Valutazione di fragilità dell'osso corticale bovino utilizzando Scratch test

Riepilogo

Questo studio valuta la tenacità alla frattura dell'osso corticale bovino a livello sub-meso utilizzando test graffi microscopici. Si tratta di un obiettivo originale, rigoroso, e riproducibile metodo proposto sondare la tenacità a frattura sotto la scala macroscopica. Potenziali applicazioni stanno studiando modifiche nella fragilità ossea a causa di malattie come l'osteoporosi.

Abstract

L'osso è un complesso materiale gerarchico con cinque distinti livelli di organizzazione. Fattori come l'invecchiamento e le malattie come l'osteoporosi aumentano la fragilità dell'osso, che lo rende soggetto a frattura. A causa del grande impatto socio-economico di frattura ossea nella nostra società, c'è bisogno di nuovi modi per valutare le prestazioni meccaniche di ogni livello gerarchico dell'osso. Anche se può essere sondati rigidezza e resistenza a tutte le scale – nano-, micro-, meso-, e macroscopico – valutazione frattura finora è stata limitata alla prova macroscopica. Questa limitazione limita la nostra comprensione di fratture ossee e vincola l'ambito di laboratorio e studi clinici. In questa ricerca, studiamo la resistenza alla frattura dell'osso da microscopico per le scale di lunghezza mesoscopiche utilizzando micro scratch test combinato con meccanica della frattura non lineare. I test vengono eseguiti in breve orientamento longitudinale sugli esemplari di bovino dell'osso corticale. È stato sviluppato un protocollo sperimentale meticoloso e un gran numero (102) di test sono condotti per valutare la tenacità alla frattura degli esemplari di osso corticale rappresentail l'eterogeneità associata con microstruttura dell'osso.

Introduzione

In questo studio, misuriamo la tenacità alla frattura dell'osso compatto bovina da mesoscala (osteoni) a Microscala (livello lamellare) utilizzando una tecnica novella di gratta e Vinci micro^{1,2,3,4, 5}. Processi di frattura tra cui propagazione di iniziazione e crepa crepa nell'osso sono direttamente influenzati dalla scala di lunghezza a causa della diverse costituenti strutturali e organizzazione a diversi livelli della gerarchia. Pertanto, frattura di osso alle più piccole scale di lunghezza di valutazione è essenziale per producendo una comprensione fondamentale di fragilità ossea. Da un lato, compatto prove convenzionali come la tre-punto di flessione, tensione e prove di flessione sono comunemente eseguite su bovina femore e tibia per la caratterizzazione di frattura alla scala macroscopica^{6,7, 8}. d'altra parte, per misurare la tenacità alla frattura alla scala microscopica, frattura di rientro di Vicker era proposto⁹. Indentazione micro è stato effettuato usando il penetratore di Vicker per generare crepe radiali. Inoltre, il metodo di tenacità di Oliver Pharr nanoindentazione frattura è stato effettuato usando un cubo taglienti angolo penetratore¹⁰.

Negli studi di durezza di frattura nanoindentazione basato sopra, le lunghezze delle crepe così generate sono state misurate dall'osservatore e un modello semi-empirico è stato utilizzato per calcolare la tenacità alla frattura. Tuttavia, questi metodi sono irriproducibili, soggettiva, e i risultati sono fortemente dipendenti dalle abilità dell'osservatore a causa della necessità di misurare le lunghezze crepa usando microscopia ottica o microscopia elettronica a scansione. Inoltre, scratch test sono stati condotti a scala nanometrica, ma il sottostante modello matematico non è basato sulla fisica che non tiene conto per la riduzione della forza a causa di crepe e difetti¹¹. Così, esiste un gap di conoscenza: un metodo per la valutazione di frattura a livello microscopico basato su un modello meccanicistico basato sulla fisica. Questa lacuna di conoscenza ha motivato l'applicazione di micro scratch test per compattare osso concentrandosi sulla suina esemplari⁵prima. Lo studio ora è stato ulteriormente esteso per comprendere bovino dell'osso corticale.

Due differenti orientamenti degli esemplari sono possibili: longitudinale trasversale e breve longitudinale. Longitudinale trasversale corrisponde alla frattura proprietà perpendicolare all'asse longitudinale del femore. Considerando che, in breve longitudinale corrisponde alle proprietà frattura lungo l'asse longitudinale del femore⁵. In questo studio, applichiamo scratch test da ossa di bovini corticale per caratterizzare la resistenza di frattura di osso in senso longitudinale, breve.

Protocollo

Nota: Il protocollo descritto qui, segue le indicazioni di cura degli animali del Comitato uso e Illinois istituzionale Animal Care.

1. campione appalti

1. Raccogliere i femori bovina appena raccolti da un Stati Uniti Dipartimento di agricoltura USDA certificata macello e trasportarli in sacchetti di plastica ermetici in un secchiello.
   Nota: Per lo studio condotto qui, femori sono stati raccolti da animali che sono stati 24-30 mesi vecchi, Campagnolo e pesati circa 1.000 - 1.100 libbre.
2. Congelare i femori a –20 ° C fino all'inizio della procedura di preparazione del campione. Questa temperatura mantiene i femori fresco^12,13,14.

2. taglio, pulizia e incorporare gli esemplari

1. Scongelare i femori congelati in un contenitore con acqua per circa 2 ore a temperatura ambiente.
2. Tagliare più dischi di circa 10-15 mm di spessore dalla regione metà diafisi utilizzando una sega a nastro tavolo superiore diamante per produrre campioni con uniforme area della sezione trasversale dell'osso corticale.
3. Utilizzare un kit di dissezione per rimuovere eventuali tessuti molli o carne collegato l'osso corticale.
4. Le sezioni trasversali dei femori ottenute al passaggio 2.2 usando una lama di diamante-wafering a bassa velocità di taglio visto in condizioni umide lungo l'asse longitudinale dell'osso per ottenere all'incirca cuboidali più sezioni.
   Nota: Qui, solo la preparazione dei campioni e scratch test effettuati sul breve – campioni longitudinali sono discussi. Tuttavia, ad eccezione della direzione di taglio, la procedura di preparazione rimane lo stesso per l'orientamento trasversale.
5. Pulire gli esemplari in una soluzione preparata con 1,5% anionici detergente e candeggiante al 5% per una durata di 20 min in un pulitore ad ultrasuoni.
6. Incorporare gli esemplari di osso corticale in resina acrilica (qui metacrilato di polymethyl (PMMA)) per maneggevolezza e stabilità.
   1. Per incorporare gli esemplari, in primo luogo rivestono le pareti dello stampo con un agente distaccante. Poi mescolare la resina acrilica e l'indurente in un becher, seguendo le istruzioni fornite dal Costruttore PMMA.
   2. Uno degli esemplari dell'osso corticale taglio posto in ogni stampo con la superficie di essere graffiato rivolto verso il basso. Versare la miscela di resina acrilica in questi preparati portacampioni. Lasciate che gli esemplari curare per una durata di fino a 4-5 ore.
7. Tagliare gli esemplari incorporati in dischi di spessore 5 mm, esponendo la superficie di essere graffiato, utilizzando la velocità bassa visto e montare i campioni su dischi di metallo (alluminio) di diametro 34 mm e altezza 5 mm, con adesivo cianoacrilato.
8. Avvolgere gli esemplari in un contatore imbevuto in matasse bilanciato Saline soluzione (HBSS) e conservare in frigorifero a 4 ° C fino a ulteriore uso^15,16.

3. levigatura e lucidatura di protocolli

Nota: Un pre-requisito per test di alta precisione a scale di piccolo-lunghezza è una superficie liscia e livellata di esemplari. Precedenti protocolli di lucidatura^13,17 provocare un grande rugosità superficiale, portando a notevoli imprecisioni nella misura. La sfida consiste nel raggiungere la bassa rugosità superficiale media, meno di 100 nm, su una superficie di grande area 3 x 8 mm² .

1. Macinare i campioni di osso corticale bovino a temperatura ambiente utilizzando grana 400 e 600 articoli di carburo di silicio grana per 1 min e 5 min, rispettivamente. Mantenere la smerigliatrice-lucidatrice a velocità base di 100 e 150 giri/min, rispettivamente.
2. Macchina di macinare gli esemplari dell'osso corticale bovino a temperatura ambiente sui giornali di grana 800 e 1.200 per una durata di 15 minuti per ogni passaggio. Mantenere la smerigliatrice-lucidatrice ad una velocità base di 150 giri/min, velocità della testa di 60 giri/min e di carico di 1 libbra di funzionamento.
3. Lucidare i campioni utilizzando 3 µm, 1 µm e 0,25 µm diamante sospensione soluzioni nello stesso ordine su un panno duro, perforato, tessuto non tessuto per una durata di 90 minuti ciascuno, a temperatura ambiente. Mantenere il carico operativo per ogni passaggio 1 lb con le velocità di base e testate della lucidatrice a 300 giri/min e 60 giri/min, rispettivamente.
4. Polacco il campione con soluzione di sospensione di allumina 0,05 µm su un panno morbido, sintetico rayon per una durata di 90 min a 1 lb con base e testa la velocità di 100 e 60 giri/min, rispettivamente, anche a temperatura ambiente.
5. Mettere i campioni in un becher con acqua deionizzata e porre il becher in un bagno ad ultrasuoni per 2 min tra ogni passaggio consecutivo di molatura e lucidatura per pulire il residuo ed evitare la contaminazione incrociata.
6. Mostra le caratteristiche della superficie mediante microscopia ottica e SEM imaging.
   Nota: Come mostrato in Figura 1, osteoni, canali Haversian, linee di cemento, le lacune e regioni interstiziale, sono stati osservati sugli esemplari dell'osso corticale bovino. Questi metodi di imaging rivelano la natura porosa, eterogenea e anisotropica di esemplari dell'osso corticale. Inoltre, l'esame superficiale avanzata degli esemplari è stato effettuato per valutare la qualità della superficie lucidata. Una superficie lucidata rappresentativa è illustrata nella Figura 2.

4. micro-Scratch Test

Nota: Micro scratch test vengono eseguiti sugli esemplari dell'osso corticale bovino lucido usando un micro tester di gratta e Vinci (Figura 3). Un diamante penetratore di Rockwell con un raggio di punta di 200 µm e apex angolo di 120° è utilizzato per lo studio. Lo strumento consente l'applicazione di un carico lineare progressivo fino a 30 N. Inoltre, lo strumento è dotato di sensori ad alta precisione per misurare il carico orizzontale e la profondità di penetrazione emissioni acustiche generate a causa di graffi. Lo strumento in grado di catturare i panorami delle scanalature gratta e Vinci.

1. Prima della prova di campioni di osso corticale, calibrare la punta del penetratore di Rockwell utilizzando policarbonato come materiale di riferimento³.
2. Collocare il campione di osso corticale sul palco e scegliere il sito di scratch test con il microscopio ottico impostato integrato al modulo micro tester gratta e Vinci.
3. Applicare un carico progressivo lineare con un carico di avvio di carico 30 mN e fine di 30 N. Il tasso di carico deve essere impostato a 60 N/min e la lunghezza di gratta e Vinci a 3 mm.
4. Eseguire serie di scratch test sulla breve longitudinale (Figura 3b) esemplari di bovino dell'osso corticale, come illustrato nella Figura 3.
5. Bagnare la superficie del campione con HBSS dopo una serie di test di graffio ogni tre o quattro per mantenerli idratati.
6. Analizzare i dati di scratch test basati sulla meccanica della frattura non lineare modellazione².

Risultati

Microscopia a forza atomica fu utilizzata per misurare la rugosità della superficie lucidata. Come regola generale, il campione si qualifica come un ben lucidato uno se la rugosità è un ordine di grandezza più piccoli rispetto alla superficie di interesse. In questo caso, la rugosità di superficie misurata di 60 nm su una area di µm 40 µm x 40 rientra chiaramente questo criterio.

Figura 4 Mos...

Discussione

Micro scratch test indurre una frattura misto³. Inoltre, negli esemplari dell'osso corticale bovino longitudinale breve, processi di frattura sono attivati come la sonda scava più a fondo. Per un graffio lungo di 3 mm, il volume prismatico sondato è profondo circa 3.600 µm lungo, 600 µm di larghezza e 480 µm. Questo grande volume ha aiutato nel predire una risposta omogeneizzata. Un modello di meccanica della frattura non lineare ci ha permesso di estrarre la resistenza alla frattura basato s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table Top Diamond Band Saw	McMaster Carr, Elmhurst, IL	Model  C-40	Blade speed of 40 mph; Blade dimensions: 37 inch in diameter, 0.02 inch wide and 0.14 inch deep
Buehler Isomet 5000 Precision Cutter	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	112780	Blade speed in the range of 200-5000 rpm in 50 rpm incrments; 8 inch diamond wafering blade
Branson 5800 Ultrasonic Cleanser	(Through) Grainger, Peoria, Illinois	39J365	Bransonic CPXH ultrasonic bath has a tank capacity of 2.5 gal
Buehler Ecomet 250 Grinder - Polisher	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	497250	8 inch base plate with a speed range from 10-500 rpm
Anton Paar, CSM Instruments Micro scratch tester	Anton Paar Switzerland AG	163251	Compact Platform, Acoutstic Emission Sensor
JEOL 6060LV general purpose scanning electron microscope	JEOL USA, Inc., Peabody, MA		Environmental scanning electron microscope which enables imaging at low vacuum levels.
Philips XL30 ESEM FEG	FEI Company		Wet mode working of the instrument enables imaging of non conductive samples without altering them
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Bovine Femur	L&M Slaughter house, Georgetown, IL		Corn fed, 24-30 month old mature bovine specimens.
Alconox Powdered Precision Cleaner	Alconox, Inc., 30 Glenn St., Ste. 309, White Plains, NY, 10603	1104-1	Biodegradable, Non caustic, Interfering-residue free
Acrylic Plastic Casting	Electron Microscopy Sciences	24210-02	Polymethyl Methacrylate
CarbiMet SiC Abrasive Paper 400 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	36080400	Grinding - Abrasive Papers
CarbiMet SiC Abrasive Paper 600 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	36080600	Grinding - Abrasive Papers
MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	36080800	Grinding - Abrasive Papers
MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	16081200	Grinding - Abrasive Papers
Texmet P For 8'' Wheel PSA	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	407638	Polishing Cloth
8'' Microcloth PSA	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	407518	Polishing Cloth
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 3 µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	406631	Polishing suspension
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 1 µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	406630	Polishing suspension
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 0.25 µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	406629	Polishing suspension
MasterPrep Polishing Suspension, 0.05µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	40-6377-032	Polishing suspension
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025126	Buffer Solution