Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un protocollo a isolare e cultura gli osteoclasti in vitro da midollo osseo di topo e di studiare il ruolo della destinazione dei mammiferi/meccanicistica della rapamicina complesso 1 nella formazione degli osteoclasti.

Abstract

Gli osteoclasti sono unico osso-resorbing cellule che si differenziano da monocito/macrofagica del midollo osseo. Una serie di malattie metaboliche dell'osso, compreso osteoporosi può provocare disfunzione degli osteoclasti. Per sviluppare obiettivi farmaceutici per la prevenzione della perdita di massa ossea patologica, si devono intendere i meccanismi da cui gli osteoclasti differenziano dai precursori. La capacità di isolare e un gran numero di osteoclasti in vitro della coltura è fondamentale al fine di determinare il ruolo di geni specifici nel corso del differenziamento degli osteoclasti. Inattivazione del mammiferi/meccanicistica bersaglio della rapamicina complesso 1 (TORC1) in osteoclasti può diminuire il numero degli osteoclasti e aumentare la massa ossea; Tuttavia, i meccanismi di fondo richiedono ulteriore studio. Nello studio presente, un protocollo basato su RANKL per isolare e cultura osteoclasti da midollo osseo di topo e di studiare l'influenza di inattivazione di mTORC1 sulla formazione degli osteoclasti è descritto. Questo protocollo ha provocato con successo un gran numero di osteoclasti giganti, in genere entro una settimana. Eliminazione di Raptor alterata formazione di osteoclasti ed ha fatto diminuire l'attività secretiva fosfatasi acida tartrato-resistente, che indica che mTORC1 è essenziale per la formazione degli osteoclasti.

Introduzione

Dell'osso è un organo mutevole ed è ristrutturato da osteoblasti e osteoclasti per tutta la vita. Gli osteoclasti sono responsabili del riassorbimento di matrice mineralizzata e osteoblasti sintetizzano e secernono nuovo osso matrici¹. L'equilibrio tra la formazione dell'osso e riassorbimento dell'osso è cruciale per salute dell'osso, compreso il mantenimento di ossa massa e la risposta alla stimolazione e lesioni. Se questo equilibrio viene interrotto, può verificarsi una serie di malattie metaboliche dell'osso, compreso l'osteoporosi e le malattie parodontali. In queste malattie, perdita di massa ossea derivante da riassorbimento osteoclastic dell'osso supera l'osso formando la capacità di osteoblasti^2,3. Così, al fine di sviluppare obiettivi farmaceutici per il trattamento di patologie ossee come l'osteoporosi, è fondamentale per capire la generazione e la biologia di osteoclasti⁴.

Gli osteoclasti sono cellule multinucleated giganti uniche situate in o vicino alla superficie dell'osso e appartengono alla famiglia del monocito/macrofago¹. Ibbotson K. J. et al. segnalato un metodo per generare osteoclast-come le cellule in vitro con mezzo contenente 1,25-diidrossi-vitamina D3⁵. L'identificazione del fattore di stimolazione della macrofago-colonia (M-CSF) e attivatore del recettore per il ligando di nuclear factor-κ B (RANKL) come fattori essenziali della formazione degli osteoclasti è aumentato drammaticamente l'efficienza di osteoclastogenesi in vitro ^{1 , 6 , 7}. la capacità di cultura osteoclasti in vitro ha migliorato la nostra comprensione della generazione e regolamento degli osteoclasti.

La destinazione dei mammiferi/meccanicistica rapamycin (mTOR) funzioni in due complessi strutturalmente e funzionalmente distinte, vale a dire mTORC1 e mTORC2^8,9. I due complessi della multi-proteina sono distinti gli uni dagli altri a causa dei loro diversi componenti e substrati a valle. mTORC1 contiene la proteina unica regolamentazione-collegata di mTOR (Raptor), mentre mTORC2 contiene il compagno rapamicina-insensibile di mTOR (Rictor)⁹. mTORC1 è in grado di integrare e trasmettere segnali importanti per regolare la crescita cellulare, la proliferazione e la differenziazione. Recentemente, abbiamo dimostrato che mTORC1 svolge un ruolo chiave nella rete di riassorbimento dell'osso catabolico dall'eliminazione di Raptor per inattivare mTORC1 in osteoclasti¹⁰. Tuttavia, i meccanismi di fondo richiedono ulteriore studio. Nel presente studio, un metodo basato su RANKL osteoclastogenico è stato usato per generare gli osteoclasti da derivate da midollo osseo macrofagi (saggi) di wild-type (WT) e topi Rap^Ctsk e di studiare l'influenza di inattivazione di mTORC1 su osteoclasto formazione.

Protocollo

Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite secondo il protocollo approvato dal pannello amministrativo, Stanford su cura degli animali di laboratorio (APLAC) e sono state approvate dal comitato di uso della Shanghai Istituto di biochimica e cellulare e cura degli animali Biologia.

1. preparazione

1. Generare degli osteoclasti specifico Raptor eliminazione topi (Raptor^fl/fl; Ctsk-cre, aldilà Rap^Ctsk) dall'accoppiamento Raptor^fl/fl topi con Ctsk-cre topi. Utilizzare i mouse Raptor^fl/fl come controllo WT in questo studio.
2. Dispone di un contenitore con ghiaccio per mantenere isolato dell'osso.
3. Preparare il terreno di coltura.
   1. Preparare il terreno di coltura α-MEM completando il minimo essenziale alfa medio (α-MEM) 1 x glutammina, penicillina-streptomicina e 10% di siero fetale di vitello.
   2. Preparare il supporto di induzione di macrofago del midollo osseo costituito da 50 mL di medium di α-MEM e M-CSF a 20 ng/mL.
   3. Preparare il supporto di induzione di osteoclasto consistente di M-CSF e RANKL a 20 ng/mL, rispettivamente, in 50 mL di terreno di α-MEM.
4. Preparare i buffer seguenti prima della colorazione della trappola.
   1. Preparare la soluzione di fix composto da 6,5 mL di acetone, 2,5 mL di soluzione di citrato e 0,8 mL di soluzione (vol/vol) formaldeide al 37%.
   2. Preparare la trappola soluzione di colorazione.
      1. Preriscaldare la acqua deionizzata a 37 ° C.
      2. Aggiungere 100 µ l di soluzione di base fast garnet GBC e 100 µ l di soluzione di nitrito di sodio in una microprovetta 1,5 mL e mescolare capovolgendo delicatamente per 30 s. lasciate il composto riposare per 2 min.
      3. Preriscaldare la 9 mL di acqua deionizzata a 37 ° C. Aggiungere 200 µ l di soluzione di diazotized fast garnet GBC base dal punto 1.4.2.2, 100 µ l di soluzione di fosfato del naftolo AS-BI, 400 µ l di soluzione di acetato e 200 µ l di soluzione di tartrato.
      4. Mantenere la trappola macchiatura soluzione di miscela in un bagno di acqua a 37 ° C.
5. Preparare il tampone di seguenti prima di quantificazione di attività di trappola del terreno di coltura.
   1. Preparare il tampone di tartrato (50 mL): 2 mL di acido L-tartarico 0,33 M, 48 mL di 0,33 M tartrato di sodio bibasico disidratare. Regolare il pH a 4.9.
   2. Preparare 4-nitrofenil fosfato disodico (pNPP) tampone (200 mL): 1,502 g di glicina, 41 mg di MgCl₂, 27,2 mg di ZnCl₂e 180 mL di acqua deionizzata. Regolare il pH a 10.4 con 3 M NaOH e il volume di 200 mL con acqua deionizzata.
   3. Preparare il tampone di pNPP con substrato fosfatasi (per una piastra a 96 pozzetti): 49,37 mg di substrato fosfatasi e 175 µ l di tampone di pNPP di passaggio 1.5.2.
   4. Preparare il tampone substrato (9 mL/96 pozzetti): 6,24 mL di acqua deionizzata, 360 μL di soluzione di acetato e 2,4 mL di tampone tartrato. Mescolare Vortex e preriscaldate a 37 ° C prima dell'uso.
   5. Aggiungere 90 μL di tampone di pNPP con fosfatasi substrate(1.5.3) a 9ml di substrato preriscaldato buffer(1.5.4) per fare una miscela di substrato e vortexare per 10 s.

2. dissezione (giorno -1)

1. Eutanasia 3 topi femminili della WT e Rap^Ctsk del one-month-old di CO₂ separatamente. Eseguire l'inalazione di CO₂ con attrezzature adeguate da personale addestrato.
2. Immergere 6 topi in un becher con 100 mL di etanolo al 75% (vol/vol) per 5 min prevenire la contaminazione batterica e poi posto su una tavola di dissezione in posizione supina. Fare un'incisione presso il distale della tibia verticalmente e sezionare la pelle lungo l'arto con forbici oftalmiche.
3. Tagliare il legamento articolare dell'articolazione dell'anca con le forbici e dislocare le zampe dal tronco.
4. Tagliare il legamento articolare dell'articolazione del ginocchio e attentamente dissociare la tibia e femore al giunto di ginocchio. Rimuovere delicatamente il tessuto molle con le forbici.
5. Posizionare tutte le ossa di un genotipo in un mouse a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 2 mL di α-MEM sul ghiaccio.
   Nota: Per mantenere la vitalità cellulare, l'osso dovrebbe essere mantenuto in queste condizioni per meno di 1 h.

3. isolamento (giorno -1)

1. Riempire un pozzetto di una piastra di sei pozzetti con etanolo di 75% (3 mL) e le altre 5 pozzi con mezzo di α-MEM (3 mL).
2. Mettere tutte le ossa di un genotipo nel lavaggio di etanolo per 15 ossa s e lavare 5 volte con mezzo di α-MEM per 10 s ogni volta.
3. Tagliare delle epifisi con la forbice e inserire un ago di siringa di 0,45 mm la cavità e a filo del midollo osseo fuori con il mezzo di α-MEM in una provetta da centrifuga da 50 mL.
4. Sciacquare la cavità dell'osso usando lo stesso metodo da altra estremità dell'osso. Ripetere almeno due volte per lavare accuratamente la cavità dell'osso fino a quando l'osso è pallido.
5. Centrifugare il midollo osseo per ottenere un pellet cellulare a 800 x g e a 4 ° C per 5 min, aspirare il surnatante.
6. Aggiungere 3 mL di tampone di lisi delle cellule di anima rosse nella provetta da centrifuga e pipetta dolcemente per risospendere il midollo osseo. Tenere la provetta da centrifuga sul ghiaccio per 8 min a lisare cellule rosse del sangue.
7. Aggiungere 6 mL di terreno di α-MEM nella provetta da centrifuga per interrompere lisi cellulare. Centrifugare a 500 x g e a 4 ° C per 10 min e aspirare il supernatante.
8. Risospendere in 3 mL di terreno di coltura di α-MEM e inserire le celle in una piastra a 6 pozzetti (generalmente un mouse per pozzetto).
9. Incubare a 37 ° C in un incubatore a CO₂ 5% durante la notte.

4. placcatura (giorno 0)

1. Trasferire il surnatante in una provetta per centrifuga 15 mL per raccogliere le cellule non attaccate la mattina successiva.
2. Centrifugare a 800 x g e a 4 ° C per 5 min e aspirare il supernatante.
3. Risospendere in 4 mL di terreno di coltura di α-MEM.
4. Prendere 20 µ l della soluzione cella e mescolare con 20 µ l di Trypan Blue. Aggiungere 10 µ l della miscela nella camera di conteggio e ottenere il conteggio delle cellule per mL di soluzione.
5. Aggiungere un volume adeguato di α-MEM di coltura per ottenere una soluzione di cella di 500.000 cellule/mL.
6. Aggiungere 500 µ l e 50 µ l di terreno di induzione di midollo osseo del macrofago in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e piastra a 96 pozzetti, rispettivamente.
7. Aggiungere 500 µ l e 50 µ l di soluzione di cella in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e piastra a 96 pozzetti, rispettivamente.
8. Incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO₂ per 3 giorni.

5. differenziazione (giorni 3-7)

1. Tre giorni dopo il placcaggio, raccogliere medio di 50 µ l di ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e congelare a-20 ° C e quindi aspirare il mezzo residuo.
2. Aggiungere 1 mL e 100 µ l degli osteoclasti induzione media in tutti i pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e una piastra a 96 pozzetti, rispettivamente.
3. Incubare a 37 ° C per 2 giorni.
4. Raccogliere 50 µ l di terreno da ogni pozzetto e aspirare il mezzo residuo.
5. Aggiungere mezzo induzione degli osteoclasti in ciascun pozzetto.
6. Incubare a 37 ° C per 1 giorni.
   Nota: A questo punto del tempo, grandi, multinucleated osteoclasti dovrebbero essere visto sotto un microscopio invertito (Figura 2A).
7. Se non si vedono gli osteoclasti, cambiare il mezzo di induzione degli osteoclasti e osservare quotidianamente fino a quando gli osteoclasti sono visti.
8. Raccogliere 50 µ l di terreno da ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti dopo gli osteoclasti sono formate.

6. tartrato fosfatasi acida resistente (TRAP) colorazione

Nota: Gli osteoclasti maturi possono essere presenti dopo 6-7 giorni di coltura in vitro (passaggio 4).

1. Medio di aspirare e lavare delicatamente 3 volte con 1x PBS.
2. Fissare le cellule in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti con 100 µ l di soluzione di correzione per 30 s a temperatura ambiente.
3. Dopo la fissazione, aspirare la soluzione di fix e lavare delicatamente 3 volte con acqua deionizzata preriscaldata a 37 ° C. Aspirare acqua deionizzata.
4. Aggiungere 100 µ l di macchia TRAP in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti e posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 30 min e scudo dalla luce.
5. Dopo la colorazione, aspirare la macchia di trappola e delicatamente lavare 3 volte con acqua deionizzata.
6. Osteoclasti immagine utilizzando un microscopio invertito a 40 ingrandimenti.

7. trappola attività quantificazione del terreno di coltura

1. Raccogliere il supernatante di coltura di 30 µ l di ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti dal passaggio 5.1, 5.4 e 5.8; Utilizzare 30 µ l di terreno di induzione di osteoclasto non coltivate come controllo negativo. Posizionare i campioni in una nuova piastra a 96 pozzetti.
2. Aggiungere 90 μL di mixture(1.5.5) di substrato in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti.
3. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 1 h e scudo dalla luce.
4. Fermare la reazione aggiungendo 50 µ l di 3 M NaOH in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti.
5. Misurare la theabsorbance alla lunghezza d'onda di 405 nm.

8. Western Blotting

Nota: Dopo 6-7 giorni di cultura in vitro della piastra a 24 pozzetti, osteoclasti maturi dovrebbero essere visibili.

1. Aspirare il mezzo.
2. Lavare delicatamente con pre-raffreddata 1X PBS 3 volte.
3. Aspirare il PBS.
4. Aggiungere 100 µ l di 1 x SDS lysis buffer contenente l'inibitore della proteasi cocktail.
5. Lisati di calore a 105 ° C per 10 min e centrifugare a 12.000 × g e 4 ° C per 10 min. raccogliere i surnatanti contenenti proteine.
6. Separare i lisati contenenti 30 µ g di proteina di 10% SDS-PAGE¹¹ e poi il trasferimento ad una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF).
7. Bloccare le membrane con 5% latte scremato per 30 min.
8. Incubare le membrane con anti-Raptor, anti-P-S6, anti-S6, anti-β-actina a diluizione 1:1,000 in 5% latte scremato a 4 ° C durante la notte.
9. Lavare le membrane con Tris isotonico con Tween-20 (TBST) per 10 min a temperatura ambiente.
10. Ripetere il passaggio 8,9 due volte.
11. Incubare le membrane con perossidasi di rafano (HRP)-coniugato gli anticorpi di IgG anti-topo o coniglio alla diluizione di 1:5,000 in 5% latte scremato per 1 h a temperatura ambiente.
12. Lavare le membrane 3 volte con TBST per 10 min a temperatura ambiente.
13. Per rilevazione chemiluminescente, aggiungere substrato chemiluminescente occidentale di HRP sulle membrane e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Drenare il substrato in eccesso ed esporre le macchie a pellicola di raggi x.

Risultati

Utilizzando il presente protocollo, un gran numero di osteoclasti giganti sono stato veduto il giorno 6; Se non si vedono gli osteoclasti giganti, un altro giorno di differenziazione di osteoclasto può essere necessari (Figura 1). Formazione di osteoclasti successo è stata confermata dalla trappola macchiatura (Figura 2A). Osteoclasts erano cellule giganti di vino rosso/viola con più di 3 nuclei. Più di 250 osteoclasti sono s...

Discussione

Il dosaggio di osteoclastogenico è il metodo più utilizzato per isolare e cultura gli osteoclasti in vitro^12,13. Mentre diversi induzioni degli osteoclasti RANKL-base sono stati descritti^13,14,15, lo studio presente ha descritto un protocollo con alcune modifiche sulla base dei metodi precedenti.

Nello studio precedente, saggi erano...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Raptorfl/fl mice	The Jackson Laboratory	013188
Ctsk-cre mice			a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM	Corning	10-022-CVR
Glutamine	Gibico	25030081
Penicillin streptomycin	Gibico	15140122
Fetal calf serum	BioInd	04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein	R&D	Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein	R&D	Q3TWY5
RBC lysis buffer	Beyotime	C3702
Trypan blue	Sigma-Aldrich	302643
Acetone	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution	Sigma-Aldrich	915
Formaldehyde solution	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution	Sigma-Aldrich	3872
Sodium Nitrite Solution	Sigma-Aldrich	914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution	Sigma-Aldrich	3871
Acetate solution	Sigma-Aldrich	3863
Tartrate solution	Sigma-Aldrich	3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Corning	21-031-CVR
L-tartaric acid	Sigma-Aldrich	251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate	Sigma-Aldrich	s4797
Glycine	Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2	Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2	Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate	Sigma-Aldrich	P4744
anti-Raptor	Cell Signaling Technology	2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236)	Cell Signaling Technology	2317
anti-ribosomal protein S6	Cell Signaling Technology	2211
anti-β-actin	Santa Cruz Biotechnology	sc-130300
37% formaldehyde	Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane	Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)	Millipore	00000367MSDS
IX71	Olympus
Envision	Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep