Rendu tridimensionnel et l’analyse d’immunomarquées, a précisé réseaux vasculaires villosités placentaires humains

Résumé

Cette étude présente un protocole pour le tissu réversible clearing, immunomarquage, rendu 3D et l’analyse des réseaux vasculaires dans des échantillons de villosités du placenta humain sur l’ordre de 1 à 2 mm,³.

Résumé

Échange des éléments nutritifs et de gaz entre la mère et le foetus se produit à l’interface entre le sang maternel inter-villosités et le vaste réseau capillaire villositaire qui compose une grande partie du parenchyme du placenta humain. Le réseau capillaire villositaire distal est le terminus de l’approvisionnement en sang fœtal après plusieurs générations de ramification des vaisseaux s’étendant dans le cordon ombilical. Ce réseau a une gaine cellulaire contigue, le trophoblaste syncytial barrier layer, qui empêche le mélange de sang fœtal et le sang maternel dans lequel elle baigne en permanence. Insultes à l’intégrité du réseau capillaire placentaire, se produisant dans des affections comme le diabète maternel, l’hypertension et l’obésité, ont des conséquences que présenter des risques graves pour la santé pour le fœtus, infantile et adult. Afin de mieux définir les effets structurels de ces insultes, un protocole a été développé pour cette étude qui capture la structure du réseau capillaire sur l’ordre de 1 à 2 mm³ dans lequel on peut étudier ses caractéristiques topologiques dans toute sa complexité. Pour ce faire, les grappes de villosités terminales du placenta sont disséqués, et la couche de trophoblaste et l’endothelia capillaire est immunomarquées. Ces échantillons sont alors précisés avec un tissu nouveau centre qui permet d’acquérir des piles d’image confocale à z-profondeurs de ~ 1 mm. Les rendus en trois dimensions de ces piles sont ensuite traitées et analysées afin de générer des mesures de base du réseau capillaire comme le volume, le nombre de branches capillaires et les points de fin de branche capillaire, comme la validation de la pertinence de cette approche pour caractérisation du réseau capillaire.

Introduction

Notre compréhension de ses pathologies et le placenta en développement est, dans une large mesure, limitée à déduire les relations spatiales entre les villosités adjacentes et confinées capillaires provenant de coupes histologiques. Dans cette étude, nous avons abordé cette question en mettant au point les moyens de générer des rendus (3D) en trois dimensions des réseaux capillaires placentaires humains qui se prêtent à des analyses des caractéristiques du réseau capillaire (p. ex. ramification, solidité). Pour ce faire, nous avons combiné la coloration par immunofluorescence avec deux produits de compensation commerciale tissu, Visikol-1 et Visikol-2 (ci-après comme Solution-1 et Solution-2).

Le placenta humain est un vaste complexe de vaisseaux sanguins situés à l’interface entre les inter-villosités sang de la mère et le fœtus en développement. S’étendant de son insertion dans la plaque de la gonadotrophine, le cordon ombilical se ramifie en un réseau d’artères et de veines qui ramify pour couvrir la surface chorionique avec un réseau vasculaire complexe. Leurs extrémités puis pénètrent à l’intérieur ou de la profondeur du disque placentaire où ils subissent plusieurs générations plus ramifiées et finissent dans les villosités terminales et leurs réseaux capillaires confinée, le site de l’échange de gaz, nutriments, et métaboliques les déchets entre sang fœtal et maternel.

Insultes au réseau capillaire placenta au cours du développement ont des conséquences à long terme pour la santé du fœtus, nouveau-né et les adultes émergent ^1,2,3. Compte tenu des pathologies liées à la grossesse comme une fausse couche, restriction de croissance intra-utérine, la prééclampsie et maternelle diabète ^4,5,6 il est une valeur élevée placée sur le développement de méthodes de mesure et caractérisation des réseaux capillaires villosités placentaires. Un obstacle majeur est que les réseaux vasculaires placentaires englobent une vaste gamme d’échelle. Les réseaux vasculaires de surface peuvent être aussi grands que 4-5 mm de diamètre. Les terminales capillaires villeux sont l’ordre de 10 -20 µm de diamètre ; le placenta contient plus de 300 km de vaisseaux sanguins ⁷. À l’heure actuelle, il existe peu de techniques faciles à utiliser et rapide qui permet de capturer ces deux extrêmes de l’échelle du navire. A ce jour, seul un petit nombre de villosités peut être rendu par microscopie. Par exemple, Jirkovska et coll. concentrée sur les villosités placentaires à terme, alliant microscopie confocale sériées optiques à intervalles de 1 µm, obtenu à partir de 120 µm de coupes épaisses ; aucune donnée sur le nombre d’échantillons étudiés ni statistiques ont été fournies à ⁸. Capillaires structures ont été identifiées, et les contours des villosités et capillaires ont été dessinées à la main, avec tracés exportées pour analyse d’images. Alors que les auteurs discutent les implications de leurs conclusions pour le « réseau vasculaire villositaire croissant », ces conclusions sont problématiques quand seulement « term » (36 + semaine de gestation) tissu est étudié. De même, Mayo et unl. et Pearce et al s’est appuyée sur le tissu du même âge, pour leurs simulations de transfert de débit et l’oxygène de sang, mais leurs analyses étaient limités à seulement quelques terme, villosités terminales ^9,10 . Stéréologie a également été appliquée à l’étude de la structure des navires villeux. Mais encore une fois, a généralement mis l’accent sur les grossesses ultérieures livrant des naissances de bébés qui ont un ou plusieurs grossesse complications ^11,12.

Jusqu'à une date récente, microscopie confocale se limite à l’imagerie jusqu'à une profondeur de tissu de 100 à 200 µm en raison de l’absorption de l’excitation et d’émission de la fluorescence de tissus sus-jacents ¹³ . Bien que les tissus de compensation et histologie 3D ont été largement décrits dans la littérature et il y a de nombreuses méthodes pour dégager beaucoup de tissus sont impropres à l’usage avec les tissus en général, car ils endommager irréversiblement la morphologie cellulaire par le biais de l’hyperhydratation de protéines ou d’élimination des lipides. Par conséquent, il n’est pas possible de valider que ces résultats sont révélateurs du tissu lui-même et pas d’artefacts de traitement alors que nos tissus processus de compensation sont une technique réversible qui permet de valider l’histologie traditionnel. Compensation de tissu est généralement associée à une des trois principales approches : 1) correspondance uniforme de l’indice de réfraction (RI) de composants tissulaires par immersion dans des solutions correspondantes RI, qui élimine la diffusion de la lumière cumulatif causée de lentille en raison continu fluctuation de faible RI (cytosol) et haute RI (protéines/lipides) constituants ; 2) supprime les composants lipidiques par voie d’incorporation en hydrogel et utilisant l’électrophorèse/diffusion pour supprimer les composants lipidiques ; 3) expansion/dénaturation de la structure des protéines pour permettre une pénétration accrue des solvants afin d’encourager l’uniformité des RI ¹³. Bien que ces approches peuvent rendre les tissus transparents et permettre des représentations 3D des biomarqueurs à générer, ces représentations 3D sont des résultats clinique douteux car il est difficile de déterminer si ces images sont indicatifs des propriétés des tissus ou du tissu processus de compensation. En revanche, nos tissus de compensation étant réversible norme histologique et/ou immunohistochimie peut être appliqué au tissu même d’évaluer si les altérations sont cliniquement significatives.

Cette étude présente une analyse des 47 échantillons villositaire distales a obtenu un total de 23 grossesses cliniquement normaux et facultatif terminés entre des 9-23 semaines de gestation et deux accouchements normaux nés à terme. Immunofluorescence labeling du trophoblaste et endothelia a permis une analyse quantitative et automatisée des changements dans les réseaux vasculaires villeux et leur complexité.

Avec ce protocole, nous avons isolé et analysé les villosités terminales et leurs réseaux capillaires sur une échelle n’est pas possible auparavant. Cette approche, lorsqu’elle est appliquée au développement du réseau capillaire villositaire travers gestation permettra d’identifier les propriétés qui sont à la base pour la naissance d’un enfant en bonne santé. Lorsqu’elle est appliquée à l’étude des grossesses compliquées, il clarifiera également quand et comment les pathologies placentaires modifier les arbres villeux et les réseaux capillaires qu'ils gaine, et comment celles-ci empiètent sur le bien-être fœtal.

Protocole

Ce protocole suit les directives de la New York State Institute pour la recherche fondamentale en déficience Comité d’éthique de la recherche humaine.

1. Dissection de l’arbre villeux

1. Rincez le formol fixé tissu placentaire avec phosphate polie saline (PBS)¹⁴ à retirer le formol et le placer dans une boîte de Petri sur la scène d’un microscope à dissection. Utiliser le scalpel et une pince fine pour taquiner le tissu placentaire part pour localiser les arbres villeux (structures ramifiées filiformes blanches). Disséquer des morceaux d’arbre de villosités (plusieurs mm de long) et transférer le tissu dans un micro-tube contenant environ 1 mL PBS.

2. immunofluorescence

1. Avec une pipette, supprimez les PBS et remplacez-les par PBS frais. Laisser reposer pendant 10 min agitant occasionnellement. Répéter une fois de plus.
   Remarque : Cette étape et toutes les autres mesures sont effectuées à température ambiante sauf l’incubation de l’anticorps primaire.
2. À l’aide d’une pipette, enlever et remplacer les PBS avec PBS + 0,1 % Triton-X100 + 2 % de sérum de chèvre (PBS-T-GS) pour permeabilize la liaison non spécifique tissu et bloc d’anticorps secondaires. Incuber pendant 30 minutes.
3. Remplacer le PBS-T-GS avec du PBS contenant 2 % de sérum de chèvre, les deux souris anticorps monoclonal anti-CK7 et lapin anti-CK7.
   1. Incuber les tissus durant la nuit à 4 ° C.
   2. Supprimer les autres anticorps par lavage avec PBS-GS pendant 10 minutes en remuant occasionnellement.
   3. Supprimez les PBS-GS et remplacez-les par PBS-GS contenant les deux chèvre anti-souris IgG couplé avec un émettant vert (520 nm) fluorophore et chèvre de anti-lapin IgG couplé à une émission infrarouge (652 nm) fluorophore.
   4. Retirer les anticorps en répétant l’étape 2.1.
   5. Stocker le tissu immunomarquées à température ambiante dans l’obscurité.

3. clarification du tissu

1. Laver les échantillons 3 fois avec du PBS à intervalles de 10 minutes.
2. Déshydrater les tissus en enlevant les PBS avec une pipette et remplacer par l’éthanol à 50 % (le méthanol peut être utilisé aussi bien). Incuber pendant 10 min. Remplacez par frais éthanol à 50 % et incuber pendant 10 min. Répétez cette opération une fois de plus pour un total de 3 incubations. Répétez les incubations avec 70 %. Puis remplacer par l’éthanol à 100 % et incuber pendant 15 minutes (vous pouvez également méthanol peut être utilisé).
3. Avec une pince à pointe fine, transfert tissu à un frais contenant des micro-tube ~ 1 mL de Solution-1 pendant 4 h.
4. Avec une pointe fine pince, transfert tissu à un frais micro-tube contenant Solution-2 pour ~ 4 h.
   Remarque : S’il est conservé à l’obscurité, l’immunofluorescence est stable à température ambiante pendant au moins 6 mois.
5. Ne pas mélanger avec une solution aqueuse, (p. ex. milieu de montage) que la compensation sera perdu.

4. montage pour la microscopie

1. Ne montez pas le tissu entre une lame de verre standard et une lamelle car le tissu est doux et facilement déformé.
2. Reportez-vous à la Figure 5B et monter le tissu dans une chambre de Sykes-Moore comme suit ;
   1. Avec une pointe fine pince Placez un lamelle couvre-objet rond 25 mm dans la chambre de base.
   2. Avec une pince à pointe fine, placez le joint en caoutchouc sur la base sur la lamelle couvre-objet.
   3. Avec une pipette, déposer une goutte (environ 40 µL) de Solution-2 dans le centre de la lamelle.
   4. Avec la pince à pointe fine transmettre un morceau de tissu de Solution-2 à la baisse dans le centre de la lamelle.
   5. Placez une lamelle de deuxième sur le dessus de la garniture.
   6. Visser la bague d’arrêt dans la partie supérieure de la base de comprimer les lamelles et le joint jusqu'à la société.
      Remarque : Veillez à ne pas à trop serrer ou le couvre-objet se brisera.
   7. Insérer une aiguille de calibre 22 dans un port sur l’assiette et à travers le joint.
   8. Remplissez une seringue de 3 mL avec ~ 1,5 mL de la Solution-2.
   9. Monter une aiguille de calibre 25 sur la seringue.
   10. Insérer l’aiguille de la seringue dans l’orifice opposé et à travers le joint.
   11. Faire en sorte que l’air de la chambre est décharge à travers l’autre aiguille de calibre 25, injecter doucement solution-2 et remplir la chambre.
   12. Retirer l’aiguille et la seringue et placer la chambre sur une lame de verre grand sur la platine du microscope confocal.
3. Vous pouvez également couper puits personnalisés de feuilles de silicone PDMS.
   1. Avec des ciseaux coupe un 25,4 x 25,4 mm² pièces de la feuille de PDMS.
   2. Avec un scalpel couper ~ 12,7 x 12,7 mm² bien dans la pièce.
   3. Appuyez la pièce fermement sur une lame de microscope.
   4. Remplir le puits vers le haut avec Solution-2.
   5. Transférer le morceau de tissu du micro-tube au centre du puits.
   6. Avec une pointe fine pince placer une lamelle sur le dessus du puits telle que la partie inférieure de la lamelle est humidifiée avec la Solution-2.
   7. Monter l’ensemble de chambre de Moore Sykes avec le tissu sur la platine du microscope confocal.

5. confocal Microscopy

1. Mettre le tissu dans la chambre au point avec un objectif 10 x.
2. La platine du microscope monter et descendre par l’intermédiaire du plan focal pour mesurer la distance entre le haut et le bas du tissu.
3. Déplacer la scène de 2,5 µm à rassembler un fichier d’image confocale contenant un ensemble d’images à travers le tissu de haut en bas.

6. inversion de la clairière

1. Inverser la clairière en transférant le tissu à une micro-tube contenant > 20 x le volume d’éthanol à 100 %. À 1 h des intervalles remplacement par l’éthanol à 70 %, puis 50 % d’éthanol et PBS. Conserver à 4 ° C dans l’obscurité.
   NOTE : Maintenant traiter le tissu pour l’enrobage de paraffine standard, sectionnement et histologique ou coloration immunohistochimique.

7. déconvolution

Remarque : Pour les étapes suivantes, les commandes de logiciels, les onglets et menus déroulants sont indiqués en italique.

1. Lancez le logiciel de déconvolution et ouvrez le fichier image.
2. Entrez les paramètres répertoriés dans la fenêtre «Summary ».
   1. Pour 'espacements entrez le voxel x, y et z dimensions en µm.
   2. Pour chaque couche de couleur, sélectionnez le colorant fluorescent utilisé pour l’immunomarquage dans le menu déroulant.
   3. Pour le 'modalité ', sélectionnez Laser Scanning Confocal dans le menu déroulant.
   4. Pour les "porte-objectif, sélectionnez x 10 dans le menu déroulant.
   5. Pour le 'Immersion moyenne ', sélectionnez Air dans le menu déroulant.
   6. Cliquez sur le 'Apply' bouton.
3. Cliquez sur l’onglet « nDeconvolutio».
4. Cliquez sur 'déconvolution 3D' dans le menu déroulant.
5. Dans le '3D - déconvolution ' fenêtre s’assurer que les paramètres sont : 1) Adaptive aveugle de fibres discontinues de polyesters, PSF 2) théorique, 3) l’utilisation (par défaut Adaptive PSF, 10 itérations, bruit moyen), nom de Base de 4).
6. Cliquez sur le 'bouton Check vert ' pour démarrer le programme.
7. Lorsque vous avez terminé, répétez les étapes-7,3 7,6 pour redémarrer le programme. Lorsque vous avez terminé le redémarrer pour la troisième et dernière fois.
8. Dans le 'Data Manager' fenêtre, cliquez sur le fichier préfixé par « 10-10 - 10- ».
9. Cliquez sur le "File" onglet, puis cliquez sur ''Enregistrer sous.
10. Dans la fenêtre «Enregistrer As » sélectionnez 'entier non signé 8 bits ' de la 'Type de données ' menu déroulant et cliquez sur Enregistrer.

8. traitement de l’image

1. Démarrer le logiciel de Fidji.
   1. Cliquez sur 'File', cliquez sur 'ouvert ' et sélectionnez le fichier image Deconvolved et cliquez sur le 'ouvert ' bouton dans le 'ouvert ' fenêtre.
   2. Cliquez sur 'des canaux de l’Image/couleur/Split et convertir l’image en trois couleurs fichier dans trois nouveaux fichiers ne contenant qu’une seule couleur. Enregistrez le fichier image rouge qui contient l’ensemble d’image capillaire villositaire immunomarquées. Supprimez les fichiers image vert et bleu.
   3. Soustraire la fluorescence de fond du fichier image rouge avec : "fond de processus/soustraction '.
   4. Dans le menu déroulant définie Rolling ball rayon à 10 pixels.
   5. Laissez les options de 4 menu désactivé, puis cliquez sur 'OK'.
   6. Cliquez sur 'Oui dans le menu de la pile de processus.
   7. Supprimer la fluorescence tissu inhérente (autofluorescence) en ouvrant le 'Image/réglage/luminosité-contraste ' menu et en ajustant les paramètres minimum, maximum, luminosité et contraste. Veillez à ne pas supprimer les éléments de l’immunofluorescence capillaire.
   8. Minimiser les restant de fluorescence non pertinent en ouvrant le 'Image/réglage/seuil ' menu et en ajustant les curseurs telles que l’immunofluorescence capillaire est surlignée. Vérifier le 'fond sombre ' zone, puis cliquez sur 'Apply'. Sur le 'convertir en binaire menu déroulant ' cocher menu le 'fond noir ' zone, puis cliquez sur 'OK'. Enregistrez le fichier image (binaire) noir et blanc pour les analyses ci-dessous.

9. analyse

1. Objet de comptage et de squelettisation.
   1. Sélectionnez le fichier image binaire créé à l’étape 8.1.8.
   2. Cliquez sur "Analyze/3D Options' OC et cocher seulement 'Volume' et 'magasin résultats...' cases situées dans le menu déroulant. S’assurer que la case « Numéros de spectacle » est décochée. Cliquez sur le 'OK' bouton.
   3. KcCLI sur 'analyser/3D objets compteur '. Dans le menu déroulant ci-bas, la valeur 'taille de filtre : min. ' à 5000. S’assurer que la ' boîte àexclure des objets sur des bords n’est pas cochée. Vérifier que le ' sObjectdes statistiques et 'Résumé ' cases correspondantes sont cochées. Cliquez sur le 'OK' bouton.
      Remarque : Cela peut prendre plusieurs minutes selon la taille et l’ordinateur configuration du fichier.
   4. Enregistrez le tableau statistique et le fichier de mappage d’objets.
   5. Sélectionnez le fichier de mappage d’objets. Cliquez sur 'Plugins/squelette/Skeletonize 2D-3D' à skeletonize du réseau capillaire dans le fichier binaire. Cliquez sur 'File/Save as'. Sélectionnez 'Tiff...' dans le menu déroulant. Dans la fenêtre TIFF ajouter « Skel- » au nom de fichier de carte objet et cliquez sur le 'Enregistrer ' bouton.
   6. Cliquez sur 'analyser/squelette/analyser squelette 2D-3D'. Dans le menu déroulant, acceptez les paramètres par défaut et cliquez sur le 'OK' bouton. Enregistrer la table de direction « informations » , le "tableaudes résultats et deux fichiers de sortie (Skel-objets-étiqueté - squelettes et Tagged squelette).

Résultats

Les rendus 3D générés des capillaires dans les clusters de villosités terminales dans le placenta humain de 8 semaines d’âge gestationnel, d’accouchement prématuré étaient comptés comme des grappes individuelles et mouvement squelette pour l’analyse de réseau. Les unités fonctionnelles du placenta (Figure 1A) sont les arbres de villosités qui sont une extension des bâtiments de surface où ils ont pénétré dans le parench...

Discussion

L’Institutional Review Board a approuvé la collection de tissus placentaires de villeux pour fixation de formol de grossesses facultatif terminés. Avant que les procédures ont été réalisées, un bref examen du dossier médical a noté âge maternel, parité et a confirmé l’absence de toute médicale sous-jacente (p. ex., l’hypertension, le diabète et lupus) ou fœtales (anomalies structurelles ou chromosomiques, une croissance anormale) a été réalisée. La feuille de données et les échantillon...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer	Macron Fine Chemicals	H-121-08	General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic
Scalpel blades	ThermoFisher Scientific	08-916-5B No. 11
Scalpel	ThermoFisher Scientific	08-913-5
Fine forceps	Electron Microscopy Services	78354-119
Micro Tube (1.7 mL)	PGC Scientifics	505-201
Phosphate buffered saline	Sigma	D8537	PBS
Pipette	VWR	52947-948	disposable, 3ml transfer pipette
Triton X-100	Boehriner Mannheim	789 704	Dilute to 0.1% from stock
Goat Serum	Gibco	16210-064	Dilute to 2% in PBS solution
Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30)	ThermoFisher Scientific	MS-1352-RQ
Rabbit Anti-CD31 antibody	Abcam	ab28364
green emitting (520 nm) fluorochrome	Invitrogen	A11017	Alexa-Fluor 488
infrared emitting (652 nm) fluorochrome	Invitrogen	A21072	Alexa Fluor 633
Ethanol alcohol 200 proof	Pharmco-Aaper	111000200	Dilute down to lower concentrations using PBS as needed
Solution-1	Visikol Inc.		Visikol Histo-1
Solution-2	Visikol Inc.		Visikol Histo-2
Skyes-Moore chambers	BellCo Glass Inc.	P/N 1943-11111
25 gauge needle	ThermoFisher Scientific	14-826AA	BD Precision Glide Needes
3 mL syringe	ThermoFisher Scientific	14-823-40	BD disposable syringe
PDMS silicon sheets	McMaster-Carr	P/N 578T31
confocal microscope	Nikon Inc.		Nikon C1 Confocal Microscope
Deconvolution software	Media Cybernetics		AutoQuant X22
Fiji image processing software			free, Open source  software available at https://fiji.sc
Hematoxylin	Leica Biosystems	3801570	Component 1 of SelecTech H&E staining system
Alcoholic Eosin	Leica Biosystems	3801615	Component 2 of SelecTech H&E staining system
Blue Buffer	Leica Biosystems	3802918	Component 3 of SelecTech H&E staining system
Aqua Define MCX	Leica Biosystems	3803598	Component 4 of SelecTech H&E staining system
Immunohistochemistry detection system	ThermoFisher Scientific	TL-125-QHD	UltraVision Quanto Detection System HRP DAB