Rendering tridimensionale e l'analisi di Immunolabeled, chiarito reti vascolari Villous placentare umani

Riepilogo

Questo studio presenta un protocollo per il tessuto reversibile di compensazione, immunostaining, 3D-rendering e analisi di reti vascolari nei campioni di villi di placenta umana nell'ordine di 1-2 mm³.

Abstract

Scambio di gas e sostanze nutritive tra madre e feto si verifica nell'interfaccia di sangue intervillous materno e la vasta rete capillare dei villi che costituisce gran parte del parenchima della placenta umana. La rete capillare dei villi distale è il capolinea del rifornimento di anima fetale dopo diverse generazioni di ramificazione dei vasi che si estende dal cordone ombelicale. Questa rete ha una guaina cellulare contigua, lo strato di barriera di trofoblasto sinciziale, che impedisce la mescolanza di sangue fetale e sangue materno in cui è continuamente bagnata. Insulti per l'integrità della rete capillare placenta, che si verificano in malattie come il diabete materno, l'ipertensione e l'obesità, hanno conseguenze che presentare rischi gravi per il feto, neonato e adulto. Per meglio definire gli effetti strutturali di questi insulti, un protocollo è stato sviluppato per questo studio che acquisisce la struttura capillare rete nell'ordine di 1-2mm³ in cui si possono studiare le sue caratteristiche topologiche in tutta la sua complessità. A tale scopo, vengono sezionati i cluster dei villi terminali da placenta e lo strato di trofoblasto e l'endotelio capillare è immunolabeled. Questi campioni sono poi chiariti con un nuovo tessuto deselezionando il processo che rende possibile l'acquisizione di serie di immagini confocal di z-profondità di ~ 1 mm. I rendering tridimensionali di queste pile sono poi elaborati e analizzati per generare misure di base della rete capillare come volume, il numero di rami capillare e punti di fine ramo capillare, come convalida dell'idoneità di questo approccio per caratterizzazione della rete capillare.

Introduzione

La nostra comprensione della placenta in via di sviluppo e le sue patologie è, in larga misura, limitata a dedurre le relazioni spaziali tra villi adiacenti e capillari contenuti derivati da sezioni istologiche. In questo studio, abbiamo affrontato questo problema sviluppando i mezzi per generare tridimensionale rendering (3D) delle reti capillari placentare umane che sono adatte per l'analisi delle caratteristiche della rete capillare (ad es. ramificazione, solidità). Per fare questo abbiamo unito la macchiatura immunofluorescente con due prodotti di schiarimento del tessuto commerciale, Visikol-1 e Visikol-2 (di seguito come soluzione-1 e soluzione-2).

La placenta umana è un vasto complesso di vasi sanguigni situati all'interfaccia fra sangue intervillous materno e lo sviluppo del feto. Che si estende fuori dal suo inserimento nel piatto corionico, il cordone ombelicale si ramifica in una rete di arterie e vene che si ramificano per coprire la superficie corionica con una complessa rete vascolare. Loro estremità quindi penetrano giù nella profondità del disco placenta dove subiscono diverse generazioni più ramificazione e terminare in villi terminali e le loro reti capillari contenuti, il sito dello scambio di gas, sostanze nutritive, o agli arredi e metabolica rifiuti tra sangue fetale e materno.

Insulti alla rete capillare placenta durante lo sviluppo hanno conseguenze durature per la salute del feto, neonato e l' adulto emergente ^1,2,3. In considerazione di patologie legate alla gravidanza, come aborto spontaneo, restrizione della crescita intrauterina, diabete pre-eclampsia e materna ^4,5,6 c'è un alto valore posizionato sullo sviluppo di metodi di misurazione e caratterizzazione delle reti capillari dei villi placentari. Un ostacolo importante è che le reti vascolari placentari comprendono una vasta scelta di scala. Le reti vascolari superficiali possono essere grande come 4-5 mm di diametro. I capillari dei villi terminali sono dell'ordine di 10 -20 µm di diametro; la placenta contiene oltre 300 km di vasi sanguigni ⁷. Attualmente, ci sono alcune tecniche di rapide e facile da usare che possono catturare questi estremi della scala di nave. Ad oggi, solo un piccolo numero dei villi può essere renderizzato da microscopia. Ad esempio, Jirkovska et al. focalizzata sul villo placenta al termine, combinando microscopia confocale con seriale sezioni ottiche a intervalli di 1 µm ottenuta da 120 µm spessore sezioni; non sul numero di campioni studiati né statistiche sono stati forniti dati ⁸. Strutture capillari sono stati identificati, e contorni dei villi e capillari sono stati disegnati a mano, con tracciati esportati per analisi di immagine. Mentre gli autori discutono le implicazioni delle loro scoperte per la "crescente rete vascolare dei villi", tali conclusioni sono problematici quando il solo "legislatura" (36 + settimana di gestazione) tessuto è studiato. Allo stesso modo, Mayo et unl. e Pearce et al contato sul tessuto della stessa età, per le loro simulazioni di trasferimento di ossigeno e di flusso di sangue, ma le loro analisi sono state limitate a solo qualche termine, villi terminali ^9,10 . Stereology è stato applicato anche allo studio della struttura dei vasi dei villi. Ma ancora una volta, il focus è stato generalmente su gravidanze consegna liveborn infanti con uno o più gravidanza complicanze ^11,12.

Fino a poco tempo, microscopia confocale era limitata a imaging nelle profondità del tessuto di 100-200 µm a causa di assorbimento di eccitazione e di emissione di fluorescenza entro il tessuto sovrastante ¹³ . Se tessuto schiarimento e l'istologia 3D sono state ampiamente descritte in letteratura e ci sono numerosi metodi per il tessuto di compensazione molti sono adatte all'uso con i tessuti in generale, quanto danneggiare irreversibilmente morfologia cellulare attraverso il hyperhydration di proteine o rimozione dei lipidi. Di conseguenza, non è possibile convalidare che questi risultati sono indicativi del tessuto stesso e non artefatti da elaborazione considerando che il nostro tessuto processo di compensazione è una tecnica reversibile che è in grado di convalidare l'istologia tradizionale. Schiarimento del tessuto generalmente coinvolge uno dei tre approcci principali: 1) uniforme di corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI) delle componenti del tessuto da immersione in soluzioni corrispondenti RI, che rimuove la dispersione della luce cumulativa causata dalla lente a causa di continuo fluttuazione di RI basso (citosol) e alta RI (proteine/lipidi) costituenti; 2) rimozione componenti lipidici mediante l'incorporamento in idrogel e utilizzando l'elettroforesi/diffusione per rimuovere componenti lipidici; 3) espansione/denaturazione della struttura della proteina per consentire una maggiore penetrazione di solventi per incoraggiare l'uniformità di RI ¹³. Mentre questi approcci possono eseguire il rendering di tessuti trasparenti e consentire rappresentazioni 3D di biomarcatori per essere generato, queste rappresentazioni 3D sono di discutibile valore clinico in quanto è difficile stabilire se queste immagini sono indicative di proprietà di tessuto o del tessuto processo di compensazione. D'altra parte, poiché il nostro tessuto di compensazione è reversibile standard istologico e/o immunohistochemistry può applicarsi al tessuto stesso per valutare se le alterazioni sono clinicamente significative.

Questo studio presenta un'analisi di 47 distale villi coriali ottenuti da un totale di 23 gravidanze clinicamente normale o elettivamente conclusi tra 9-23 completato weeks' gestazione e due consegne normali di termine. Immunofluorescenza di etichettatura del trofoblasto ed endoteli ha permesso un'analisi quantitativa e automatizzata delle modifiche le reti vascolari dei villi e della loro complessità.

Con questo protocollo, abbiamo isolato e analizzati in precedenza villi terminali e le loro reti capillari su una scala non è possibile. Questo approccio, quando applicato allo sviluppo della rete dei villi e capillare in tutta la gestazione identificherà quelle proprietà che sono il fondamento per la nascita di un bambino sano. Quando applicata a studi di gravidanze complicate, chiarirà anche quando e come le patologie placentare modificare gli alberi dei villi e le reti capillari che hanno guaina, e come questi incidono sul benessere fetale.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida dell'Istituto Statale di New York per ricerca di base nel comitato etico di disabilità dello sviluppo umano di ricerca.

1. villous albero dissezione

1. Sciacquare la formalina riparata del tessuto della placenta con lucidato fosfato salino (PBS)¹⁴ per rimuovere la formalina e posto in una capsula Petri sulla scena di un microscopio di dissezione. Utilizzare bisturi e una pinzetta per prendere in giro il tessuto della placenta a pezzi per individuare dei villi alberi (strutture di ramificazione del threadlike bianchi). Sezionare i pezzi dell'albero del villo (diversi mm di lunghezza) e trasferire il tessuto a un micro-tubo contenente ~ 1 mL di PBS.

2. immunofluorescenza colorazione

1. Con una pipetta, rimuovere il PBS e sostituirli con PBS fresco. Lasciate riposare per 10 min con occasionali vorticoso. Ripetere un' volta.
   Nota: Questo passaggio e tutti gli ulteriori passi sono fatto a temperatura ambiente tranne l'incubazione dell'anticorpo primario.
2. Utilizzando una pipetta, rimuovere e sostituire il PBS con PBS + 0.1% Triton-X100 + 2% di siero di capra (PBS-T-GS) per permeabilize il legame non specifico del tessuto e blocco di anticorpi secondari. Incubare per 30 min.
3. Sostituire il PBS-T-GS con PBS contenente 2% di siero di capra, entrambi del mouse monoclonale anti-CK7 e coniglio anti-CK7.
   1. Incubare il tessuto durante la notte a 4 ° C.
   2. Rimuovere gli anticorpi restanti mediante lavaggio con PBS-GS per 10 minuti con occasionali vorticoso.
   3. Il PBS-GS di rimuovere e sostituire con PBS-GS contenente sia anti-mouse di capra IgG accoppiato con un verde che emettono (520 nm) fluoroforo e capra anti-coniglio IgG accoppiato un emettitori ad infrarossi (652 nm) fluoroforo.
   4. Rimuovere gli anticorpi ripetendo il passaggio 2.1.
   5. Conservare il tessuto immunolabeled a temperatura ambiente al buio.

3. chiarificazione del tessuto

1. Lavare 3 volte con PBS i campioni a intervalli di 10 minuti.
2. Disidratare il tessuto rimuovendo il PBS con una pipetta e sostituendolo con 50% di etanolo (metanolo può essere utilizzato pure). Incubare per 10 min. sostituire con etanolo al 50% e incubare per 10 min. Ripetere questa operazione una volta di più per un totale di 3 incubazioni. Ripetere le incubazioni con 70%. Quindi sostituire con etanolo al 100% e incubare per 15 minuti (in alternativa può essere usato metanolo).
3. Con una pinza a punta fine, trasferire un fresco micro-provetta contenente tessuto ~ 1 mL di soluzione 1 per 4 h.
4. Con una pinza appuntita, trasferimento del tessuto ad un fresco micro-tubo contenente soluzione 2 per ~ 4 h.
   Nota: Quando conservate al buio, l'immunofluorescenza è stabile a temperatura ambiente per almeno 6 mesi.
5. Non miscelare con qualsiasi soluzione acquosa, (ad es. mezzo di montaggio) come la compensazione sarà perso.

4. montaggio per microscopia

1. Non montare il tessuto tra una lastra di vetro standard e un vetrino coprioggetti come il tessuto è morbido e facilmente deformata.
2. Fare riferimento alla Figura 5B e montare il tessuto in una camera di Sykes-Moore come segue;
   1. Con una pinza appuntita porre un coprivetrino rotondo 25 mm nella camera di base.
   2. Con una pinza a punta fine posizionare la guarnizione di gomma nella base il vetrino coprioggetti.
   3. Con una pipetta di depositare una goccia (~ 40 µ l) di soluzione-2 al centro del coprivetrino.
   4. Con le pinze a punta fine trasferire un pezzo di tessuto da soluzione-2 per il calo nel centro del coprivetrino.
   5. Posto un secondo vetrino coprioggetto sulla parte superiore della guarnizione.
   6. Infilare l'anello di bloccaggio nella parte superiore della base che comprime il coprioggetti e la guarnizione fino alla ditta.
      Nota: Fare attenzione a non serrare eccessivamente o andrà in frantumi il vetrino coprioggetti.
   7. Inserire un ago da 22 gauge in una porta sulla base e attraverso la guarnizione.
   8. Riempire una siringa da 3 mL con ~ 1,5 mL di soluzione-2.
   9. Montare un ago calibro 25 sulla siringa.
   10. Inserire l'ago della siringa alla porta opposta e attraverso la guarnizione.
   11. Assicurare che l'aria nella camera è lo sfiato attraverso l'ago di calibro 25 altri, delicatamente iniettare soluzione-2e pimento della camera.
   12. Rimuovere l'ago e la siringa e posizionare la camera su un vetrino grande sul palco al microscopio confocale.
3. In alternativa, tagliare personalizzati pozzi fuori fogli di silicone PDMS.
   1. Con le forbici tagliare un 25,4 × 25,4 mm² pezzi dal foglio PDMS.
   2. Con un bisturi tagliare ~ 12,7 × 12,7 mm² bene nel pezzo.
   3. Premere il pezzo saldamente su un vetrino da microscopio.
   4. Riempire il pozzetto al top con soluzione-2.
   5. Trasferire il pezzo di tessuto dal micro-tubo al centro del pozzo.
   6. Con una pinza appuntita porre un coprivetrino sulla cima del pozzo, tale che la parte inferiore del coprivetrino è bagnata con soluzione-2.
   7. Montare la camera di Sykes Moore con il tessuto sul palco al microscopio confocale.

5. microscopio confocale

1. Mettere il tessuto nella camera a fuoco con un obiettivo 10x.
2. Spostare il tavolino del microscopio su e giù attraverso il piano focale per misurare la distanza tra la parte superiore e inferiore del tessuto.
3. Spostare il palco di 2,5 µm per raccogliere un file di immagine confocale contenente un insieme di immagini attraverso il tessuto dall'alto verso il basso.

6. inversione di schiarimento

1. Invertire la radura trasferendo il tessuto ad un micro-tubo contenente > 20 volte il volume di etanolo al 100%. A 1 h intervalli sostituire con etanolo al 70%, quindi 50% di etanolo e, infine, PBS. Conservare a 4 ° C al buio.
   Nota: Ora elaborare il tessuto per inclusione in paraffina standard, sezionamento e istologico o colorazione immuno-istochimica.

7. deconvoluzione

Nota: Per le fasi successive, comandi software, schede e menu a discesa sono in corsivo.

1. Avviare il software di deconvoluzione e aprire il file di immagine.
2. Immettere i parametri elencati nella finestra'Summary'.
   1. Per 'spaziature immettere i voxel x, y e z dimensioni in µm.
   2. Per ogni canale di colore, selezionare il colorante fluorescente utilizzato per immunostaining dal menu a discesa.
   3. Per il 'modalità ', selezionare Laser confocale di scansione dal menu a discesa.
   4. Per il '' obiettivo, selezionare x 10 dal menu a discesa.
   5. Per il 'mezzo immersione ', selezionare aria dal menu a discesa.
   6. Fare clic sui 'Applica ' pulsante.
3. Fare clic sulla scheda'Deconvolution'.
4. Fare clic su 'deconvoluzione 3D' nel menu a discesa.
5. Nei '3D - deconvoluzione ' finestra assicurarsi che le impostazioni sono: 1) Adaptive PSF cieco, 2) teorico PSF, 3) uso (Default Adaptive PSF, 10 iterazioni, rumore medio), 4) Base nome.
6. Fare clic sui 'pulsante Check verde ' per avviare il programma.
7. Al termine dell'operazione, ripetere i passaggi da 7,3 -7,6 di riavviare il programma. Quando finito di riavviarlo per la terza ed ultima volta.
8. Nei 'Data Manager' finestra, fare clic sul file con il prefisso "10-10 - 10-".
9. Fare clic sui 'File' scheda, quindi fare clic su 'Save As'.
10. Nella finestra'Salva As' selezionare 'integer senza segno a 8 bit' dai 'tipo di dati ' menu a discesa e fare clic su Salva.

8. image Processing

1. Avviare il software di Fiji.
   1. Fare clic su 'File', fare clic su 'aperto ' e selezionare il file di immagine di Deconvolved e fare clic sul 'aperto ' pulsante nella 'aperto ' finestra.
   2. Fare clic su 'immagine/colore/Split canali e convertire l'immagine a tre colori del file in tre nuovi file contenente un solo colore. Salvare il file di immagine rossa che contiene il set di immagine capillare dei villi immunolabeled. Eliminare i file di immagine verde e blu.
   3. Sottrarre la fluorescenza di fondo da file immagine rossa con: 'processo/Sottrai sfondo '.
   4. Nel menu a discesa è possibile impostare raggio della sfera di Rolling a 10 pixel.
   5. Lasciare le opzioni di 4 menu deselezionata e fare clic su 'OK'.
   6. Fare clic su 'Sì nel menu di Stack del processo.
   7. Rimuovere la fluorescenza intrinseca del tessuto (autofluorescenza) aprendo il 'immagine/regolazioni/luminosità-contrasto ' menu e la regolazione delle impostazioni di minimo, massimo, luminosità e contrasto. Fare attenzione a non rimuovere qualsiasi dell'immunofluorescenza capillare.
   8. Ridurre al minimo i restanti irrilevante fluorescenza aprendo la 'Image/Adjust/soglia ' menu e regolando i cursori, tali che l'immunofluorescenza capillare viene evidenziato. Controllare la 'sfondo scuro ' casella e fare clic su 'Applica '. Il i 'convertire in binario discesa ' controllo menu il 'sfondo nero ' casella e fare clic su 'OK'. Salvare il file di immagine in bianco e nero (binario) per analisi qui sotto.

9. analisi

1. Oggetto di conteggio e scheletrizzazione.
   1. Selezionare il file di immagine binaria creato nel passaggio 8.1.8.
   2. Fare clic su 'Analyze/Opzioni di 3D OC e solo assegno 'Volume' e 'Archivio risultati... ' caselle nel menu a discesa. Assicurarsi che la casella 'Visualizza numeri' è deselezionata. Fare clic sui 'OK' pulsante.
   3. Click su 'analizzare/3D oggetti contatore '. Nel menu a discesa, impostare 'dimensione del filtro: min ' a 5000. Assicurare che il 'Escludi oggetti su bordi casella è deselezionata. Verificare che il 'oggettosstatistiche e 'Riepilogo ' le caselle siano selezionate. Fare clic sui 'OK' pulsante.
      Nota: Questo potrebbe richiedere alcuni minuti a seconda della configurazione del file dimensione e computer.
   4. Salvare la tabella delle statistiche e il file di mappa di oggetti.
   5. Selezionare il file di mappa di oggetti. Fare clic su 'plugin/scheletro/Skeletonize 2D-3D' a divorare la rete capillare nel file binario. Fare clic su 'File/Salva come e. Selezionare 'Tiff... ' nel menu a discesa. In TIFF finestra Salva con nome aggiungere "Skel-" al nome del file mappa oggetto e fare clic sui 'salvare ' pulsante.
   6. Fare clic su 'analizzare/scheletro/analizzare scheletro 2D-3D'. Nel menu a discesa accettare le impostazioni predefinite e fare clic sui 'OK' pulsante. Salvare la tabella di 'informazioni' del ramo, la ' tabellarisultati e due file di output (Skel-oggetti-labeled - scheletri e Tagged scheletro).

Risultati

I rendering 3D generati dei capillari nei cluster dei villi terminali nella placenta umana dall'età gestazionale 8 settimane per la consegna di termine sono stati conteggiati come singoli cluster e scheletrati per analisi di rete. Le unità funzionali della placenta (Figura 1A) sono gli alberi del villo che sono un'estensione dei vasi superficiali dove hanno penetrato il parenchima di placenta (Figura 1B...

Discussione

L'Institutional Review Board ha approvato la collezione di tessuti dei villi placentari per fissazione in formalina da gravidanze elettivamente terminate. Prima che le procedure sono state eseguite, una breve revisione della cartella sanitaria notato l'età materna, parità e ha confermato l'assenza di qualsiasi medico sottostante (ad es., ipertensione, diabete ed il lupus) o fetale (anomalie cromosomiche o strutturali, crescita anormale) è stata eseguita. Il foglio di dati e di eventuali campioni raccolti sono...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer	Macron Fine Chemicals	H-121-08	General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic
Scalpel blades	ThermoFisher Scientific	08-916-5B No. 11
Scalpel	ThermoFisher Scientific	08-913-5
Fine forceps	Electron Microscopy Services	78354-119
Micro Tube (1.7 mL)	PGC Scientifics	505-201
Phosphate buffered saline	Sigma	D8537	PBS
Pipette	VWR	52947-948	disposable, 3ml transfer pipette
Triton X-100	Boehriner Mannheim	789 704	Dilute to 0.1% from stock
Goat Serum	Gibco	16210-064	Dilute to 2% in PBS solution
Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30)	ThermoFisher Scientific	MS-1352-RQ
Rabbit Anti-CD31 antibody	Abcam	ab28364
green emitting (520 nm) fluorochrome	Invitrogen	A11017	Alexa-Fluor 488
infrared emitting (652 nm) fluorochrome	Invitrogen	A21072	Alexa Fluor 633
Ethanol alcohol 200 proof	Pharmco-Aaper	111000200	Dilute down to lower concentrations using PBS as needed
Solution-1	Visikol Inc.		Visikol Histo-1
Solution-2	Visikol Inc.		Visikol Histo-2
Skyes-Moore chambers	BellCo Glass Inc.	P/N 1943-11111
25 gauge needle	ThermoFisher Scientific	14-826AA	BD Precision Glide Needes
3 mL syringe	ThermoFisher Scientific	14-823-40	BD disposable syringe
PDMS silicon sheets	McMaster-Carr	P/N 578T31
confocal microscope	Nikon Inc.		Nikon C1 Confocal Microscope
Deconvolution software	Media Cybernetics		AutoQuant X22
Fiji image processing software			free, Open source  software available at https://fiji.sc
Hematoxylin	Leica Biosystems	3801570	Component 1 of SelecTech H&E staining system
Alcoholic Eosin	Leica Biosystems	3801615	Component 2 of SelecTech H&E staining system
Blue Buffer	Leica Biosystems	3802918	Component 3 of SelecTech H&E staining system
Aqua Define MCX	Leica Biosystems	3803598	Component 4 of SelecTech H&E staining system
Immunohistochemistry detection system	ThermoFisher Scientific	TL-125-QHD	UltraVision Quanto Detection System HRP DAB