La tecnica del frazionatore ottico per stimare i numeri di cella in un modello di ratto della terapia elettroconvulsiva

Riepilogo

Qui presentiamo un metodo stereologico, il frazionatore ottico, usato per quantificare la formazione di nuovi neuroni e la loro sopravvivenza nell'ippocampo del ratto dopo la stimolazione elettro-convulsiva. Quando viene correttamente implementata, la sensibilità e l'efficienza dei metodi stereologici garantiscono accurati stimi con una precisione fissa e predeterminata.

Abstract

I metodi stereometrici sono progettati per descrivere i parametri quantitativi senza fare ipotesi circa la dimensione, la forma, l'orientamento e la distribuzione di cellule o strutture. Questi metodi sono stati rivoluzionari per l'analisi quantitativa del cervello mammifero, in cui le popolazioni di cellule volumetriche sono troppo elevate da contare manualmente e la stereologia è ora la tecnica di scelta ogni volta che le stime di quantità tridimensionali devono essere estratte dalle misurazioni su due dimensioni sezioni. Tutti i metodi stereologici sono in linea di principio imparziali; Tuttavia, si basano su una corretta conoscenza della struttura dell'interesse e delle caratteristiche del tessuto. La stereologia si basa su un campionamento casuale randomizzato sistematico (SURS), con regolazione del campionamento al livello più efficiente rispetto alla precisione, fornendo informazioni affidabili e quantitative sull'intera struttura di interesse. Qui presentiamo il frazionatore ottico in combinazione con l'immunohistochemistry di BrdUO stimare la produzione e la sopravvivenza dei neuroni di nuova costituzione nello strato di cellule di granuli (compresa la zona sub-granulare) dell'ippocampo del ratto dopo stimolazione elettroconvulsiva, che è tra i più potenti stimolatori della neurogenesi. La tecnica di frazionamento ottico è progettata per fornire stime del numero totale di cellule da sezioni spesse campionate dalla struttura completa. Le sezioni spesse offrono l'opportunità di osservare le cellule nella loro dimensione completa di 3-D e, pertanto, consentono una classificazione cellulare semplice e robusta basata su criteri morfologici. Se correttamente implementato, la sensibilità e l'efficienza del frazionatore ottico forniscono stime accurate con una precisione fissa e predeterminata.

Introduzione

La quantificazione delle cellule in una struttura tridimensionale (3-D) può richiedere l'ottenimento di stime basate su principi imparziali. Ancora oggi, gli studi spesso utilizzano metodi bidimensionali (2-D) per riportare i dati delle strutture di 3-D. Tuttavia, questi metodi non considerano la natura eterogenea della struttura in termini di forma e distribuzione delle cellule con conseguente limitazioni metodiche; Fanno delle ipotesi sulla struttura 3D di interesse e i risultati non si riferiscono alla struttura completa. Queste limitazioni riducono la sensibilità e l'accuratezza dei metodi e aumentano il rischio di errori ¹ .

La bias nel conteggio delle cellule può essere evitata dall'applicazione di stereologia del design, che è di grande importanza per ottenere informazioni quantitative sul numero di cellule in un determinato tessuto o struttura. Mentre la stereologia è stata un metodo che richiede molto tempo, avanza nelle procedure, morbidoArticoli e immagini, ha reso molto più efficiente e ampiamente applicabile. La stereologia comporta principi di campionamento statistico e teoria geometrica stocastica per fornire strumenti efficaci per la stima del volume, della superficie, della lunghezza e del numero di oggetti in una struttura a 3-D campionando nelle sezioni ² -D ² . Pertanto, la stereologia permette di ottenere dati quantitativi impareggiabili sui cambiamenti strutturali nelle sezioni del tessuto, che forniscono stime medie dei numeri veri, senza analisi esaustive ¹ . La stereologia è definita come l'inferenza statistica dei parametri geometrici dalle informazioni campionate. Ciò può essere ottenuto mediante un campionamento imparziale, vale a dire campionamento casuale sistematico, di sezioni e regole di conteggio che assicurano che tutti gli oggetti abbiano uguali probabilità di essere conteggiati ³ . Mentre i risultati stereologici possono avere diversi gradi di precisione come indicato dal coefficiente di errore (CE), questo può essere adGiusto per adattarsi alla varianza biologica intrinseca (coefficiente di varianza (CV)) regolando la quantità di campionamento come richiesto ^{4 , 5} . Alcuni precedenti studi stereologici hanno esaminato gli effetti a breve termine della stimolazione elettroconvulsiva (ECS) sulla plasticità ippocampale nei roditori ^6,7 . I dati di questi studi mostrano un aumento iniziale del numero totale di neuroni, nonché una differenziazione sinaptica elevata dopo ECS ripetuti. Tuttavia, questi studi non stimano direttamente la neurogenesi, in quanto non utilizzano marcatori specifici per la proliferazione cellulare.

Qui viene presentata un'applicazione di un metodo stereologico, la tecnica di frazionamento ottico ^{8 , 9} , per quantificare il numero totale di neuroni appena costituiti nello strato di cellule di granuli ippocampali (GCL), inclusa la zona sub-granulare (SGZ) Come loro a lungo termineUrvival ^{10 , 11} . Abbiamo sottoposto i ratti ad un programma clinico rilevante di ECS (tre volte alla settimana per 3 settimane), uno dei stimoli più potenti della neurogenesi ¹² . Gli animali di controllo sono stati trattati utilizzando la stessa procedura, ma senza passaggio di corrente. In ciascuno dei 21 giorni di sperimentazione, tutti i ratti sono stati iniettati intraperitonealmente con 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) che incorpora in DNA al posto della timidina durante la divisione cellulare ¹³ . Dopo la sperimentazione, i ratti sono stati mantenuti per quattro diversi periodi di tempo (24 ore, 3 mesi, 6 mesi e 12 mesi). Utilizzando il principio del frazionatore, abbiamo ottenuto una frazione nota dell'ippocampo attraverso un campionamento casuale uniforme di sezioni e applicato i disaggi ottici (sonde 3-D) alle sezioni di tessuto spesse e campionate e immunocoste. Si nota in particolare che le sezioni congelate tendono a collassarsi nell'asse z durante il processoE che i disaggi ottici basati sullo spessore della sezione media ponderata devono essere utilizzati in questo caso particolare ¹⁴ . Poiché il piano focale dei disettatori ottici è stato spostato una distanza nota attraverso la sezione, i neuroni di BrdU-positivi sono stati contati quando la loro caratteristica di interesse è stata chiaramente riconosciuta. Nel campo della stereologia c'è un dibattito sul numero totale di particelle che devono essere contate ¹⁵ ; Tipicamente 150-200 neuroni sono contati nella struttura di interesse per ottenere una precisione adeguata cioè un coefficiente del 7-8% ⁸ . I conteggi neuronali BrdU-positivi sono stati completati utilizzando software stereologico con imaging da un microscopio standard dotato di fotocamera e con i seguenti obiettivi: 2X, 4X e 10X nonché un obiettivo di immersione olio 100X (apertura numerica = 1,40) e una fase motorizzata . I movimenti nella direzione z sono stati misurati con un microcatore digitale. L'ingrandimento finaleEra 3000X.

Protocollo

Tutte le procedure animali sono state eseguite secondo le linee guida dell'ispezione danese per la sperimentazione animale e approvate dal comitato etico locale per gli animali sperimentali.

1. Trattamento dei tessuti

NOTA: Dopo quattro giorni di perfusione transcalografica e post-fissazione in 4% di paraformaldeide (PFA) diluito in 0,2 M di tampone di fosfato a 4 ° C, i cervelli vengono trasferiti al 30% di saccarosio in soluzione salina fosfata (PBS) per tre giorni a 4 ° C. Successivamente, i cervelli vengono congelati su ghiaccio secco in polvere e conservati a -80 ° C fino alla sezionatura.

1. Separare gli emisferi destro e sinistro lungo la linea mediana del cervello usando un bisturi e poi scegliere uno o l'altro emisfero casualmente nel primo cervello, poi spostarsi sistematicamente tra l'emisfero destro e sinistro ( Figura 1A ). Montare l'emisfero campionato su un disco di prova con l'asse lungo perpendicolare al discoUtilizzando un supporto di montaggio.
2. Inserire i contenitori numerati numerati per il pre-raffreddamento nel criostato.
3. Montare il disco del campione nel criostato e tagliare l'intero complesso dell'ippocampo (Bregma 1.80 a - 7.04 ¹⁶ ) in profili 80 μm nel piano coronale ( figura 1B ).
   1. Posizionare tutte le sezioni campionate consecutivamente nei contenitori multidiscificati, per assicurare che le sezioni siano tenute in ordine di taglio.
   2. Coprire completamente le sezioni con crioprotectant e tenere i contenitori a -20 ° C fino ad un ulteriore utilizzo.

2. Immunostaining

NOTA: per tenere traccia delle singole sezioni durante la procedura di colorazione, posizionare le sezioni campionate in reti di 25 verniciatura. Utilizzare ogni 5 ^° sezione, fornendo un numero medio finale di 12 (8-16) sezioni per ippocampo per l'immunostaining e il successivo conteggio delle cellule.

1. Prima di sottoporre il campionamento a ogni sezione n con un inizio casuale tra la sezione uno e la sezione n ( figura 1C ) trasferire i contenitori da -20 ° C a quella ambiente.
2. Utilizzare per esempio un pennello per trasferire le sezioni in ordine numerico alle reti di 25 vasi di colorazione poste in piatti petri riempiti con PBS.
   NOTA: da questo punto, conservare le sezioni nelle reti di colorazione poste in corrispondenza di piatti di vetro posizionati su un agitatore orbitale (sezione 2.3-2.9).
3. Trasferire le reti di colorazione ai piatti di vetro corrispondenti e lavare le sezioni due volte per 10 minuti in PBS a RT prima dell'incubazione in 3% di perossido di idrogeno (H ₂ O ₂ ) diluito in acqua distillata (dH ₂ O) per 20 minuti.
4. Trasferire le sezioni in tre diverse soluzioni di acido cloridrico (HCl) (1 M a 0 ° C per 10 min, 2 M a RT per 10 min e 2 M a 37 ° C per 20 minuti) prima della neutralizzazione in 0,1 M di tetraborato di sodio unT RT per 20 min.
5. Dopo 3 x 10 min di incubazione in 1% di Triton X-100 diluito in PBS (tampone di lavaggio), trasferire le sezioni in tampone di lavaggio contenente 10% di siero di fegato fetale (soluzione bloccante) per 1 ora a RT.
6. Incubare le sezioni per 48 h a 4 ° C in mouse-anti-BrdU diluito 1: 100 nella soluzione di blocco.
7. Lavare le sezioni di 3 × 10 min in tampone di lavaggio e incubare per 48 h in peroxidasi di rafano di razza diluito 1:10 in tampone di lavaggio.
8. Trasferire le sezioni in PBS per 5 × 10 min e poi per 7 min in 0,01% diaminobenzidina (DAB) diluito in PBS prima di essere trasferiti in una soluzione DAB simile contenente 0,02% H ₂ O ₂ per 10 minuti a RT.
9. Completare una serie di lavaggi (2 × 10 min in PBS e 2 × 10 min in tampone di fosfato senza aggiunta di cloruro di sodio) e montare le sezioni in ordine numerico sulle vetrini del microscopio.
10. Asciugare le sezioni per circa 30 minuti prima di contare con cresilviola.
11. Posizionare le diapositive del microscopio in un rack slide.
12. Ridaldare le sezioni per 10 minuti in piastre di verniciatura a diapositiva contenenti dH ₂ O e quindi trasferire le diapositive in violetta cresilica del 0,02% in dH ₂ O per 15 minuti.
13. Ripetere il passaggio 2.12 prima che le sezioni venissero disidratate per tre volte in etanolo (96% per 5 min e 99% per 2 × 2 min).
14. Posizionare le sezioni in xilene per 2 × 15 min e coprire le slitte utilizzando un mezzo di asciugatura rapido per il montaggio.
15. Infine lasciare le diapositive scivolate per circa 24 ore prima che possano essere utilizzate per la microscopia.

3. Stima del numero totale di neuroni etichettati con BrdU utilizzando il frazionatore ottico

NOTA: condurre uno studio pilota che include alcuni animali per determinare i parametri di campionamento ottimali, come il numero di sezioni da analizzare e il numero di disettatori ottici all'interno delle sezioni campionate. Questo pilota fornisce anche aIl CV preliminare (deviazione standard / media) e la possibilità di regolare la CE (vedere sezione 3.9.3) per ottenere una precisione soddisfacente delle stime determinate dall'investigatore (per maggiori dettagli vedi sotto). Allo stesso modo eseguire un'analisi di distribuzione z per affrontare i punti seguenti: riduzione del tessuto, qualità della colorazione in tutta la sezione e distribuzione delle celle nell'asse z ¹⁴ .

1. Controllare lo spessore del tessuto nelle sezioni per confermare che sono adatte all'uso del frazionatore ottico, ad esempio è abbastanza spessa per l'altezza disciente selezionata, comprese zone di protezione (vedi sotto). NOTA: Lo spessore del tessuto è misure in diversi punti della regione di interesse.
   1. Posizionare le diapositive sulla fase motorizzata del microscopio e accendere il software stereologico preferito.
   2. Delineare l'area di interesse utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento (2X o 4X) prima di passare ad un olio immesso 100XErsione (vedi figura 2A ).
   3. Utilizzando un punto specifico di un telaio di conteggio ( ad esempio ad un angolo o adiacente ad un angolo), individuare la parte superiore della sezione spostandosi lungo il piano focale fino a quando non viene visualizzata alcuna caratteristica della sezione. Registrare questa posizione z come 0 (vedere la Figura 2B ).
   4. Spostare il piano focale attraverso il tessuto fino a quando lo stesso punto specifico del telaio di conteggio è all'ultimo z-livello del tessuto in messa a fuoco e segnare questa posizione. Lo spessore del tessuto locale è definito da 0 a questo punto finale e può essere letto sull'asse z. Registrare lo spessore del tessuto (vedere la Figura 2B ).
2. Documenta la penetrazione completa della macchia e la distribuzione delle cellule nello spessore completo della sezione.
   NOTA: La distribuzione dei neuroni etichettati con BrdU viene utilizzata come guida per determinare le zone di guardia richieste. Anche se una distribuzione uniforme di cellule è critica, lo èÈ accettabile per osservare meno celle vicino alla parte superiore e inferiore della sezione, indicando l'effetto dei tappi persi (per ulteriori dettagli vedere Dorph-Petersen et al., 2009).
   1. Campionare i neuroni etichettati con BrdU e registrare la loro posizione z insieme allo spessore della sezione locale misurata nell'angolo selezionato di ogni telaio di conteggio.
   2. Trama il numero di neuroni di BrdU positivi in ​​funzione della loro posizione z.
3. Fissare l'altezza delle zone di disezione e di protezione in base allo spessore della sezione media e alla distribuzione delle celle (vedere 3.1 e 3.2).
   NOTA: L'altezza del disettatore deve essere inferiore allo spessore della sezione per evitare gli artefatti vicini alle superfici. Questo rischio viene aggirato includendo zone di guardia nella parte superiore e inferiore della sezione.
4. Determinare la lunghezza di passaggio tra i disettatori.
   1. Indicare la regione di interesse su tutte le sezioni da analizzare e registrare le aree.
   2. Somma queste aree e poi divide bY il numero di disettatori da collocare all'interno di questa zona.
      NOTA: sulla base dell'esperienza precedente un buon punto di partenza comporta 75 sonde. Ciò fornirà una approssimazione dell'area e delle posizioni di campionamento corrispondenti ( _passo A) (per ulteriori dettagli vedere West, 2012).
   3. Prendi la radice quadrata di un _passo , che fornirà la dimensione xy-step.
5. Determinare la dimensione del telaio di conteggio.
   1. Impostare la dimensione del telaio di conteggio su un'unità arbitraria e eseguire un campionamento pilota dei neuroni di BrdU positivi utilizzando i parametri ottenuti nei paragrafi 3.3 e 3.4.
      NOTA: la dimensione deve essere determinata empiricamente da prove ed errori, ma si consiglia di regolare per consentire il campionamento di 2-3 cellule per disector ⁸ .
6. A seguito di questa fase finale dello studio pilota iniziare il campionamento delle cellule.
   NOTA: i parametri di campionamento ottenuti dovrebbero comportare conteggi di circa 150-200 cellule iN ogni animale sufficiente a ottenere un disegno stereologico efficace ⁸ .
7. Conti i neuroni di BrdU-positive usando un obiettivo di immersione olio da 100 × e un ingrandimento finale di 2000-3000 ×. Identificare in ciascun disettatore ottico tutti i neuroni etichettati con BrdU che sono chiaramente riconosciuti dalla caratteristica di interesse (nel presente studio, il criterio è quando il primo bordo del neurone denominato BrdU viene messo a fuoco per la prima volta) All'interno del telaio di conteggio o toccare le linee di inclusione ( Figura 2B ). Non contate i neuroni di BrdU-positive che, quando riconosciuti dalla caratteristica di interesse all'interno dell'altezza disciente, toccano le linee di esclusione. È fondamentale osservare scrupolosamente queste regole di conteggio per tutta la quantificazione stereologica.
   NOTA: Come BrdU incorpora in tutte le cellule divisorie, la morfologia viene utilizzata per distinguere i neuroni e altri tipi di cellule. NeuLe caratteristiche di ron sono un nucleo chiaramente definito con un citoplasma neutro e un nucleolo scuro. Le cellule positive di BrdU sono riconosciute come neuroni di nuova costituzione in base alla loro dimensione relativamente più grande rispetto alle cellule gliali. Va ricordato che negli studi di proliferazione a breve termine (ad es. <24 h) la doppia colorazione con marcatori neuroni immaturi può essere un prerequisito ¹⁷ .
8. Stima il numero totale di neuroni di BrdU positivi in ​​ciascun cervello moltiplicando il numero totale di cellule contate (Σ Q ^- ) con le frazioni di campionamento reciproche:
   
   per
   dove _Q- è lo spessore della sezione media ponderata, h è l'altezza del disettatore, asf è la frazione di campionamento dell'area, ssf è la sezione sFrazione ampling e t _i è lo spessore della sezione nel conteggio di i ^th con un numero di cellule di Nel disector ^{14 , 18} .
9. Calcolare il coefficiente di errore (CE) ⁸ che è la varianza di campionamento dei neuroni di BrdU-positive in un campionamento casuale uniforme (SURS) sistematico.
   1. In primo luogo, calcolare il rumore , pari al numero totale di neuroni di BrdU positivi contati:
      
   2. Successivamente, calcolare la varianza in SURS:
      NOTA: Abbiamo valutato l'area e le cellule conteggi nell'ippocampo per cambiare senza intoppi da sezione a sezione e quindi usata la "classe di smussatura" m = 1 (1/240) ^{8 , 19}
      dove
      
      
      
      P _i è il numero di punti contati per l'oggetto nella sezione i e n è il numero di sezioni ^{4 , 20} .
   3. Infine, calcolare il CE della stima:
      NOTA: In generale, la precisione ottimale viene normalmente raggiunta quando il valore CE è inferiore alla metà del CV osservato, come OCV ² = ICV ² + CE ² , dove OCV è il CV osservato e ICV è il CV inerente ⁴ .
      

FIgure 1: Schema illustrativo che mostra l'elaborazione dei tessuti secondo i principi del frazionatore utilizzati nel presente studio.
Dopo la sperimentazione, gli emisferi sono separati e l'emisfero destro o sinistro scelto sistematicamente e casualmente (A). Il cervello completo che si estende su tutto l'ippocampo viene tagliato in sezioni coronali di 80 micron di diametro (B), dopo di che ogni 5 sezione viene sub-campionata, iniziando casualmente tra la sezione da 1 a 5, per la quantificazione finale immunoctaining e stereologica (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Illustrazione che mostra la procedura di campionamento stereologico utilizzando disseccatori ottici.
(A) Dopo l'elaborazione istologica l'hIppocampal GCL / SGZ è stato delineato e disettori ottici applicati uniformemente e casualmente sulla regione. (B) Nei disettatori ottici (a sinistra), i neuroni di BrdU-positive sono stati contati solo se la loro caratteristica di interesse è stata riconosciuta chiaramente nell'altezza del disciuttore e si trova all'interno del telaio di conteggio o tocca la linea di inclusione (a destra). I neuroni che toccano la linea di esclusione non sono stati conteggiati. Barre scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Parametri di campionamento

Analizzando la distribuzione z in uno studio pilota ( Figura 3 ), abbiamo trovato una distribuzione uniforme dei neuroni di BrdU-positivi nell'altezza del disciuttore. Si è misurato il ritiro delle sezioni; Lo spessore medio finale era di 26,4 μm (19,0-32,0 μm) in sezioni tagliate in origine a 80 μm. Sulla base dello spessore del tessuto e della distribuzione dei neuroni etichettati con BrdU, l'altezza di disezione è stata impostata a 10 μm e le zone di protezione in alto e in basso della sezione sono state impostate rispettivamente a 5 μm e 4-17 μm. A seconda della densità delle cellule, l'area dei contatori è di 1414 o 5210 μm ² . La lunghezza del passaggio era di 220 μm in entrambe le direzioni x e y e il conteggio delle cellule è stato eseguito in una media di 12 (range 8-16) sezioni per animale. Questi parametri di campionamento hanno portato a una media di 133 (range 33-372) BrdU- cellule positive conteggiate in 173 (107-204) disettatori in ogni emisfero cerebrale.

Come esempio, abbiamo ottenuto i seguenti valori CV e CE per le stime neuronali di BrdU-positive nei ratti trattati ECS: 24 ore: CV = 0,59, CE = 0,11; 3 mesi: CV = 0,34, CE = 0,12; 6 mesi: CV = 0.43, CE = 0.09; 12 mesi: CV = 0,22, CE = 0,09.

Abbiamo quantificato il numero totale di neuroni appena formati e la loro sopravvivenza a lungo termine nell'ippocampo del ratto seguendo ECS utilizzando il frazionatore ottico in combinazione con una tecnica di colorazione BrdU ^{10 , 11} . I risultati finali hanno mostrato una neurogenesi basale nei quattro gruppi di animali di controllo, che non differivano significativamente in funzione del tempo di sopravvivenza ( Figura 3 ). Inoltre, ECS ha indotto un significativo aumento del numero totale di neuroni positivi a BrdU a 24(152%, p <0,05) e 12 mesi (162%, p <0,05) dopo la sperimentazione, rispetto ai controlli degli animali (259%, p <0,0001), 3 (229%, p <0,001).

Figura 3: dati quantitativi del numero totale di neuroni di BrdU-positivi nel GCL / SGZ dell'ippocampo del ratto ^{10 , 11} .
Le barre orizzontali rappresentano i valori medi. Abbreviazioni: GCL, strato cellulare granulare; SGZ, zona sub-granulare; H, ore; M, mesi. **** p <0,0001, *** p <0,001 e * p <0,05 rispetto al controllo (n = 11-12 per gruppo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Utilizzando ECS come metodologia per indurre la neurogenesi, troviamo un immediato aumento del 260% nella formazione di nuovi neuroni di BrdU-positivi nell'ippocampo. In questo pool di neuroni acutamente generati abbiamo trovato il 40% di attrito dal primo giorno a tre mesi, con quasi il 50% dei nuovi neuroni sopravvissuti almeno 12 mesi dopo il trattamento ^{10 , 11} . Il conteggio dei neuroni etichettati con BrdU ha seguito un rigoroso schema di campionamento, per cui l'intero hippocampus è stato tagliato in sezioni di 80 μm di spessore seguito dal sotto-campionamento di ogni ^quinta sezione con un inizio di campionamento casuale tra la sezione uno e la sezione cinque. Fornire queste sezioni sono scelte in maniera sistematica casuale, questo è dimostrabile un ottimo metodo per ridurre la varianza del risultato finale, senza conteggio esaustivo ¹ . Questo schema di campionamento ci ha permesso di contare i neuroni di BrdU-positive in una media di 12 (8-16) ippocampoAl sezioni in ogni cervello del ratto, con una precisione finale del 9-11%.

Quando si utilizza il metodo del frazionatore, è essenziale conoscere la frazione dell'altezza di sezione in cui viene eseguito il conteggio, in quanto il ritiro e la deformazione del tessuto si verificano frequentemente durante l'elaborazione istologica ¹⁴ . Infatti, abbiamo visto una considerevole riduzione dello spessore in questo studio. Inoltre, va notato che può verificarsi un restringimento tissutale differenziale, come presentato in Dorph-Petersen et al. Tuttavia, fintanto che la completa struttura di interesse è disponibile per l'analisi, queste limitazioni non comportano una polarizzazione del numero totale di particelle, cioè dei neuroni di BrdU-positivi. Negli studi in cui il ritiro dei tessuti è un problema particolare, va sempre dichiarato che i risultati sono ottenuti in tessuti deformati. In questo studio, abbiamo contato in un'altezza disciente di 10 μm. Le sezioni del presente studio avevano uno spessore medio finale di 26 μm, un 5 μmLa zona di guardia nella parte superiore e una zona di guardia di 11 μm (media) nella parte inferiore della sezione. Questi parametri sono accettabili poiché le zone di guardia dovrebbero essere circa il diametro delle particelle campionate.

Dopo la delineazione del GCL / SGZ, i disettatori sono stati sistemati in modo omogeneo nell'area delimitata. I disettatori dovrebbero essere posizionati con una lunghezza fissa fissa che ottimizza il campionamento e il conteggio per ottenere in modo efficace le stime con una precisione determinata dall'investigatore. La precisione ottimale viene generalmente raggiunta contando fino a 150-200 cellule in ogni struttura di interesse ⁵ . Nel presente studio, abbiamo contato una media di 133 (gamma 33-372) neuroni di BrdU positivi in ​​ciascun ippocampo del ratto. A causa di un basso numero di cellule in alcuni animali di controllo, i nostri conteggi dei neuroni di BrdU-positivi sono scesi al di sotto del numero generalmente accettabile di cellule necessarie per ottenere una precisione adeguata, che ha portato a valori relativamente alti CE per questi casi. HTuttavia, poiché abbiamo ottenuto valori CE inferiori alla metà dei valori CV (vedere la sezione rappresentativa dei risultati) non è stato richiesto un campionamento supplementare e il conteggio. I valori CV elevati mostrano che il più grande contributore alla variazione osservata deriva dalla variazione biologica. Infatti, possiamo affermare che il numero medio di neuroni positivi di BrdU contati nel presente studio era superiore a quello necessario. Ad esempio, in un gruppo di ratti abbiamo raggiunto un valore CE del 9% e abbiamo osservato un valore CV pari al 43%. In questo caso particolare, avremmo potuto cercare una precisione di circa il 20%. In sintesi, la precisione del numero totale di neuroni positivi di BrdU nel presente studio è sufficiente in quanto cattura effetti reali del trattamento sul numero reale di particelle. A causa della variabilità biologica piuttosto grande in alcuni gruppi di animali, le stesse stime potrebbero essere ottenute con una precisione accettabile, nonostante le spese minime di sforzo. Le elevate variazioni biologiche all'interno dei gruppi possono soloEssere compensato aumentando il numero di animali.

Si potrebbe sostenere che il gold standard per ottenere numeri di cellule esatti comporti un esaustivo conteggio di tutti gli oggetti di interesse. Tuttavia, nella maggior parte degli studi del cervello non è una possibilità a causa del vasto numero di cellule. Sebbene molto più efficiente del conteggio delle cellule esaustive, il frazionatore opzionale è relativamente più lungo rispetto al semplice screening delle differenze nei numeri di cellule che è preferibile se il numero esatto di celle non è essenziale. È nostra esperienza che le differenze di oltre il 20-30% possono essere rilevate puramente dalle procedure di screening.

Se eseguito correttamente, il campionamento usando la stereologia del design fornisce le stime imparziali e precise in modo efficiente ¹ . La proprietà imparziale della stereologia produce stime che, quando replicate, approssimano la media della popolazione reale e migliorano la riproducibilità delStima ²¹ . Inizialmente, un campione rappresentativo dell'intera struttura di interesse (in questo studio l'ippocampo GCL / SGZ) deve essere ottenuto, consentendo la stima in un sottoinsieme statisticamente valido delle sezioni ⁴ . Per ottenere un numero appropriato di sezioni e sonde di conteggio si applica SURS, che riduce la varianza rispetto al campionamento casuale ⁸ . Inoltre, SURS garantisce che le particelle di interesse all'interno della struttura vengono campionate con le stesse probabilità, indipendentemente dalla loro dimensione, forma, orientamento e distribuzione nella struttura. Poiché tale stereologia va altamente raccomandata quando si ottengono stime precise e imparziali, è un aspetto centrale del progetto.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU	Sigma-Aldrich	19-160
Cresyl Violet	Sigma-Aldrich	C5042	Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water
Cryoprotectant	Capital Region Pharmacy, DK	861334	Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M);  ethylenglycol; demineralized water.
dH2O	Capital Region Pharmacy, DK	817205
Diaminobenzidine – DAB	Sigma-Aldrich	D5637
Envision-HRP	DAKO	K4001	Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins
Ethanol - 70 %	Plum A/S	201098
Ethanol - 96 %	Plum A/S	201104
Ethanol - 99.9 %	Plum A/S	201111
Fetal Bovine Serum	In Vitro	BI-04-003-1A
H2O2 30%	Capital Region Pharmacy, DK	896456
HCl	J. T. Baker	6081
Mounting medium	Sakura	4583	Tissue Tek
Mouse-anti-BrdU	Becton-Dickinson	347580
PBS buffer	Capital Region Pharmacy, DK	853436	pH = 7.4
PFA	VWR	28,794,295	pH = 7.4
Phosphate buffer	Capital Region Pharmacy, DK	866533	0.1 mol/l, pH 7.4
Rapid drying mounting medium	Histolab Products AB	801	Pertex
Sodium Tetraborate	Merck A/S	1,063,080,500
Sucrose	Merck A/S	1,076,515,000
Triton X-100	Merck A/S	1,086,031,000
Xylene	VWR	28,973,363
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Cover slips	Menzel-Gläser	24x50 mm #0
Cryostat	Leica	CM1860
Digital Microcator	Heidenhain	VRZ 401
Glass dishes	Brain Resaerch Laboratories	1256
Microscope	Nikon	Eclipse 80i
Microscope camera	Olympus	DP72
Microscope slides	VWR	48311-703	SuperFrost+
Motorized stage	Prior	H101A
Multidish Containers	Sigma-Aldrich	D6315-1CS	Nuclon 12-wells
New-Cast software	Visiopharm	ver. 4.5.6.440
Objective 2x	Nikon	CFI Plan UW 2X
Objective 4x	Nikon	CFI Plan Fluor 4X
Objective 10x	Nikon	CFI Plan Fluor 10X
Objective 100x oil immersion	Nikon	CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil	Numerical aperture 1.40
Orbital shaker	Gemini BV	CM-9	Sarstedt
Slide rack	Sakura	4465
Slide staining dishes	Sakura	4457	Tissue-Tek
Specimen disc	Leica	14037008637
Staining nets	Brain Research Laboratories	2512	25-wells