Monitoraggio effetti Colonia-livello di esposizione dell'antiparassitario subletali sulle API di miele

Riepilogo

Le dosi subletali di pesticidi possono influire sulle colonie in modi che sono difficili da rilevare utilizzando solo metodi periodici o visual. Metodi per misurare la massa totale dell'ape adulta, nidiata e le risorse alimentari di pesatura alveari e parti di alveare, fotografare fotogrammi e l'installazione di sensori, sono fornite. Analisi dei dati si rivolge anche.

Abstract

Gli effetti dell'esposizione ai pesticidi subletali al miele di colonie di API possono essere significativo ma difficili da rilevare nel campo usando i metodi standard di valutazione visiva. Qui descriviamo i metodi per misurare la quantità di api adulte, nidiata e risorse alimentari mediante pesatura alveari e parti di alveare, fotografando cornici e installando gli alveari sulle scale e con sensori interni. Dati da queste valutazioni periodiche vengono poi combinati con l'esecuzione medio e giornalieri dati detrended alveare peso e temperatura interna alveare. I set di dati risultante sono stati utilizzati per rilevare gli effetti di Colonia-livello di imidacloprid applicato in uno sciroppo di zucchero basso quanto 5 parti per miliardo. I metodi sono obiettivo, richiedono poca formazione e fornire registrazioni permanenti sotto forma di uscita del sensore e fotografie.

Introduzione

Recentemente sono state sollevate preoccupazioni circa l'esposizione delle API a basse concentrazioni di sostanze chimiche, specialmente pesticidi. API del miele nel campo possono essere esposti tramite applicazione diretta su api bottinatrici in campo o anche le colonie stesse, per contatto con superfici trattate, da polvere da lavorazioni delle sementi e di consumo di prodotti vegetali come polline, nettare ed essudato^{1 , 2 , 3 , 4 , 5}. tossicità acuta è chiaramente dannosa per le API il miele, ma le concentrazioni che 50% di mortalità per cause a prova di insetti (LC₅₀) di molti pesticidi, tra cui neonicotinoidi quali imidacloprid, sono ben superiore a quella osservata nel pane d'api e cera⁶ e superiore a quello che è considerato un "campo realistico" gamma⁷. Tuttavia, il recente lavoro ha mostrato significativi effetti subletali esposizione agli antiparassitari sulla Colonia livello⁸, anche per concentrazioni basse come 5 parti per miliardo (ppb)⁹.

Colonie di API del miele sono state riferite a come "superorganismi" perché molte funzioni associate con un singolo animale, compreso l'approvvigionamento di cibo, riproduzione (quali colonie di API del miele conducono tramite fissione di Colonia) e controllo della temperatura, sono condotte da gruppi del lavoratore adulto API^{10,11,12,13,14}. Colonie di API del miele, considerati organismi, offrono un'opportunità unica per lo studio perché le strutture che supportano le colonie possono essere smontate, esaminato e riassemblati con, se fatto con attenzione, poco o nessun effetti negativi. Gli apicoltori e i ricercatori approfittare di questo di disassemblaggio alveari di ispezionarli per, tra le altre cose, la presenza e lo stato della Regina, parassiti e patogeni, sufficienza di negozi di alimentari, quantità di covata e altri fattori¹⁵. Colonie di API hanno un'altra caratteristica importante in quanto, a differenza della maggior parte dei homeotherms, sono in genere fissi e ottenere risorse distribuendo le API di Raccoglitore che possono raccogliere cibo a distanze fino a 10 km¹⁶. Alveari di API possono così essere mantenuti indefinitamente su bilance elettroniche, e i dati di peso continuo risultante sono stati indicati per fornire informazioni sul deposito di miele, attività di foraggiamento, successo di foraggiamento, brulicante, consumo di sciroppo, letale e subletale gli effetti dei pesticidi, infestazioni parassitarie e derubare^{9,17,18,19,20}. Perché tutte le parti della Colonia, tra cui la nidiata, sono accessibili, sensori per temperatura, umidità, CO₂, suoni e altri fattori possono essere installati all'interno dell'alveare e utilizzati per ottenere dati continui che informano sullo stato della Colonia e salute ²¹.

Stime delle dimensioni dell'ape adulta e covate popolazioni sono utili se non critica per l'interpretazione di molti tipi di dati continui. Valutazioni visive sono veloce e ampiamente applicate in campo studi²² ma hanno carenze. Ispezioni visive sono condotti solitamente durante il giorno e quindi non conto per api bottinatrici, che possono comporre una parte significativa della popolazione²³. La precisione e l'accuratezza delle stime da ispezioni visive dipendono anche la formazione e l'esperienza degli ispettori. L'oggettività è un'altra considerazione, in particolare se gli ispettori dell'alveare sono consapevoli delle quali orticaria in cui gruppi di trattamento; ipotesi circa la distribuzione dell'errore di tali misure possono essere difficile da giustificare.

Tasso di aumento di peso di alveare, dimensione della popolazione di foraggiamento e le temperature all'interno-alveare, per fornire alcuni esempi, ci si aspetterebbe di essere quantitativamente diversi tra grandi e piccole colonie, così di misura e controllo per dimensione della Colonia spesso notevolmente facilita la rilevazione degli effetti del trattamento negli esperimenti randomizzati. Per scopi di ricerca, una misura precisa e oggettiva delle api adulte è stata sviluppata basato sul principio che la differenza tra l'alveare totale peso durante un periodo di inattività, come di notte e la somma del peso di tutte le parti di alveare (tra cui legno, cera, miele e nidiata) è il peso dell'ape adulta totale massa. Cornici di pesatura e misurando coulors massa utilizzando fotografie di cornice, le risorse alimentari possono essere stimate similarmente sottraendo la massa covata dal peso del telaio, dopo il controllo per i pesi del telaio vuoto e la cera. Questi metodi sono destinati a migliorare la precisione che ci si aspetta da valutazioni visive nel campo.

Protocollo

i protocolli descritti di seguito seguire le indicazioni di cura degli animali del USDA Agricultural Research Service.

1. valutazione completa

Nota: una valutazione completa è necessaria determinare 1) i pesi di tutte le parti di alveare, compresi il coperchio, coperchio, scatole, bordo inferiore, cornici e 2) gli importi delle risorse nidiata e cibo. I pesi di tutte le parti di alveare saranno sommati e sottratto dal peso totale alveare quando tutte le API erano presenti per rendere il peso di tutte le api adulte. Dati sui pesi delle parti di alveare che sono in gran parte costante, come coperchio, bordo inferiore e caselle, possono essere conservati ed utilizzati in futuro valutazioni, accelerando così le valutazioni. Condurre una valutazione completa presso o vicino all'inizio dello studio. Parti in legno possono cambiare in termini di umidità contenuto ²⁴ così ripetere giudizi completo sono raccomandati dopo lunghi periodi. Pesare una parte dell'alveare, come ad esempio il coperchio, ad ogni valutazione per stimare i cambiamenti in altre parti di alveare. Posizionare un vestibolo schermato intorno i lavoratori e hive durante la valutazione se altri alveari sono nelle vicinanze e derubare la pressione è una preoccupazione.

1. Pesare tutte le parti di alveare. Utilizzare una scala con una precisione di 1 g o meno.
   1. Pesare il coperchio, coperchio interno, Escludiregina, alimentatore di sciroppo e qualsiasi altre parti sulla parte superiore dell'alveare.
   2. Utilizzando una spatola o alveare tool, rimuovere, e pesare qualsiasi materiale o trattamento, come integratore di proteine o patty di grasso, che riposa sulle cime dei telai. Se necessario, sostituire in seguito.
   3. Inserire una casella vuota alveare (d'ora in avanti il " casella temporanea ") accanto all'alveare per servire come il percorso di transizione per i fotogrammi. Posizionare la casella temporanea sulla cima di una superficie piana, ad esempio un coperchio o un bordo inferiore, per impedire la caduta fuori dalla scatola sul terreno di API e in particolare la Regina,.
   4. Spostare i fotogrammi rapidamente e delicatamente, preferibilmente in gruppi di due o tre per conservare parti del cluster ape, alla casella temporanea così i fotogrammi sono nello stesso ordine che erano nella scatola originale. Una volta che tutti i frame sono stati spostati, scuotere qualsiasi restanti API sui fotogrammi in provvisorio scatola e pesare la casella alveare.
   5. Se la scatola era la casella più bassa, pesare il bordo inferiore, riduttore di ingresso e le altre parti di alveare dopo l'agitazione le API nella casella temporanea. Numero di fotogrammi con un pennarello indelebile prima di spostarli in modo che possono essere sostituiti nel loro orientamento originale.
   6. Reinstallare il bordo inferiore, riduttore di ingresso, casella di covata e altre attrezzature. Spostare i fotogrammi dalla casella temporanea torna alla casella di covata originale nel loro ordine originale e orientamento, nuovamente avendo cura di evitare inutili disturbi delle API.
2. Rimuovere una cornice da un'estremità della scatola ed ispezionare visivamente entrambi i lati del telaio per la presenza della Regina. Se viene trovata la Regina, suo posto delicatamente in una parte della finestra che è già stato valutato, per evitare ulteriori disturbi. Scuotere le api operaie delicatamente ma con fermezza nella casella tra i fotogrammi, piuttosto che sulla parte superiore, se possibile.
3. Pesare il telaio e fotografare entrambi i lati dell'intero frame con una fotocamera digitale, sempre quanto più vicino possibile al telaio così ridotta nidiata e celle del miele sono facilmente distinguibili, ma a sufficiente distanza così l'intera struttura è incluso. Fotografare il telaio, mentre un altro operaio tiene it.
   1. Uso un ' pinza bloccatelaio ' (qualsiasi jig che detiene il telaio in posizione verticale mentre sulla scala e non mar il pettine) sulla scala. Pesare gli alimentatori di sciroppo all'interno-alveare.
      Nota: Le dimensioni del telaio nella fotografia verranno utilizzata per convertire le superfici da relativo misure assolute.
4. Sostituire il telaio nella posizione originale e orientamento nella finestra di alveare. Rimuovere il fotogramma successivo prima di reinstallare il fotogramma precedente per fornire più spazio per agitare in modo sicuro le API all'interno della casella. Verificare la presenza della Regina, agitare per rimuovere le API, pesare, fotografia e sostituire ogni fotogramma successivo fino a quando non sono stati elaborati tutti i fotogrammi.
5. Se l'hive ha due o più caselle, pesare e portaritratti in primo luogo dalla casella minima.
   1. Rimuovere la casella superiore o caselle in sequenza, metterli accanto l'alveare in senso inverso al loro ordine originale. Una volta che è stata valutata la casella in basso, posizionare la casella successiva per essere valutato in cima la casella in basso, posizionare la casella temporanea in cima le rimanenti caselle non valutate e spostare fotogrammi nella seconda casella temporanea, come sopra. Spostare i fotogrammi indietro alla loro scatola originale, nel loro orientamento originale.
      Nota: Controllando le caselle inferiore prime, scosse API cadrà in una casella di alveare che non sarà disturbata.
6. Ottenere il peso totale alveare durante un recente periodo di inattività, ad esempio la notte o la mattina presto prima che le api stanno volando il giorno della valutazione. Questo peso rappresenta l'intera colonia comprese le raccoglitrici.
7. Calcolare la massa di ape adulta sommando i pesi di tutte le parti di alveare (Dongsen, cornici, ape mangimi, ecc.) e quindi sottraendo tale somma dal " alveare peso totale " valore ottenuto nel passaggio precedente. La differenza tra i due è una stima dell'ape adulta messa.
   Nota: Una volta che avviene la valutazione completa, successive valutazioni possono essere condotta su base parziale, supponendo che le parti non-telaio alveare, come le caselle e il bordo inferiore, non hanno cambiato sensibilmente in peso. Valutazioni parziali richiedono meno tempo.
8. Per condurre una valutazione parziale per un alveare con una singola casella, rimuovere, fotografare, pesare e sostituire i telai senza spostare frame in una finestra temporanea. In un alveare con più caselle, seguire la procedura come descritto in precedenza (punto 1.5), ma senza pesare le caselle alveare.

2. Installazione di alveari sulle scale

Nota: le scale di alveare utilizzate in questo studio sono bilance elettroniche all'aperto con una capienza massima di almeno 100 kg, una precisione di cella di carico di una parte su 5000 con compensazione della temperatura e un cialdina di 460 x 610 mm. Queste scale sono collegate a un indicatore di 24 VDC e un datalogger di 12 bit. Uscita indicatore può essere digitale o analogico; sistemi di scala utilizzati qui erano uscita in mA e taratura richiesto curve per convertire dati in kg.

1. Installazione scale su una superficie piana.
   Nota: Elevare la bilancia da terra utilizzando blocchi di cemento o ceramiche, o pezzi di legno essiccato artificialmente, manterrà la scala e le connessioni elettriche da contatto con terreno o acqua.
2. Coprire la padella di scala sulla parte superiore con plastica, panno, cartone o altro materiale per prevenire eccessiva riflessione della luce e riscaldamento dell'ingresso alveare.
3. Assicurarsi che ingressi di alveari che sono vicine tra loro faccia direzioni diverse per ridurre la deriva tra colonie.
4. Calibra alveare scale al momento dell'installazione e successivamente con cadenza periodica, in particolare se le scale sono spostate. Pesi di calibrazione
   1. scala posto sulla pesatura pan e registrare l'uscita di scala. Assicurarsi che il peso totale supera il 50% della portata massima della bilancia.
      Nota: Se l'uscita di scala è tensione o corrente unità, piuttosto che unità di massa, quindi utilizzare la pendenza e l'intercetta della curva di calibrazione (rapporto tra peso totale noto sull'uscita pan e scala) per convertire unità di massa uscita scala.

3. Installazione di sensori di temperatura

Nota: sensori di temperatura utilizzati in questo studio erano di due tipi: 1) termocoppie attaccato ai cavi direttamente connessi a un datalogger alimentato a batteria (che può essere posizionato all'interno o all'esterno della alveare, se il cavo è abbastanza lungo); e 2) piccoli dispositivi alimentati a batteria con sensori integrati e datalogger e che ha richiesto la rimozione dell'alveare per dati da scaricare.

1. Ottenere un sensore di temperatura che può andare bene tra i fotogrammi, è resistente a condizioni di alta umidità all'interno di un alveare e dispone di sufficiente potenza della batteria e memoria (o accessibile, tramite cavo o connessione wireless).
Sensori di
2. posto che potrebbero essere influenzati dalla cera o propoli in un contenitore di protezione, ad esempio un tessuto che cassetta (USA e getta, piccola scatola di plastica con un coperchio di chiusura snap e con feritoie di ventilazione). Il contenitore di protezione riduce l'accumulo di cera e propoli che possa intasare le porte di accesso di sensore di sensori o influenzare altrimenti Scarica dati.
3. Fissare il sensore appena sotto la barra in alto al centro della casella per fornire dati informativi su brood allevamento (Vedi sotto).
   Nota: Un breve pezzo di filo è collegato al contenitore con il sensore e il filo cucito con punti metallici nella parte superiore del telaio, quindi il contenitore è pende da un lato. Sensori posizionati direttamente sulla massa Covata possono interferire con la covata e pettine manutenzione e sensori posizionati su telai vicino all'esterno, o posizionati su coperture interne o coperchi, possono essere influenzati moltissimo da condizioni esterne, specialmente durante il tempo freddo.

4. Preparazione del trattamento dello sciroppo

Nota: rendere soluzioni di trattamento fresco il giorno di ogni poppata utilizzando grado analitico imidacloprid. Imidacloprid è altamente acqua solubile e quindi facilmente incorporato in sciroppo; alcuni pesticidi hanno bassa solubilità in acqua e devono essere applicati usando altri mezzi. Formulazioni di 1 kg di soluzione di trattamento sono stati applicati usando una bottiglia di plastica di 1 L come segue:

w:w

1. soluzione di saccarosio al controllo (nessun antiparassitario) Mix 1:1 (es. 500 g saccarosio: 500 mL di acqua distillata). Saccarosio di sciogliere in acqua distillata con una grande boccetta miscelazione miscelazione bar su una piastra calda riscaldata a non più di 60 ° C.
2. Per soluzioni contenenti imidacloprid, mescolare la soluzione di saccarosio come sopra, ma trattenere 100ml (così " breve ") per consentire il volume aggiunto di imidacloprid rispettivi " spike " soluzioni.
   1. Sciogliere 500 g di zucchero in 400 mL di acqua distillata per consentire l'aggiunta di un picco di 100 mL per ottenere 1 kg di soluzione di trattamento. Per comodità nel campo, trasferire 900 g di " breve " soluzione a un'altra bottiglia di zucchero, quindi aggiungere la punta di ogni singola bottiglia.
3. Preparare una soluzione stock di imidacloprid 10ppm misurando 1,0 mg di pesticidi su una bilancia analitica e scioglierlo in 100 mL di acqua distillata, utilizzando una barra di miscelazione senza calore.
   Nota: Per evitare problemi con l'elettricità statica, pesare l'imidacloprid in recipienti di plastica piccoli, non reattivi e posizionare tali recipienti direttamente nella soluzione. Agitare la soluzione e rimuovere i recipienti dopo l'imidacloprid ha dissolto.
4. Per un 5 ppb soluzione, mescolare 0,5 mL della soluzione madre in 99,5 mL di acqua distillata per ottenere 100 mL di soluzione di spike. Aggiungere questo a 900 g della soluzione di saccarosio breve per ottenere 1 kg di sciroppo di 5 ppb. Per la soluzione di 20 ppb, mescolare 2,0 mL della soluzione madre in 98,0 mL di acqua distillata per produrre il 100 mL di soluzione di spike. Per un mix di soluzione 100 ppb, 10,0 mL della soluzione madre in 90,0 mL di acqua per la soluzione di spike distillata.

5. Preparazione di Bee Hives e applicazione del trattamento

1. Evaluate colonie per determinare l'ape adulta e popolazioni covate prima e dopo l'applicazione del trattamento. Campione materiale (i) di interesse, come miele, pane d'api, le API o cera, per determinare i livelli di pesticidi basale prima del trattamento.
   1. Di cera di esempio, aprire un tubo di centrifuga da 50 mL, selezionare una sezione del pettine vuota e raschiare la bocca aperta del tubo lungo il pettine, fino a quando la quantità desiderata di cera è stati raccolti. Evitare di toccare la cera nel tubo. Rimettere il tappo sul tubo ed etichettare il tubo. Sostituire la cornice nell'hive.
   2. Per assaggiare il miele o nettare, aprire una provetta da centrifuga e premere la bocca del tubo contro la sezione del pettine contenente il miele o il nettare. Permettere al materiale di fluire nel tubo, piuttosto che raschiando il tubo, per ridurre la quantità di cera nel campione. Rimettere il tappo sul tubo ed etichettare il tubo. Sostituire la cornice nell'hive.
   3. Pane d'api di esempio, selezionare una cornice contenente pane d'api e utilizzare una spatola di plastica o del metallica pulito per rimuovere il contenuto di più celle del pane d'api e posizionare il materiale in una provetta da centrifuga. Sostituire la cornice nell'hive.
      Nota: Raccogliendo materiale sufficiente solitamente richiederà alcuni minuti per ogni frame. Un esempio tipico per analisi dei pesticidi ha almeno 3 g di materiale; assaggiare il miele, la cera e il pane d'api almeno 2 o 3 punti diversi in ogni alveare e combinano questi sottocampioni per ogni alveare.
2. Poco dopo la valutazione, ad esempio il giorno successivo, rimuovere qualsiasi frame favi contenenti miele e nettare e sostituire quei fotogrammi con Fondazione o pettine vuoto disegnato per facilitare il deposito di sciroppo.
   Nota: L'obiettivo è quello di aumentare la capacità di memoria vuota e la domanda per nettare. Se il trattamento deve essere applicato mescolato in un integratore di proteine, rimozione di fotogrammi di cibo potrebbe non essere necessario.
3. Assicurarsi l'alveare ha un alimentatore. Appena possibile dopo la valutazione di pre-trattamento, applicare il trattamento versando lo sciroppo (punto 4.4) nell'alimentatore più rapidamente possibile. Non far per cadere qualsiasi sciroppo fuori dall'alveare dove le API da altre colonie potrebbero trovarlo
   Nota: Alimentatori interni potrebbero funzionare meglio per ridurre rapinare; alcuni pesticidi influiscono sull'ape adulta attività e alveari trattati possono essere meno vigilanti nella protezione di alimentatori da derubare le API ⁹.

6. Analisi delle fotografie di Frame Hive

Nota: cornice fotografie sono fatte durante la valutazione ogni alveare. Informazioni possono essere estratti dalle fotografie utilizzando il seguente protocollo.

1. Attivare un software di analisi di immagine, ad esempio ImageJ, che consente la selezione di una forma su una fotografia con uno strumento di analisi e misurazione della zona della forma selezionata.
2. Recuperare una fotografia digitale di un frame. Selezionare ' File ' e fare clic su ' Open '. Passare alla cartella dove sono tenute le fotografie per selezionare una foto per l'analisi. L'immagine si aprirà in questo momento all'interno del programma di ImageJ e barra degli strumenti ImageJ sarà attiva.
3. Seleziona il ' poligono ' strumento dalla barra degli strumenti. Utilizzare il mouse per fare clic su ogni angolo per definire l'area del telaio rivestito con il pettine. La forma si aggancerà insieme quando viene raggiunto l'angolo iniziale.
4. Una volta l'area di pettine viene definita utilizzando lo strumento poligono, fare clic su ' Analyze ' e selezionare ' MeasureƆ una nuova finestra di dialogo pop-up con la misurazione. Utilizzare la colonna ' zona ' per misurare i pixel all'interno dell'area definita che è stata disegnata.
   Nota: La prima volta che il programma viene utilizzato, definire i risultati desiderati da segnalare.
   1. Clic su ' risultati ' i risultati nella finestra di dialogo e selezionare ' impostare misure '. Zona di selezionare e deselezionare tutti gli altri.
5. Per definire l'area coperta dalla nidiata capped, selezionare il ' Freehand ' strumento. Premere il pulsante del mouse in un punto di partenza e tracciare intorno la nidiata. Quando viene raggiunto il punto di partenza, rilasciare il pulsante del mouse; la forma verrà bloccata in posizione.
   1. Clic ' Analyze ' e selezionare ' misura '. Se il modello di covata non è solido, a causa di fattori come la malattia, utilizzare il ' multi-punto ' strumento selezione per contare le celle invece. Convertire direttamente i conteggi delle cellule di cm ² per facilità di confronto; Ci sono in genere circa 4.01 cellule/cm ^{2 20}.
6. Dividere il valore della forma coulors tracciata dal valore degli interni del telaio per ottenere una copertura del fotogramma percentuale della nidiata capped.
7. Misurare all'interno del frame rappresentativi per ottenere uno standard così la superficie di covata può essere convertita in cm ².
   Nota: Un tipico telaio profondo Langstroth ha una superficie di circa 880 cm ^{2 20}. Ad esempio, se il 20% degli interni di un telaio profondo Langstroth è trovato per essere coperti dalla nidiata, quindi la superficie arEA sarebbe 0,20 x 880 cm ² = 176 cm ².
8. Sommare l'area covata per l'alveare. Per convertire questa misura in massa, moltiplicare la superficie per 0,77 g/cm ^{2 20}.
9. Calcolare l'area della superficie di miele, scoperchiata nettare e polline memorizzati, ad esempio, utilizzando il metodo descritto nei passaggi da 6.3 a 6.6.
   Nota: Se il nettare e polline sono considerati insieme come " negozi alimentari " questo riduce i componenti di una cornice a due (negozi di alimentari e covata). Un tipico telaio Langstroth con plastica foundation e pettine disegnato vuoto pesa circa 556 g ²⁰, così per calcolare il peso dei negozi di alimentari, sommare il peso del telaio con pettine disegnato vuota e il peso della massa covata e sottrarre che peso dal peso osservato del telaio in questione.

Risultati

Sviluppo della colonia dell'ape miele e fenologia, misurate tramite ispezioni regolari alveare con peso continuo monitoraggio, ha rivelato significativamente più bassa produzione covata tra le colonie esposti al imidacloprid a 100 ppb.
Alveare ispezioni hanno dimostrato che le masse ape adulta non erano significativamente influenzate dall'esposizione a entrambe le concentrazioni subletali di 5 e 100 ppb, ma analisi delle fotografie dei telai di covata ha rivelato che la produzione covata nel trattamento 100 ppb era significativamente inferiore ( Figura 1). Dati di peso continuo alveare ha mostrato Colonia diverso tassi di crescita tra gruppi di alveari esposti a diverse concentrazioni di imidacloprid. I dati di peso continuo alveare sono stati divisi in due parti: la h 25 esecuzione di dati medio, che sono legati alla crescita di Colonia e foraggiamento successo e differenza tra i dati grezzi orari e la h 25 in esecuzione medio, l'oraria detrended dati. Le ampiezze giornaliere dei dati detrended sono relative al foraggiamento attività^19,20 (Figura 2). Mentre pesatura alveari occasionalmente potrebbe avere rilevato differenze di peso medio a un certo punto, pesatura continua fornito detrended dati per informazioni sul comportamento di Colonia.

La traversa superiore del telaio centrale in un alveare commerciale tipico è un percorso efficace per sensori di temperatura.
Lavoratore adulto API nelle colonie generano e mantengono temperature elevate (33-36° C) soprattutto in presenza di covata¹⁴ e il cluster stesso è mobile per approfittare del cibo negozi in diverse parti dell'alveare^25,26. Per ridurre perdita di calore, cluster di evitano di avere una grande superficie di contatto con parti esterne dell'alveare, come i lati o il fondo, così la distanza dall'alto al centro della scatola al cluster raramente è grande. Alto al centro della casella di covata ha dimostrato di avere ridotta variabilità di temperatura rispetto ad altre località nell'alveare, come alto al centro di un telaio esterno e la parte superiore di una seconda casella ("super") in estate e la caduta condizioni²⁰. In condizioni invernali, in cui la differenza tra la temperatura ambiente e il cluster dovrebbe essere il più grande, nella stessa posizione è stata trovata per avere la temperatura massima e minima variabilità rispetto alle condizioni ambientali, che indica la il maggior contributo dal cluster stesso (figure 3 e 4; Tabella 1). Differenze nei regimi di temperatura non potrebbero essere attribuite alle differenze nella massa delle api adulte (tabella 2).

Ampiezze delle curve seno corrispondono ai dati di temperatura continuo erano significativamente più alte nel trattamento 100 ppb rispetto nel trattamento 5 ppb mentre nessuno dei due gruppi di trattamento erano significativamente differenti dal gruppo di controllo ⁹ .
Ampiezze sono direttamente proporzionali alla variabilità di temperatura, così le ampiezze superiori indicano temperature più variabile a quel punto nell'alveare. Ampiezze inferiori riflettono la maggiore produzione di covata nei gruppi di trattamento di 5 ppb e controllo rispetto al gruppo di trattamento 100 ppb (Figura 5). Questi risultati, insieme a quelli da alveare ispezioni e i dati di peso continuo alveare, confermano che il comportamento a livello di Colonia era significativamente influenzata dall'esposizione a 100 ppb imidacloprid.

Figura 1: Misure delle API e della covata adulto. Alveare di dati di ispezione da maggio 2014, a marzo 2015, per le colonie esposti allo sciroppo contenente 0 (controllo), 5 e 100 ppb imidacloprid vicino a Tucson, AZ. (A) media (+ SEM) totale massa ape adulta; (B) media (+ SEM) sigillato coulors superficie. Zona grigia indica il periodo di trattamento (4-6 kg di sciroppo di saccarosio trattati a settimana per alveare per 6 settimane). Quattro colonie per gruppo di trattamento; una colonia a 100 ppb è morto durante l'inverno. Masse di ape adulta non sono state registrate nel mese di agosto. Dati qui tradotto e viene qui utilizzati con autorizzazione⁹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Dati di peso di miele ape alveare. Dati di peso continuo da giugno a dicembre 2014, per colonie di API del miele esposte allo sciroppo contenente 0, 5 e 100 ppb imidacloprid vicino a Tucson, AZ. (A) peso totale alveare (± SEM); (B) ampiezze delle curve seno adattano al peso del detrended dati rispetto allo stesso periodo. Zona grigia indica il periodo di trattamento (4-6 kg di sciroppo di saccarosio trattati a settimana per alveare per 6 settimane). Quattro colonie per gruppo di trattamento; una colonia a 100 ppb è morto durante l'inverno. Dati qui tradotto e viene qui utilizzati con autorizzazione⁹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: All'interno-alveare temperature alle posizioni differenti. Temperature media (± SEM) giornaliere (° C) per 3 posizioni del sensore all'interno di alveari di API del miele. (A) 4 single-box alveari mantenuti a un sito di alta quota (MLEM: 2412 m); e (B), 3 alveari mantenuti a un sito ad altitudine inferiore (SRER: 719 m) vicino a Tucson, AZ da dicembre 2013 a febbraio 2014. Alveari erano in legno Langstroth caselle profonde (capacità 43,65 l) dotati di coperchi interni in legno e metallo-foderato telescopico coperchi. Sonde di temperatura termocoppia sono stati fissati alle barre superiore dei telai, e un sensore di temperatura/datalogger integrato è stato disposto sul binario inferiore del frame centrale. Questi dati mostrano che la posizione del sensore nella parte superiore del frame centrale era costantemente superiore a quella ambiente rispetto ad altre posizioni di sensore e così ben informato sulla gestione della temperatura di colonie dell'ape. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Variabilità di temperatura alle posizioni differenti all'interno di alveare. Ampiezze di media (± SEM) giornaliero per sine curves in forma di dati di temperatura del detrended orari per 3 posizioni del sensore all'interno di alveari di API del miele. (A) 4 alveari conservati in sito di alta quota (MLEM: 2412 m); e (B), 3 alveari mantenuti a un sito ad altitudine inferiore (SRER: 719 m) vicino a Tucson, AZ da dicembre 2013 a febbraio 2014. Alveari erano in legno Langstroth caselle profonde (capacità 43,65 l) dotati di coperchi interni in legno e metallo-foderato telescopico coperchi. Sonde di temperatura termocoppia sono stati fissati alle barre superiore dei telai, e un sensore di temperatura/datalogger integrato è stato disposto sul binario inferiore del frame centrale. Questi dati mostrano che la posizione del sensore nella parte superiore del frame centrale era costantemente più bassa nella variabilità (qui misurata come l'ampiezza delle curve seno corrispondono ai dati del detrended orari) che ambientali rispetto ad altre posizioni di sensore e così ben informato sulla gestione della temperatura di colonie dell'ape. Scale per la temperatura ambiente (linea nera continua) sono sulla destra di ogni grafico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Temperature per le colonie trattate all'interno alveare. Dati di temperatura continua da giugno a dicembre 2014, per colonie di API del miele esposte allo sciroppo contenente 0, 5 e 100 ppb imidacloprid vicino a temperatura media alveare di Tucson, AZ. (A) (± SEM); (B) ampiezze delle curve seno coincida detrended temperatura dati dello stesso periodo. Zona grigia indica il periodo di trattamento (4-6 kg di sciroppo di saccarosio trattati a settimana per alveare per 6 settimane). Quattro colonie per gruppo di trattamento; una colonia a 100 ppb è morto durante l'inverno. Dati qui tradotto ed sono usati qui con permesso (Meikle et al. 2016A). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Confronto	test t	ADJ. P	Sito	Dislivello medio a (° C)
Pos. 2 - pos. 1	2.05	0,0485	MLEM	1.00 ± 0,25
			SRER	4.38 ±0.12
Pos. 2 - pos. 3	0.84	1	MLEM	±0.21 2.05
			SRER	±0.11 0,12

Tabella 1: Media differenze di temperatura e confronti post-hoc tra posizioni differenti sensori all'interno di alveari di API del miele. Posizione 1: telaio esterno superiore; Posizione 2: top frame centrale; Posizione 3: fondo medio frame. 4 singolo-scatola alveari sono stati tenuti in un sito di alta quota (MLEM: 2412 m) e 3 alveari sono stati tenuti a un sito ad altitudine inferiore (SRER: 719 m) vicino a Tucson, AZ da dicembre 2013 a febbraio 2014. Alveari erano in legno Langstroth caselle profonde (capacità 43,65 l) dotati di coperchi interni in legno e metallo-foderato telescopico coperchi. Sonde di temperatura termocoppia sono stati associati alle posizioni 1 e 2, e un sensore di temperatura/datalogger integrato è stato fissato in posizione 3.

Gruppo	Data	(± SEM) ape adulta massa (g) media	Media (± SEM) covata superficie (cm2)
MLEM	18 novembre 2013	2119 ±412	1372 ±396
SRER	15 novembre 2013	2270 ±312	± 30 53
MLEM	13 febbraio 2014	2171 ±105	0
SRER	11 febbraio 2014	2027 ±487	867 ± 79

Tabella 2: Media adulto ape masse e masse nidiate, stimate utilizzando i protocolli descritti qui, per quattro alveari mantenuti a un sito di alta quota (MLEM: 2412 m); e tre alveari mantenuti a un sito ad altitudine inferiore (SRER: 719 m) vicino a Tucson, AZ da dicembre 2013 a febbraio 2014. Alveari erano in legno Langstroth caselle profonde (capacità 43,65 l) dotati di coperchi interni in legno e metallo-foderato telescopico coperchi. Sonde di temperatura termocoppia sono stati associati alle posizioni 1 e 2, e un sensore di temperatura/datalogger integrato è stato fissato in posizione 3.

Discussione

Proprio come un raccolto scienziato richiede dati accurati e precisi per valutare gli effetti dei diversi trattamenti sulla crescita delle piante e resa, miele ape ricercatori richiedono dati accurati e precisi per valutare attività e sviluppo della colonia dell'ape. Questi tipi di dati sono particolarmente importanti quando gli effetti del trattamento può essere sottile e lungo termine, come potrebbe essere previsto quando le API sono esposte a basse concentrazioni di pesticidi.

I dati di peso continuo alveare contengono molte informazioni sulla crescita e sull'attività delle colonie allo studio, così come la risposta di quelle colonie alle dispersioni esogene, come ad esempio da derubare le API e dall'aggiunta di sciroppo di zucchero per un alimentatore⁹. Tuttavia, una corretta interpretazione dei dati di temperatura e peso continuo richiede una certa conoscenza della dimensione della Colonia su base periodica. Mentre la dimensione della popolazione apicola adulto può essere stimata dalle ampiezze giornaliere dei dati orari detrended durante un flusso di nettare, a causa del traffico aumentato forager, di fuori di un flusso di nettare la relazione non tenuto ben²⁰. Allo stesso modo, peso di Colonia cambia a causa del successo di foraggiamento, consumo alimentare e popolazione delle API aumenta e diminuisce (ad es. ape uccide) sono in parte una funzione della dimensione della Colonia. Colonie di minori dimensioni possono essere sano ma mostrano tassi di crescita inferiori e meno massa forager, per esempio, semplicemente dovuto una popolazione inferiore a foraggiere.

Identificare una posizione coerente e informativa fissa per un sensore di temperatura all'interno dell'alveare è cruciale per la produzione di risultati riproducibili, specialmente con svernamento. Precedenti ricerche hanno dimostrato che temperatura Monitoraggio presso la traversa superiore di un telaio centrale nella finestra di nidiata (in basso) meno sono stati correlati con temperature ambiente (esterne) di diverse altre posizioni nell'alveare e più sono stati influenzati dalla Colonia stessa ²⁰. durante l'inverno, differenze di temperatura tra il cluster di Colonia dell'ape e ambiente dovrebbe essere alta, e così le differenze tra le posizioni all'interno dell'alveare allo stesso modo dovrebbe essere maggiore nei mesi più caldi. Inoltre, il cluster di ape si muoverà in diverse posizioni all'interno dell'alveare per sfruttare risorse alimentari^25,26. Lo studio di inverno qui descritto ha mostrato che le temperature alle posizioni orizzontale, dalla parte superiore centrale di migliori strutture esterne, erano significativamente differenti mentre differenze verticali su frame centrale non erano. Movimento di aria orizzontale tra frame è relativamente limitato mentre movimento verticale lungo un telaio non, è quindi miscelazione verticale dovrebbe essere maggiore. Questi risultati confermano che un sensore di posizione sulla barra superiore del frame centrale rischia di essere informativi riguardo temperatura influenze dalla Colonia.

Alveare giudizi come sono descritti qui risolvere alcuni di questi problemi. Sottraendo la somma dell'alveare parti dal peso totale alveare misurati nei periodi di inattività, come di notte, la stima dell'ape adulta massa è indipendente dal numero di api bottinatrici e così insensibile al momento della valutazione. Registrazione dei dati da una scala permette di poco spazio per la soggettività, e fotografie di telaio forniscono una registrazione permanente, quindi analisi di superfici nidiata o cibo possono essere rivisitati se necessario, riducendo così la dipendenza sulla formazione della persona facendo le analisi.

I metodi descritti qui non sono senza fonti di errore. Alveare parti c'è bisogno di essere libera delle API come possibile e qualsiasi pezzi significativi del pettine o altro materiale che viene rimosso dovrebbero essere pesati prima scartato. Il contenuto di umidità del legno componenti possa cambiare nel tempo e alveari vuoti possono esibire misurabili oscillazioni giornaliere di peso a causa di cambiamenti giornalieri all'umidità relativa dell'ambiente²⁴. Un alveare contenente una Colonia probabilmente non cambierà tanto perché le API tendono a mantenere un'umidità relativamente costante all'interno dell'alveare²⁷, che sarebbe attenuare gli effetti di ambientali. Questi metodi dipendono anche lavorando rapidamente. Una volta che un alveare è smontato, le condizioni di temperatura e gas cambiano drasticamente e le temperature fredde possono avere un impatto coulors salute¹⁴. Smontando un alveare senza uno schermo per tenere fuori le API dalle vicine colonie possa promuovere derubare, soprattutto in periodi di scarsità di nettare.

Le modifiche di queste procedure sono occasionalmente necessari. Mentre è nell'interesse di ricercatori di raccogliere quanti più dati possibile, in alcune occasioni, come quando devono essere ispezionati molti alveari, quando derubando la pressione è alta, o quando le condizioni meteo non sono ottimale, i lavoratori devono muoversi rapidamente e rinunciare a alcuni dati. Se i dati sulle riserve di cibo non sono cruciali, cornici contenenti solo miele e/o il polline o cornici con solo la cera o la Fondazione, devono essere pesati ma non fotografati. Livelli di scoperchiata larve e le uova sono anche di interesse per alcuni ricercatori e che vengono spesso rilevati nelle fotografie di telaio; Tuttavia, al fine di evitare di campionamento bias un ricercatore deve essere fiducioso nel riuscire a individuarli in tutte le fotografie. Spesso solo con un massimo di nidiata può essere identificato in modo affidabile e coerente su fotografie scattate in condizioni di campo. Per quanto riguarda l'applicazione del trattamento, alcuni alveari, in particolare quelli alimentati le dosi elevate di imidacloprid, può diventare letargici, causando una riduzione nel consumo di sciroppo e la loro capacità di difendere il loro alveare. Se una colonia non riesce a consumare il suo sciroppo dopo 5-7 d, lo sciroppo deve essere rimosso, pesato e scartato (per evitare la contaminazione a causa della fermentazione) e la Colonia ha offerto sciroppo fresco. Pesando lo sciroppo scartato, ricercatori avranno record di quanto ogni colonia consumato e così possono calcolare il dosaggio totale. Infine, l'applicazione di trattamenti in sciroppo di zucchero è più efficace quando ci sono pochi o nessun fonti di nettare alternativi. Fonti di nettare alternativi diluirebbe il trattamento ad un grado sconosciuto. I ricercatori dovrebbe tenere a mente, come è stato sottolineato nella sezione protocollo, che i pesticidi quali imidacloprid sono associati con i livelli di attività ridotta, compresa la protezione alveare, a seconda della concentrazione. Difesa di Colonia ridotta può anche portare a derubare aumentata e confusione possibile dei trattamenti.

I risultati presentati qui presentazione che continuo monitoraggio di peso di alveare e temperatura interna sono sensibili a livello di Colonia comportamenti, anche con rispettano ai cambiamenti del comportamento indotti da molto basso (5 ppb) le concentrazioni di pesticidi neurotossici. Ulteriore applicazione di questi metodi per altre neurotossine e pesticidi con altri modi di azione, quali regolatori di crescita degli insetti, sarebbe aumentare la nostra comprensione degli effetti delle dosi campo-realistico sulle colonie di API del miele.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Langstroth hive equipment (box)	Mann Lake Ltd, Hackensack, MN	KD-700
Langstroth hive equipment (frame)	Mann Lake Ltd, Hackensack, MN	WW-900
Langstroth hive equipment (lid and cover)	Mann Lake Ltd, Hackensack, MN	WW-302
Langstroth hive equipment (base)	Mann Lake Ltd, Hackensack, MN	WW-316
Langstroth hive equipment (internal feeder)	Mann Lake Ltd, Hackensack, MN	FD-505
Cordovan Italian queens and bee packages	C.F. Koehnen & Sons, Glenn, CA
Scale, bench (100 kg max. capacity): model B-2418	TEKFA, Copenhagen, Denmark	discontinued
Scale, bench (100 kg max. capacity): Diamond Series	Avery Weigh-Tronix , Fairmont, MN	1824-200
Imidacloprid, analytical-grade CAS # 138261-41-3	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103	37894
Electronic scale, precision (precision = 0.1 mg): Adventurer Pro 260	Ohaus,  Parsippany, NJ	AV264C
Electronic scale, portable (15 kg max. cap.): Ranger Count 3000	Ohaus, Parsippany, NJ	RC31P15
Thermocouple probe: TMC6-HD	Onset Computer Corp., Bourne, MA	TMC6-HD
Datalogger, 12-bit: Hobo U-12	Onset Computer Corp., Bourne, MA	U12-012
Temperature and r.h. datalogger: iButton Hygrochron	Baulkham Hills, NSW 2153, Australia	DS1923
Temperature datalogger: iButton Thermochron	Baulkham Hills, NSW 2153, Australia	DS1922L
Nalgene plastic bottle	Thermo Scientific, Rochester, NY	2104-0032
Tissue embedding cassette	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	B1000731WH
Digital camera: Pentax K-01	Ricoh Imaging Co., Ltd.	15241
ImageJ version 1.47 software	W. Rasband, National Institutes of Health, USA
Centrifuge tubes, 50 ml	Fisher Scientific, Asheville, NC	14-959-49A