RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

요약

이 원고 osteoclast 형성에서 복잡 한 1 rapamycin의 포유류/기계적 대상의 역할을 연구 하 고 마우스 골 수에서 분리 및 문화 osteoclasts에 생체 외에서 프로토콜을 설명 합니다.

초록

Osteoclasts 뼈 resorbing 고유는 골의 monocyte/대 식 세포 계보에서 차별화 하는 셀. Osteoclasts의 장애는 뼈 대사 질환, 골다공증 등의 시리즈에 발생할 수 있습니다. 병 적인 뼈 질량 손실의 방지를 위한 제약 목표를 개발 하는 선구자에서 osteoclasts 분화 메커니즘 이해 되어야 한다. 격리 하 고 많은 osteoclasts에서 생체 외에서 문화 능력이 osteoclast 차별화에 특정 한 유전자의 역할을 결정 하기 위해 중요 합니다. Osteoclasts에 복잡 한 1 (TORC1) rapamycin의 포유류/기계적 대상의 비활성화 수 osteoclast 수 감소와 증가 뼈 질량; 그러나, 근본적인 메커니즘 추가 연구 필요. 현재 연구에서 mTORC1 비활성화 osteoclast 형성에의 영향을 공부 하 고 분리 하 고 마우스 골 수에서 osteoclasts 문화 RANKL 기반 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 일반적으로 1 주일 이내 거 대 한 osteoclasts의 많은 수에서 결과. 랩 터 의 삭제 osteoclast 형성 장애 고 분 비 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소, 그 mTORC1을 나타내는 osteoclast 형성에 대 한 중요 한의 활동을 감소.

서문

뼈는 끊임없이 변화 장기 이며 osteoblasts 그리고 생활 내내 osteoclasts에 의해 개조. Osteoclasts 광물 화 된 매트릭스 재흡수에 대 한 책임은 osteoblasts 합성 하 고 새로운 뼈 매트릭스¹분 비. 뼈 재흡수와 골 형성 사이 균형은 뼈의 유지 보수를 포함 하는 뼈 건강에 중요 한 대량 및 자극과 상해에 대 한 응답. 이 균형을 방해 하는 경우 골다공증 및 치 주 질환을 포함 한 일련의 뼈 대사 질환 발생할 수 있습니다. 이 질병에서 뼈 질량 손해 osteoclastic 뼈 재흡수 osteoblasts^2,3의 능력을 형성 하는 뼈를 초과 합니다. 따라서, 골다공증 같은 골격 질환을 치료 하 제약 목표를 개발 하기 위하여 그것은 생성 및 osteoclasts⁴의 생물학을 이해 하는 중요 한.

Osteoclasts 독특한 거 대 한 multinucleated 세포 나 뼈 표면 근처에 위치 하 고 monocyte/대 식 세포 가족¹에 속한다. Ibbotson K. J. 외. 1, 25-dihydroxy-비타민 D3⁵를 포함 하는 매체와 osteoclast 같은 세포에서 생체 외에서 생성 하는 방법을 보고. Osteoclast 형성의 필수적인 요인으로 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 및 핵 요인-κ B ligand (RANKL)에 대 한 수용 체 활성의 식별 극적으로 osteoclastogenesis 체 외 의 효율성 증가 ^{1 , 6 , 7}. 수 문화 osteoclasts에서 생체 외에서 세대의 우리의 이해와 osteoclasts의 규제 개선 했다.

2 구조적 및 기능적으로 뚜렷한 단지, 즉 mTORC1 및 mTORC2^8,9rapamycin (mTOR) 함수의 포유류/기계적 대상. 두 다 단백질 복합물은 다릅니다 서로 그들의 서로 다른 구성 요소와 다운스트림 기판. mTORC1 mTORC2 포함 mTOR (Rictor)⁹의 rapamycin을 구분 하지 않는 동반자 mTOR (랩 터)의 독특한 규정 관련 단백질을 포함 합니다. mTORC1 통합 하 고 통제 세포 성장, 증식 및 분화에 중요 한 신호를 전송할 수 있습니다. 최근에, 우리는 mTORC1 중요 한 역할 catabolic 뼈 재흡수의 네트워크에서 랩 터 osteoclasts¹⁰에서 mTORC1을 비활성화에 삭제에 의해 입증. 그러나, 근본적인 메커니즘 추가 연구 필요. 현재 연구에서 야생-타입 (WT) 및 랩^Ctsk 마우스의 골 수 유래 세포 (BMMs)에서 osteoclasts를 생성 하 고 mTORC1 비활성화 osteoclast에의 영향을 공부 RANKL 기반 osteoclastogenic 메서드 사용 되었다 형성입니다.

프로토콜

동물에 관련 된 모든 절차 실험실 동물 케어 (APLAC)에 스탠포드 행정 패널에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행한 및 동물 관리 및 사용 위원회 상하이 연구소 생화학 및 세포의 승인 생물학입니다.

1입니다. 준비

1. Osteoclast 특정 랩 터 삭제 마우스 (랩 터^{플로리다/플로리다}; 생성 Ctsk-cre, 향후 랩^Ctsk) Ctsk-cre 쥐와 랩 터^{플로리다/플로리다} 쥐를 교배 하 여. 랩 터^{플로리다/플로리다} 마우스를 사용 하 여이 연구에서 WT 컨트롤.
2. 고립 된 뼈를 유지 하는 얼음 용기가 있다.
3. 문화 매체를 준비 합니다.
   1. 최소 필수 중간 알파 (α-MEM) 1 x 글루타민, 페니실린-스와 10% 태아 종 아리 혈 청을 보완 하 여 α-MEM 문화 매체를 준비 합니다.
   2. 골 대 식 세포 유도 매체 20 ng/mL에서 α-MEM 매체와 M-CSF의 50 mL의 구성 된 준비.
   3. Osteoclast 유도 매체 구성 된 M-CSF RANKL 20 ng/mL에서 각각, α-MEM 매체의 50 ml에서를 준비 합니다.
4. 트랩 얼룩이 지기 전에 다음 버퍼를 준비 합니다.
   1. 아세톤, 시트르산 솔루션 및 37% (vol/vol) 포름알데히드 용액의 0.8 mL 2.5 mL의 6.5 mL의 구성 수정 솔루션을 준비 합니다.
   2. 트랩 솔루션 얼룩을 준비 합니다.
      1. 37 ° c.에 prewarm 이온된 수
      2. 1.5 mL microtube에 빠른 가닛 GBC 기본 솔루션의 100 µ L 및 나트륨 아 질산염 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 혼합 30 미 허가 부드러운 반전 하 여 2 분 동안 서 서 혼합물.
      3. 37 ° c 이온된 물 9 mL prewarm 단계 1.4.2.2, naphthol AS 비 인산 염 솔루션, 아세테이트 솔루션의 400 µ L 및 주석산 솔루션의 200 µ L의 100 µ L에서에서 빨리 가닛 diazotized GBC 기본 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다.
      4. 37 ° c.에 물 욕조에 혼합 솔루션 얼룩 트랩을 유지
5. 문화 매체의 트랩 활동 정량화 하기 전에 다음 버퍼를 준비 합니다.
   1. 주석산 버퍼 (50 mL) 준비: 0.33 M L tartaric 산 성, 염기 0.33 M 나트륨 주석산의 48 mL의 2 mL 탈수. 4.9에 pH 값을 조정 합니다.
   2. 4-Nitrophenyl 인산 disodium (pNPP) 버퍼 (200 mL) 준비: 글리신의 1.502 g, MgCl₂의 41 밀리 그램, ZnCl₂, 27.2 mg 및 이온된 물 180 mL. 3 M NaOH와 10.4 pH 값 및 이온 물 200 mL을 볼륨을 조정 합니다.
   3. PNPP 버퍼 인산 가수분해 효소 기질 (한 96 잘 접시)에 대 한 준비: 인산 가수분해 효소 기질과 단계 1.5.2의 pNPP 버퍼의 175 µ L의 49.37 mg.
   4. 기판 버퍼 (9 mL/96 잘 접시) 준비: 이온된 수, 아세테이트 솔루션의 360 μ, 주석산 버퍼의 2.4 mL 6.24 mL. 소용돌이 의해 혼합 하 고 사용 하기 전에 37 ° C에서 예 열.
   5. 기판 혼합물 및 10에 대 한 소용돌이를 데워 기판 buffer(1.5.4)의 9 ml에 추가할 인산 가수분해 효소 substrate(1.5.3)와 pNPP 버퍼의 90 μ s.

2입니다. (주-1) 해 부

1. CO₂ 3 1 달 오래 된 여성 WT 및 랩^Ctsk 마우스를 별도로 안락사. 훈련 된 직원에 의해 적절 한 장비와 CO₂ 흡입을 수행 합니다.
2. 6 마우스의 세균 오염을 방지 하기 다음 부정사 위치에 해 부 보드에 장소를 5 분 동안 75% 에탄올 (vol/vol) 100 mL를 비 커에 담가. 경골의 원심에 세로로 절 개를 확인 하 고 안과 위 뒷 다리를 따라 피부를 해 부.
3. 고관절의 관절 인 대가 위로 잘라 고 트렁크에서 뒷 다리 사지를 탈 구.
4. 무릎 관절의 관절 인 대를 절단 하 고 경골 및 대 퇴 골 무릎 관절에서 신중 하 게 끊을. 부드럽게가 위로 부드러운 조직을 제거 합니다.
5. 얼음에 α-MEM의 2 mL와 함께 6 잘 플레이트의 각 음에 한 마우스에 하나의 유전자의 모든 뼈를 배치 합니다.
   참고: 세포 생존 능력을 유지 하는 뼈는 미만 1 시간에 대 한 이러한 조건에서 유지 되어야 한다.

3입니다. 절연 (주-1)

1. Α-MEM 매체 (3 mL)와 75% 에탄올 (3 mL) 6 잘 플레이트 한 우물 및 다른 5 웰 스 작성.
2. 5 번 10 α-MEM 매체와 15 s 및 세척 뼈에 대 한 에탄올 세척에 한 유전자 형의 모든 뼈를 넣어 s 각 시간.
3. 시저와 epiphyses에서 잘라내어 구멍 및 플러시 골 밖으로 50 mL 원심 분리기 관으로 α-MEM 매체와 0.45 m m 주사기 바늘을 삽입.
4. 뼈의 다른 쪽 끝에서 동일한 방법을 사용 하 여 뼈 구멍을 플러시. 뼈는 창백한 될 때까지 철저 하 게 뼈 구멍을 씻어 두 번 이상 반복 합니다.
5. 800 x g와 4 ° C 5 분 Aspirate는 상쾌한 셀 펠 렛을 얻기 위해 골 원심
6. 원심 분리기 튜브와 골 수를 resuspend를 부드럽게 피 펫에 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 3 mL를 추가 합니다. 원심 분리기 튜브 8 분 붉은 혈액 세포를 lyse 얼음에 계속.
7. 세포 세포의 용 해를 막으려고 원심 분리기 튜브에 α-MEM 매체의 6 mL를 추가 합니다. G와 10 분 동안 4 ° C x 500에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.
8. Α-MEM 문화 매체의 3 ml에서 resuspend 고 셀 6 잘 플레이트 (일반적으로 하나의 마우스 잘 당) 합니다.
9. 5% CO₂ 배양 기에서 37 ° C에서 밤새 품 어.

4입니다. 도금 (0 일)

1. 15 mL 원심 분리기 튜브 다음날 아침 첨부 되지 않은 세포를 수집 하는 상쾌한 전송.
2. G와 5 분 동안 4 ° C x 800 centrifuge 고는 상쾌한 발음.
3. Α-MEM 문화 매체의 4 mL에 resuspend.
4. 셀 솔루션의 20 µ L 고 20 µ L Trypan 파랑의 혼합. 세 실로 혼합물의 10 µ L을 추가 하 고 솔루션의 mL 당 셀 수를 얻을.
5. 500, 000 셀/mL의 셀 솔루션을 얻기 위해 α-MEM 문화 매체의 적절 한 볼륨을 추가 합니다.
6. 추가 500 µ L 골 대 식 세포 유도 매체의 50 µ L 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.
7. 추가 500 µ L 셀 솔루션의 50 µ L 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.
8. 3 일 동안 37 ° c 5% CO₂ 배양 기에서 품 어.

5. 차별화 (3-7 일)

1. 도금, 후 3 일 96 잘 접시의 각 우물에서 50 µ L 매체를 수집 하 고-20 ° C에서 동결 후 잔여 중간 발음.
2. 추가 1 mL 및 100 µ L osteoclast 유도 매체는 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.
3. 2 일 동안 37 ° C에서 품 어.
4. 각 우물에서 매체의 50 µ L를 수집 하 고 잔여 중간 발음.
5. 각 우물에 osteoclast 유도 매체를 추가 합니다.
6. 1 일 37 ° C에서 품 어.
   참고:이 시간 포인트에서 큰, multinucleated osteoclasts 보여야 한다 거꾸로 현미경 (그림 2A).
7. Osteoclasts 볼 수 없습니다, osteoclast 유도 매체를 변경 하 고 osteoclasts 볼 수 있습니다 때까지 매일 관찰.
8. Osteoclasts 형성 후 96 잘 접시의 각 우물에서 매체의 50 µ L를 수집 합니다.

6. 주석산 얼룩 저항 하는 산 성 인산 가수분해 효소 (함정)

참고: 성숙한 osteoclasts 생체 외에서 문화 (4 단계)의 6-7 일 후 존재할 수 있습니다.

1. 중간 발음 하 고 부드럽게 1 x PBS로 3 회 세척.
2. 30에 대 한 수정 프로그램 솔루션의 100 µ L 96 잘 접시의 각 잘 셀 수정 실 온에서 s.
3. 고정, 후 수정 솔루션을 발음 하 고 37 ° c.에 prewarmed 이온된 수 3 번 부드럽게 씻어 이온된 수 발음
4. 96 잘 접시의 각 음에 트랩 얼룩의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C에서 30 분 한 빛에서 방패는 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
5. 얼룩, 후 발음 트랩 얼룩 하 고 부드럽게 이온된 물으로 3 회 세척.
6. 이미지 osteoclasts 40 X 확대는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여.

7. 트랩 활동 부 량의 문화 매체

1. 표면에 뜨는 30 µ L 문화 단계 5.1, 5.4, 5.8; 96 잘 접시의 각 우물에서 수집 비 경작 osteoclast 유도 매체의 30 µ L를 사용 하 여 부정적인 제어. 샘플을 새로운 96 잘 접시에 놓습니다.
2. 96 잘 접시의 각 음에 기판 mixture(1.5.5)의 90 μ를 추가 합니다.
3. 1 h와 빛 으로부터 방패에 대 한 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
4. 96 잘 접시의 각 음에 3 M NaOH의 50 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.
5. 405의 파장에서 theabsorbance 측정 nm.

8. 서 부 럽

참고: 6-7 일 후 24-잘 접시에 생체 외에서 문화, 성숙한 osteoclasts 표시 되어야 합니다.

1. 매체 발음
2. 부드럽게 씻어 미리 PBS 3 시간 x 1 냉각.
3. PBS 발음
4. SDS 세포의 용 해 버퍼 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 1의 100 µ L를 추가 합니다.
5. 10 분 동안 105 ° C에서 열 lysates 및 12000 × g와 4 ° C에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 단백질을 포함 하는 supernatants 수집 합니다.
6. Lysates 10 %SDS 페이지¹¹ 30 µ g의 단백질을 포함 하 고 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 전송 합니다.
7. 30 분 동안 5% 탈지 우유와 함께 막 차단 합니다.
8. 반대로 랩 터, 안티-P-S6, S6 안티, 안티-β-말라 4 ° C에서 5% 탈지 우유에 1:1,000 희석 하룻밤에 막 품 어.
9. 실 온에서 10 분 동안 Tris 버퍼 염 트윈 20 (TBST)와 함께 막 씻으십시오.
10. 단계 8.9 두 번 반복 합니다.
11. 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 막 품 어-실 온에서 1 h 5% 탈지 우유에 1:5,000 희석에 반대로 마우스 또는 토끼 IgG 항 체를 활용.
12. 실 온에서 3 시간 10 분 동안 TBST 가진 막을 씻어.
13. Chemiluminescent 탐지에 대 한 세포 막에 서쪽 chemiluminescent HRP 기질을 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어. 초과 기판 배수와 x 선 필름에도 말을 폭로.

결과

현재 프로토콜을 사용 하 여, 많은 수의 거 대 한 osteoclasts에 볼 수 있었다 주 6; 거 대 한 osteoclasts 볼 수 없습니다, osteoclast 차별화의 한 더 날 수 있습니다 (그림 1) 필요. 성공적인 osteoclast 대형 함정 얼룩 (그림 2A)에 의해 확인 됐다. Osteoclasts 이상의 3 핵으로 거 대 한 와인 레드/보라색 셀을 했다. 250 개 이상의 osteoclasts WT BMMs (

토론

Osteoclastogenic 분석 결과 격리 하 고 문화 osteoclasts 생체 외에서^12,13가장 널리 사용 되는 방법 이다. 동안 여러 RANKL 기반 osteoclast inductions 설명된^13,,1415, 현재 연구는 이전 방법에 따라 일부 수정 프로토콜을 설명 합니다.

이전 연구에서 BMMs는 절연

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Raptorfl/fl mice	The Jackson Laboratory	013188
Ctsk-cre mice			a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM	Corning	10-022-CVR
Glutamine	Gibico	25030081
Penicillin streptomycin	Gibico	15140122
Fetal calf serum	BioInd	04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein	R&D	Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein	R&D	Q3TWY5
RBC lysis buffer	Beyotime	C3702
Trypan blue	Sigma-Aldrich	302643
Acetone	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution	Sigma-Aldrich	915
Formaldehyde solution	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution	Sigma-Aldrich	3872
Sodium Nitrite Solution	Sigma-Aldrich	914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution	Sigma-Aldrich	3871
Acetate solution	Sigma-Aldrich	3863
Tartrate solution	Sigma-Aldrich	3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Corning	21-031-CVR
L-tartaric acid	Sigma-Aldrich	251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate	Sigma-Aldrich	s4797
Glycine	Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2	Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2	Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate	Sigma-Aldrich	P4744
anti-Raptor	Cell Signaling Technology	2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236)	Cell Signaling Technology	2317
anti-ribosomal protein S6	Cell Signaling Technology	2211
anti-β-actin	Santa Cruz Biotechnology	sc-130300
37% formaldehyde	Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane	Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)	Millipore	00000367MSDS
IX71	Olympus
Envision	Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep