Трехмерные визуализации и анализа полученных, пояснил человеческого плацентарного ворсинчатых сосудистой сети

Резюме

Это исследование представляет собой протокол для обратимых ткани, очистка, иммуноокрашивания, 3D-рендеринга и анализа сосудистой сети в плаценте человека Вилли образцах порядка 1-2 мм³.

Аннотация

Обмен питательных веществ и газов между матери и плода происходит на стыке intervillous крови матери и подавляющее ворсинчатых капиллярной сети, что делает большую часть паренхимы человеческой плаценты. Дистальная ворсинчатых капиллярной сети является конечной поставки крови плода после нескольких поколений ветвления судов, которая выходит из пуповины. Эта сеть имеет непрерывный сотовой ножнах, слой барьера-синцитиальный трофобласта, который предотвращает смешивание крови плода и материнской крови, в котором он постоянно купались. Оскорбление целостности плаценты капиллярной сети, происходящих в расстройств, таких как матери диабета, гипертонии и ожирение, иметь последствия что настоящему серьезные риски для здоровья для плода, младенцев и взрослых. Чтобы лучше определить структурные последствия эти оскорбления, протокол был разработан для этого исследования, которое захватывает капиллярной сети структуры порядка 1-2 мм³ которой одно может расследовать его топологических особенностей в всей его сложности. Чтобы достичь этого, разделяются кластеры терминала ворсинки от плаценты, и слой трофобласта и капиллярной endothelia полученных. Затем эти образцы уточняются с новой ткани, очистка процесс, который делает возможным приобрести конфокальное изображение стеки для z глубины ~ 1 мм. Затем обрабатываются и анализируются для создания основных капиллярной сети таких мер, как объем, количество капилляров филиалов и капиллярной филиал конечных точек, как проверка пригодности данного подхода для трехмерной визуализации этих стеков характеристика капиллярной сети.

Введение

Наше понимание развивающихся плаценты и ее патологий в значительной степени ограничивается выведен пространственные отношения между соседними ворсинки и замкнутых капилляров, производный от гистологических срезах. В этом исследовании мы затрагивали этот вопрос путем разработки средств для создания трехмерных (3D) визуализации человеческого плацентарного капиллярных сетей, которые подходят для анализа особенностей капиллярной сети (например ветвления, прочности). Для этого мы объединили, immunofluorescent окрашивание с двух коммерческих ткани очистки продуктов, Visikol-1 и Visikol-2 (именуемых ниже решение-1 и решения-2).

Плаценты человека представляет собой огромный комплекс кровеносных сосудов, расположенный на стыке между intervillous крови матери и развивающегося плода. Которая выходит из его вставки в пластину хорионический, пуповины разветвляется сеть артерий и вен, которые ramify для покрытия хорионический поверхности с разработки сосудистой сети. Их концы затем проникать вниз в интерьер или глубины в плацентарной диска, где они проходят несколько поколений более ветвления и заканчиваются в терминал ворсинки и их содержится капиллярной сети, на сайт обмена газов, питательных веществ, и метаболизм отходов между кровью матери и плода.

Оскорбление плацентарной капиллярной сети во время разработки имеют долгосрочные последствия для здоровья плода, новорожденного и возникающим взрослых ^1,2,3. С учетом патологий, связанных с беременностью, таких как выкидыш, Внутриутробное ограничение роста, преэклампсии и материнской диабет ^4,5,6 есть это большое значение уделяется разработке методов измерения и характеристика плаценты ворсинчатых капиллярной сети. Основным камнем преткновения является, что плацентарной сосудистой сети охватывают широкий спектр масштаба. Поверхности сосудистой сети может быть так велика, как 4-5 мм в диаметре. Терминал капилляров ворсинок являются порядка 10 -20 мкм в диаметре; плаценты содержит более 300 км ⁷кровеносных сосудов. В настоящее время есть несколько прост в использовании и быстрый методы, которые могут захватить эти крайности судна масштаба. На сегодняшний день, только небольшое количество Вилли можно отобразить с помощью микроскопии. Например Jirkovska et al. сосредоточена на плацентарный ворсинок в срок, сочетая конфокальная микроскопия с последовательный оптический секции интервалы 1 мкм, полученные из 120 мкм толщиной секций; нет данных о количестве образцов учился ни статистики были предоставлены ⁸. Капиллярные структуры были выявлены, и контуры ворсинки и капилляров были рисованной, с прориси экспортированы для анализа изображений. В то время как авторы обсуждения последствий их выводов для «растущий ворсинчатых сосудистой сети», такие выводы являются проблематичными, когда только «термин» (36 + недели гестационного возраста) ткань изучается. Аналогичным образом, Мейо etl. и Пирс et al. полагались на ткани того же возраста, для их имитации крови передачи потока и кислорода, но их анализа были ограничены лишь несколько термин, терминал Вилли ^9,10 . Stereology также был применен к изучению структуры ворсинчатых судов. Но опять же, как правило сосредоточены на более поздних беременностей, обеспечивая живорожденных младенцев с одним или несколькими беременности осложнения ^11,12.

До недавнего времени, конфокальная микроскопия был ограничен изображений до глубины 100-200 мкм ткани из-за поглощения возбуждения и выбросов флуоресценции вышележащих тканей ¹³ . Хотя Очистка ткани и 3D гистология широко описаны в литературе и есть множество методов для очистки многих тканей непригодными для использования с тканями в целом, как они необратимо повредить клеточной морфологии через hyperhydration белки или удаление липидов. Таким образом невозможно подтвердить, что эти результаты свидетельствуют о самой ткани и не артефакты из обработки в то время как наши ткани, очистка процесс является обратимым технику, которая сможет проверить против традиционных гистологии. Очистки ткани, как правило, предполагает один из трех основных подходов: 1) единообразные соответствия показателя преломления (RI) ткани компонентов погружение в Ри подходящих решений, который удаляет совокупное рассеяние света вызвало из линзирования благодаря непрерывной колебания низкой ри (цитозоль) и высокой ри (белок/липиды) составляющих; 2) удаление липидных компонентов путем встраивания в гидрогеля и использованием электрофореза/диффузии для удаления компонентов липидов; 3) расширения/денатурации белка структуры разрешить увеличение проникновения растворителей для поощрения единообразия ри ¹³. Хотя эти подходы можно сделать прозрачной ткани и позволяют 3D представление биомаркеров для создаваемого, эти 3D представления имеют сомнительную ценность клинических как это сложно определить, являются ли эти образы свидетельствует о свойства ткани или из ткани, очистка процесса. С другой стороны поскольку наши ткани очистка является обратимым стандарт гистологические и/или иммуногистохимия могут применяться же ткани для оценки ли клинически значимых изменений.

Это исследование содержит анализ 47 дистальной ворсинчатых образцов, полученных из в общей сложности 23 клинически нормальной и ургентного прекращено беременности между 9-23 полных недель гестации и два нормальных родов полный срок. Этикетировочный иммунофлуоресценции трофобласта и endothelia позволило количественные и автоматизированный анализ изменений в ворсинчатых сосудистой сети и их сложности.

С настоящим Протоколом мы изолированы и проанализированы ранее терминал ворсинки и их капиллярной сети в масштабе не представляется возможным. Этот подход, когда применяется к развитию ворсинок и капиллярной сети по всей беременности будет определять те свойства, которые являются основой для рождения здорового ребенка. Когда применяется для исследования сложных беременностей, он также будет уточнить, когда и как плацентарной патологий изменить ворсинчатых деревья и капиллярной сети, которую они оболочка, и как они посягают на благополучие плода.

протокол

Этот протокол следует принципам Нью-Йорк Государственный Институт фундаментальных исследований в Комитет по этике исследований человеческого отклонениями.

1. ворсинчатых дерево рассечение

1. Промойте формалин фиксированной тканей плаценты с отшлифованной фосфат физиологический (PBS)¹⁴ удалить формалином и место в чашке Петри на сцене микроскопом рассечение. Использовать скальпель и тонкой щипцы для дразнить тканей плаценты врозь для обнаружения ворсинчатых деревья (белый нитевидные структуры ветвления: выражение). Вскрыть из кусочков дерева ворсинок (несколько мм) и передачи ткани микро Тюбе содержащие ~ 1 мл PBS.

2. immunofluorescent окрашивание

1. С пипеткой удалите PBS и замените свежим PBS. Пусть стоять 10 мин с случайные закрученной. Повторите еще раз.
   Примечание: Этот шаг и все дальнейшие шаги выполняются при комнатной температуре за исключением основное антитело инкубации.
2. С помощью пипетки, удалить и заменить PBS с PBS + 0,1% тритон-X100 + 2% козьего сыворотки (PBS-T-GS) для разрушения ткани и блока привязки неспецифических вторичных антител. Инкубируйте 30 мин.
3. Заменить PBS-T-GS с PBS, содержащий 2% козьего сыворотки, как мышь моноклонального анти CK7 и кролик анти CK7.
   1. Инкубировать ткани на ночь при 4 ° C.
   2. Удалите оставшиеся антител, мытье с PBS-GS 10 минут с случайные закрученной.
   3. PBS-ОО удалить и заменить с PBS-GS, содержащие оба коза анти мыши IgG в сочетании с зеленого излучающих (520 Нм) Флюорофор и коза анти кролик IgG в сочетании инфракрасным испуская (652 Нм) Флюорофор.
   4. Удаление антитела, повторив шаг 2.1.
   5. Магазин ткани полученных при комнатной температуре в темноте.

3. Уточнение ткани

1. Стирать образцы 3 раза с PBS интервалом в 10 минут.
2. Обезвоживания тканей, удалив PBS с пипетки и заменив его с 50% этанола (метанола может также использоваться). Инкубируйте на 10 мин заменить свежим 50% этанола и инкубировать на 10 мин повторить это еще раз в общей сложности 3 инкубаций. Повторите инкубаций с 70%. Затем замените 100% этанола и Инкубируйте 15 минут (в качестве альтернативы может использоваться метанол).
3. С острым концом щипцами, передачи ткани свежий содержащие микро трубка ~ 1 мл раствора-1 за 4 ч.
4. С острым концом щипцами, передачи ткани свежий микро Тюбе содержащие решение-2 ~ 4 h.
   Примечание: При хранении в темноте, иммунофлюоресценции при комнатной температуре по крайней мере 6 месяцев.
5. Не следует смешивать с любой водный раствор (например , средний монтажа) как расчистка будет потерян.

4. Монтаж для микроскопии

1. Не монтировать ткани между слайд стандартного стекла и coverslip, как ткани, мягкие и легко деформируется.
2. Обратитесь к рис. 5B и монтировать ткани в камере Сайкс-Мур следующим образом;
   1. С острым концом щипцами место 25-мм круглые coverslip в камере базы.
   2. С острым концом щипцами место резиновую прокладку на базе на coverslip.
   3. С пипеткой место падение (~ 40 мкл) решение-2 в самом центре coverslip.
   4. С острым концом щипцами передачи кусок ткани от решения-2 капли в центре coverslip.
   5. Место второй coverslip верхней прокладки.
   6. Проденьте фиксирующее кольцо в верхней части базы, сжатие coverslips и прокладка до фирмы.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы не слишком сильно затягивать или coverslip будет разрушить.
   7. Вставьте иглу 22-го калибра в порт на базе и через прокладку.
   8. Заполните шприц 3 мл с ~ 1,5 мл раствора-2.
   9. Смонтируйте 25-калибруйте иглу на шприц.
   10. Вставьте иглу шприца в противоположном порт и через прокладку.
   11. Убедитесь, что воздух в камере вентиляции через другие 25-манометра, осторожно вводить раствор 2И заполнения камеры.
   12. Извлеките иглу и шприц и поместите камеру на слайде большой стакан на конфокального микроскопа.
3. Кроме того вырежьте пользовательские скважин из PDMS силиконовые листы.
   1. С ножницами вырезать 25,4 × 25,4 мм² кусок от PDMS листа.
   2. С помощью скальпеля вырезать ~ 12,7 × 12,7 мм² хорошо в кусок.
   3. Нажмите кусок твердо на слайд микроскопа.
   4. Заполните колодец на вершину с решения-2.
   5. Передача кусок ткани из микро трубки к центру скважины.
   6. С острым концом щипцами место coverslip на вершине хорошо, таким образом, что в нижней части coverslip увлажненный с решения-2.
   7. Смонтируйте Сайкс Мур палата Ассамблеи с ткани на конфокального микроскопа.

5. конфокальная микроскопия

1. Принесите ткани в камере в фокус с 10-кратным объективом.
2. Вверх и вниз переместите микроскопа через фокальной плоскости, чтобы измерить расстояние между верхней и нижней ткани.
3. Переместите сцену в 2,5 мкм шаги для сбора конфокальное изображение файл, содержащий набор изображений через ткани сверху донизу.

6. обращение вспять очистки

1. Вспять очистки путем передачи ткани содержащие микро трубки > 20 x объем 100% этанола. В 1 ч интервалы заменить этанол 70%, а затем 50% этанола и, наконец, PBS. Хранить при 4 ° C в темноте.
   Примечание: Теперь процесс ткани для встраивания Стандартный парафин, резания и гистологические или иммуно гистохимические пятнать.

7. Обратная свёртка

Примечание: Для следующих шагов, программного обеспечения команд, вкладок и раскрывающиеся меню выделены курсивом.

1. Запустите программное обеспечение деконволюция и откройте файл изображения.
2. Введите параметры, перечисленные в окне «Саммарy».
   1. Для 'расстояния введите voxel x, y и z измерения в мкм.
   2. Для каждого цветового канала выберите Люминесцентную краску для иммуноокрашивания из раскрывающегося меню.
   3. Для 'Модальность ', выберите сканирование лазерная конфокальная из раскрывающегося меню.
   4. Для 'линза объектива, выберите 10 x из раскрывающегося меню.
   5. Для 'погружения среднего ', выберите воздуха из раскрывающегося меню.
   6. Нажмите на 'Применить ' кнопку.
3. Нажмите на вкладку «Deconvolution».
4. Нажмите на '3D деконволюция ' в раскрывающемся меню.
5. В '3D - деконволюция ' окна убедиться, что параметры являются: 1) адаптивной ПСФ слепых, 2) теоретических ПСФ, 3) использования (по умолчанию адаптивной ПСФ, 10 итераций, средний шум), 4) база имя.
6. Нажмите на 'зеленую кнопку Check' для запуска программы.
7. Когда закончите, повторите шаги 7.3-7.6 перезапустить программу. После завершения перезагрузки это третий и последний раз.
8. В 'Диспетчер данных ' окно, нажмите на файле с префиксом «10-10 - 10-».
9. Нажмите на 'файл ' вкладку, затем нажмите на 'Сохранить-как.
10. В окне «Сохранить As» выберите '8 разрядное целое число без знака ' с 'тип данных ' раскрывающегося меню и нажмите кнопку Сохранить.

8. обработка изображений

1. Запустите программное обеспечение Фиджи.
   1. Нажмите на 'файл ', нажмите на 'Open' и выберите Deconvolved файл изображения и нажмите на 'Open' кнопку в 'Open' окно.
   2. Нажмите на 'изображение/цвет/разделить каналы и конвертировать трехцветного изображения файл три новых файлов, содержащих только один цвет. Сохраните красный изображения файл, который содержит набор ворсинчатых капиллярного изображений полученных. Удалите файлы изображений зеленого и синего.
   3. Вычесть флуоресценции фон из файла красный изображения с: 'процесс/вычесть фон '.
   4. В раскрывающемся меню Задать радиус мяч прокатки до 10 пикселов.
   5. Не устанавливайте 4 меню и нажмите кнопку 'OK'.
   6. Нажмите кнопку 'Да в меню стека процесса.
   7. Удалить присущие ткани флуоресцирования (аутофлюоресценция), открыв '/Регулировка/яркость-контрастность изображения ' меню и настройки минимум, максимум, яркости и контраста. Будьте осторожны, чтобы не удалить любой из капилляра иммунофлюоресценции.
   8. Свести к минимуму оставшиеся не значения флуоресценции, открыв 'изображение/регулировка/порог ' меню и ползунков, таким образом, что выделена капиллярного иммунофлюоресценции. Проверьте 'темный фон ' поле и нажмите на 'Применить '. На 'преобразовать двоичные раскрывающемся ' меню флажок 'черный фон ' поле и нажмите на 'OK'. Сохраните черно-белое изображение (двоичный) файл для анализа ниже.

9. анализ

1. Объект учета и Skeletonization.
   1. Выберите файл двоичный образ, созданный в шаге 8.1.8.
   2. Нажмите на 'анализ/3D OC вариантов и проверить только 'тома ' и 'хранилище результатов...' коробки в раскрывающемся меню. Убедитесь, что снят флажок «Показать номера» . Нажмите на 'ОК ' кнопку.
   3. CLIck на 'анализа/3D объектов счетчика '. В раскрывающемся меню, установите 'Размер фильтра: мин ' 5000. Убедиться, что «Исключение объектов по краям флажок снят. Проверьте, что ' sобъектСтатистика и 'резюме ' установлены флажки. Нажмите на 'ОК ' кнопку.
      Примечание: Это может занять несколько минут в зависимости от конфигурации компьютера и размера файла.
   4. Сохраните таблицу статистики и файл сопоставления объектов.
   5. Выберите файл карты объектов. Нажмите на '2D-3D каркас/плагины/Skeletonize ' к Скелетонизация капиллярной сети в двоичном файле. Нажмите на 'файл/сохранить как. Выберите 'Tiff...' в раскрывающемся меню. В окне Сохранить как TIFF окно Добавить «Skel-» имя файла объекта карту и нажмите на 'Сохранить ' кнопку.
   6. Нажмите на 'анализа/скелетон/анализ скелета 2D-3D'. В раскрывающемся меню настроек по умолчанию и нажмите на 'ОК ' кнопку. Сохранить таблицу «информация» филиал ' таблицарезультатов и два выходных файлов (Skel-объекты меченых - скелеты и с тегами скелета).

Результаты

Сгенерированный 3D визуализации капилляров в кластерах терминала ворсинок в плаценте человека от 8 недель гестационного возраста срок доставки были подсчитаны как отдельные кластеры и каркасный для анализа сети. Функциональные единицы плаценты (рис. 1...

Обсуждение

Институциональных Наблюдательный Совет одобрил коллекции плацентарной ворсинчатых тканей формалином фиксации от ургентного прекращено беременностей. Прежде чем были выполнены процедуры, краткий обзор медицинских записей отметил возраст матери, паритета и подтвердила отсутствие л?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer	Macron Fine Chemicals	H-121-08	General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic
Scalpel blades	ThermoFisher Scientific	08-916-5B No. 11
Scalpel	ThermoFisher Scientific	08-913-5
Fine forceps	Electron Microscopy Services	78354-119
Micro Tube (1.7 mL)	PGC Scientifics	505-201
Phosphate buffered saline	Sigma	D8537	PBS
Pipette	VWR	52947-948	disposable, 3ml transfer pipette
Triton X-100	Boehriner Mannheim	789 704	Dilute to 0.1% from stock
Goat Serum	Gibco	16210-064	Dilute to 2% in PBS solution
Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30)	ThermoFisher Scientific	MS-1352-RQ
Rabbit Anti-CD31 antibody	Abcam	ab28364
green emitting (520 nm) fluorochrome	Invitrogen	A11017	Alexa-Fluor 488
infrared emitting (652 nm) fluorochrome	Invitrogen	A21072	Alexa Fluor 633
Ethanol alcohol 200 proof	Pharmco-Aaper	111000200	Dilute down to lower concentrations using PBS as needed
Solution-1	Visikol Inc.		Visikol Histo-1
Solution-2	Visikol Inc.		Visikol Histo-2
Skyes-Moore chambers	BellCo Glass Inc.	P/N 1943-11111
25 gauge needle	ThermoFisher Scientific	14-826AA	BD Precision Glide Needes
3 mL syringe	ThermoFisher Scientific	14-823-40	BD disposable syringe
PDMS silicon sheets	McMaster-Carr	P/N 578T31
confocal microscope	Nikon Inc.		Nikon C1 Confocal Microscope
Deconvolution software	Media Cybernetics		AutoQuant X22
Fiji image processing software			free, Open source  software available at https://fiji.sc
Hematoxylin	Leica Biosystems	3801570	Component 1 of SelecTech H&E staining system
Alcoholic Eosin	Leica Biosystems	3801615	Component 2 of SelecTech H&E staining system
Blue Buffer	Leica Biosystems	3802918	Component 3 of SelecTech H&E staining system
Aqua Define MCX	Leica Biosystems	3803598	Component 4 of SelecTech H&E staining system
Immunohistochemistry detection system	ThermoFisher Scientific	TL-125-QHD	UltraVision Quanto Detection System HRP DAB