l'osso occipitale posteriore è pulita dei tessuti molli.
5. Utilizzare l'entrata posteriore del foro occipitale per rimuovere l'osso occipitale con Kerrison osso punzone e Bone Rongeurs ed esporre il cervelletto dura coperto (Figura 2B).
6. Ritorno al lato anteriore esposta del cranio e selezionare un punto di ingresso nel dell'osso frontale, proprio di fronte agli occhi. A questo punto, utilizzare uno scalpello osso con un martello per penetrare il cranio e immettere il seno frontale (Figura 2C).
7. Utilizzare l'entità del seno frontale per favorire la rimozione della lamina dorsoposterior cranio esterno con una rongeur ossea o punzone ed esporre l'interno, sottilecranio lamina ossea che copre il cervello (Figura 2D).
8. Aprire delicatamente la lamina interna cranio osseo anteriormente con un martello e scalpello osso per esporre cervello dura coperto (Figura 2E).
9. Continuare la rimozione di osso lateralmente usando uno scalpello osseo e una rongeur osso attraverso l'osso temporale e parietale al fine di rilasciare la parte dorsoposterior finale del cranio, situato tra le parti già esposte del cervello e nel cervelletto dura coperto (Figura 2F).
   NOTA: E 'spesso possibile, durante la fase finale di questa procedura, per usare lo scalpello per rompere il restante posteriore ossa del cranio da una parte all'altra, proprio come uno apre una porta.

Figura 2: apertura cranio cavia. (A) esposizione della dorsoposteriosuperficie del cranio R, tra cui la rimozione del occipitale e muscoli temporali. (B) La rimozione dell'osso occipitale (CB, dura coperta di cervelletto, OB, osso occipitale, OC, condilo occipitale, e SC, midollo spinale). (C) un martello e uno scalpello osso sono usati per penetrare il cranio anteriormente e per entrare nel seno frontale a livello degli occhi. (D) La portata del seno frontale (FS) viene utilizzato per rimuovere il cranio esterna dell'osso spessore (1), esponendo una sottile lamina ossea interna (2) che copre il cervello. (E) La rimozione del sottile lamina ossea, esponendo il cervello dura coperto (freccia). (F) Infine, un martello e uno scalpello osso vengono utilizzati per il collegamento laterale anteriore e le aperture posteriori cranio. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

4. Cervello Removal

1. Utilizzare pinze chirurgiche per sollevare la dura e creare un dolce un'incisione vicino alla venoso seno longitudinale superiore utilizzando un bisturi chirurgico fine (Figura 3A).
2. Utilizzare micro-forbice o un coltello dura per aprire ulteriormente la dura madre che copre la superficie dorsale del cervello.
   NOTA: Particolare cura deve essere presa quando si rimuove la dura corrispondente al tentorio cerebellare (figura 3B), come conservazione di questo foglio durale impedirà successiva rimozione cervello.
3. Posizionare la testa di maiale verticalmente (Figura 3C).
4. Utilizzare lo scalpello osso o un dissettore per rilasciare cervello ventroanterior per via smussa del bulbo olfattivo dal pavimento dura coperto della cavità cranica (Figura 3D).
5. Utilizzare un bisturi chirurgico fino al punto chiasma ottico esposta (Figura 3E). Esporre e la sezione del peduncolo ipofisario ei nervi oculomotori.
6. Rilasciare il tronco cerebrale ventrale sezionando LOwer nervi cranici (Figura 3F) con una multa bisturi chirurgico. Garantire che tentorio cerebellare durale stato completamente inciso (figura 3B), in quanto questa foglia durale sarà altrimenti tagliare il tronco cerebrale durante il processo di rilascio.

Figura 3: rimozione cervello cavia. Apertura (A) durale con pinze chirurgiche e un coltello dura. (B) Bisogna fare attenzione a incidere completamente la foglia durale (freccia), che si trova tra il cervello e il cervelletto. (C) La testa di maiale è in posizione verticale per una migliore visualizzazione delle strutture di base del cranio e al fine di gravità per aiutare lo spostamento previsto del cervello. (D) Un dissettore o uno scalpello osso viene usato per alleviare il bulbo olfattivo dalla sezione smussata dalla dura madre-coverebase del cranio d. (E) La dissezione viene continuata in direzione posteriore lungo la base del cranio per l'esposizione e sezionamento del chiasma ottico (freccia), gambo infundibolare e nervi oculomotori. (F) Il rilascio cervello è completato con la sezione dei nervi cranici inferiori come si allontanano dalla superficie ventrale del tronco cerebrale (III, oculomotore, IV, nervo trocleare, V, nervo trigemino e VI, abducente nervi). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

5. Rimozione pituitaria

1. Identificare il peduncolo ipofisario ei suoi dintorni foglia durale (la sellae diapragma) nel pavimento cranio (Figura 4A).
2. Incidere la foglia laterali durale al peduncolo ipofisario utilizzando una multa bisturi chirurgico (Figura 4B).
3. Utilizzare un dissettore per rilasciare la fossauitary ed estrarlo dell'ipofisi fossa (Figura 4C).

Figura 4: rimozione pituitaria cavia. (A) La fossa pituitaria (*) è identificato nel piano cranio (1, bulbo olfattivo, 2, chiasma ottico e PF, fossa cranica posteriore). (B) La copertura durale (diagphragm Sellar, (freccia)) viene incisa lateralmente. (C) L'ipofisi (freccia) viene rilasciato con un dissettore e tirato fuori dalla fossa pituitaria. barra di scala (AC) = 10 mm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Risultati

Per evitare che il materiale del tessuto si secchi, si consiglia di conservare il cervello rimosso e pituitaria in un vaso riempito di fissativo o soluzione salina isotonica immediatamente dopo l'analisi macroscopica è stata eseguita. Il materiale tessuto può essere immagazzinato nel fissativo per anni, mentre stoccaggio in soluzione salina isotonica, anche in frigorifero, porterà a decadimento dei tessuti con il tempo.

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Discussione

La maggior parte degli studi di neuroscienze sperimentali vengono eseguiti in piccole specie animali, come topi e ratti, in cui l'accesso al sistema nervoso centrale è facilitato da un sottile skull- e durale spessore. Tuttavia, in animali da esperimento più grandi come maiali ^{1, 4, 8,} pecore ^32, e primati non umani, l'elevato spessore di queste strutture richiede l'uso di strumenti robusti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heavy Scalpel Handle #4	FST (Fine Science Tools)	10008-13	Good for skin incision and soft tissue removal
Non-Sterile Scalpel Blades #23	FST	10023-00
Scalpel Handle #7	FST	10007-12	Optimal for dural incision and precision work
Non-Sterile Scalpel Blades #11	FST	10011-00
Surgical Forceps	FST	11024-18	The tip of the surgical forceps ensure a firm grip
Kerrison Bone Punch	Aesculap Neurosurgery	FF713R	Must be robust, bite size 3-5 mm
Bone Rongeur	Aesculap Neurosurgery	MD615	Must be robust, bite size 15 x 5 mm
Bone Rongeur	Aesculap Neurosurgery	FO551R	Must be robust, bite size 25 x 15 mm
Bone Chisel	Lawton	67-0335	The size of the chisel head should not exceed 20 mm
Mallet (Hammer)	Millarco	5624108	Weigth 300 g, length 30 cm, head hit area size 2 x 2 cm
Micro-Scissor	FST	14002-14
Dissector	Aesculap Neurosurgery	OL165R
Göttingen minipigs	Ellegaard Göttingen Minipigs A/S, Denmark
Euthanimal			pentobarbital
Ketamine	Pfizer
Midazolam	Hameln Pharmaceuticals