L'assorbimento del metallo essenziale nei batteri gram-negativi: fluorescenza, radioisotopi, a raggi x e delle cellule di frazionamento

Riepilogo

Un protocollo per l'estrazione di un chaperone periplasmico metalli di transizione nel contesto dei suoi partner di associazione nativo e caratterizzazione biofisica dei suoi contenuti di substrato di raggi x di fluorescenza e radiometal l'assorbimento è presentato.

Abstract

Dimostriamo un metodo scalabile per la separazione del Periplasma batterica dal citoplasma. Questo metodo viene utilizzato per purificare la proteina periplasmica ai fini della caratterizzazione biofisica e trasferimento del substrato di misura tra compartimenti periplasmico e citoplasmatici. Limitando con attenzione nel momento in cui il Periplasma è separato dal citoplasma, lo sperimentatore può estrarre la proteina di interesse e ogni scomparto individualmente per il substrato senza contaminazione di riporto tra i compartimenti di analisi. La proteina estratta dal frazionamento possa poi essere ulteriormente analizzata per determinazione della struttura tridimensionale o profili di grippaggio del substrato. In alternativa, questo metodo può essere eseguito dopo incubazione con un radiotraccitore per determinare l'assorbimento percentuale totale, come pure la distribuzione dell'elemento tracciante (e quindi in metallo trasporto) attraverso diversi compartimenti batteriche. Sperimentazione con un radiotraccitore può aiutare a distinguere tra un substrato fisiologico e substrato artefactual, come quelle causate da mismetallation.

Fluorescenza a raggi x può essere utilizzato per scoprire la presenza o l'assenza di metallo incorporazione in un campione, come pure di misurare le variazioni che possono verificarsi in metallo incorporazione come prodotto di condizioni di crescita, condizioni di purificazione, e/o condizioni di cristallizzazione. Fluorescenza a raggi x fornisce anche una misura relativa di abbondanza per ogni metallo, che può essere utilizzato per determinare il picco di assorbimento di energia metallo migliore da utilizzare per la raccolta di dati anomalo x-ray scattering. L'assorbimento radiometal utilizzabile come metodo per convalidare la natura fisiologica di un substrato individuato dalla fluorescenza di raggi x, così come la scoperta di nuovi substrati di supporto.

Introduzione

Nei batteri gram negativi, piscine citoplasmatiche degli atomi di metalli di transizione sono aumentate e rifornite gli importatori (cassetta ATP-binding) di membrana interna ABC che attenuano metallo traslocazione attraverso la membrana interna. Periplasmica proteine che legano il substrato a-1 Cluster (SBPs) compongono un gruppo di accompagnatori che legano gli atomi metallici direttamente e li traghetto attraverso il Periplasma di consegnarli a cognate ABC importatori¹. Altri ammassi di SBPs sono dedicati al trasporto di substrati, quali metallo chelato (Cluster A-2), carboidrati (cluster B e D-1) e gli aminoacidi (cluster B, C, F-2 e F-4); Tuttavia, indipendentemente dal substrato, SBPs seguire un evolutivamente conservata c-morsetto piega². Il meccanismo proposto generalizzato per trasferimento substrato SBP comprende la c-clamp subendo una serie di contorsioni che assomigliano a una pianta carnivora³. In genere, Cluster a-1 SBPs purificare in una forma di holo (metallo-bound), anche se studio di questi SBPs è limitata dalla difficoltà nella generazione di apo (senza metallo) forme di proteina per sperimentazione⁴. Ad oggi, strategie per studiare apo Cluster SBPs a-1 sono stati limitati a mutagenesi, dialisi e parziale denaturazione con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) acido chelante^{5,6,7,8 , 9 , 10 , 11}. dati strutturali che proviene da questi esperimenti suggeriscono che Cluster a-1 SBPs non può seguire con precisione il meccanismo di Venere acchiappamosche. Attualmente manca dalla letteratura è un metodo di produzione di apo a-1 SBPs Cluster in vivo utilizzando partner di legame fisiologico.

Dimostriamo per la prima volta utilizzando il frazionamento delle cellule per purificare YfeA, un Cluster a-1 SBP da Yersinia pestis, agente eziologico della peste, che è stato convertito in forma apo attraverso l'interazione con suo fisiologico importatore YfeBCDE ABC cognate nella cella. Indichiamo che YfeA è nel modulo apo di spettroscopia a raggi x in dispersione di energia (EDS), anche conosciuto come fluorescenza a raggi x. Inoltre dimostriamo di YfeBCDE funzionalità combinando il frazionamento delle cellule con gli studi di assorbimento del metallo radioattivo altamente sensibile per distinguere tra l'assorbimento del metallo attraverso la membrana esterna e metallo importazione attraverso la membrana interna. L'uso di un tracciante radioattivo consente il rilevamento della quantità di pg/L di metalli, molto inferiore al limite di rilevazione per tali tecniche ad accoppiamento induttivo come spettrometria di massa al plasma (ICP-MS) o spettroscopia di assorbimento atomico (AAS). Questo consente per la minima perturbazione del sistema oggetto di studio. Inoltre, i tradizionali metodi elencati spesso richiedono grandi volumi di campione, post-elaborazione aggiuntiva e più lunghi tempi di ritorno, che non sono tipici per radiotraccitore saggi. Così, usando un radiotraccitore fornisce un metodo pratico e semplice per il monitoraggio distribuzione del metallo e l'assorbimento all'interno di una cella. Rimane essere determinata se un apo a-1 SBP Cluster prodotta utilizzando questo metodo echo le osservazioni strutturali alla pratica corrente usata per generare la proteina apo.

Il frazionamento delle cellule è un metodo consolidato per la separazione dei compartimenti cellulari per lo scopo implicito di probing specificamente loro contenuto in isolamento¹². Il frazionamento delle cellule è comunemente usato per confermare la posizione di una molecola durante il ciclo cellulare o misurare l'attività di un particolare comparto¹³. Ad esempio, attività di trasporto del metallo può essere analizzata tramite sondaggio compartimenti cellulari per substrato metallico. L'integrazione di frazionamento cellulare consente la distinzione e confronto tra l'assorbimento del metallo attraverso la membrana esterna e trasferimento del metallo attraverso la membrana interna. Questi processi quindi possono a sua volta essere misurati nel tempo. Nel caso di purificazione della proteina, i metodi più comuni di lisi cellulare e separazione di componenti solubili da componenti insolubili sono rottura meccanica (cioè, macinazione, miscelazione), omogeneizzazione ad alta pressione (cioè, pressione francese cell press, cella un distruttore) e frequenze ultrasoniche (cioè., sonicazione)¹⁴. Uso di frequenze ultrasoniche per lisare cellule è generalmente più adatti per piccoli volumi; Tuttavia, la sonicazione è conosciuto per generare calore eccessivo che può denaturare la proteina. Per evitare di generare calore eccessivo, frequenze ultrasoniche sono solitamente applicate in sequenziale brevi raffiche, che possono richiedere molto tempo e inavvertitamente degradano molecole di DNA in frammenti più piccoli. Inoltre, più costosi sonicazione sonde possono essere richiesti per gli esperimenti di analitici e preparativi, come ogni sonda ha una gamma limitata per il volume di campione che può essere elaborato. Uso di alta pressione a lisare cellule evita generando calore eccessivo durante la lisi cellulare di refrigerazione componenti di stampa delle cellule di pressione francese prima della lisi o un disgregatore cella in un ambiente freddo come una cella frigorifera di funzionamento. Come sonde di sonicazione, potrebbero essere necessario essere acquistati per elaborare una vasta gamma di volumi di campione più insiemi di componenti di stampa di pressione francese delle cellule. Pressione francese cella stampa assembly sono facili da collegare ma scomodo da usare e pulire, può essere pesante da spostare e sono incline a intasamento da campioni di densi. Vantaggi di utilizzare frequenze ultrasoniche e sistemi ad alta pressione per lisare cellule comprendono campione alto recupero, capacità di elaborare campioni multipli con minima contaminazione incrociata, e forza di taglio regolabile, che può essere adattato per l'ottimizzazione di lisi di una vasta gamma di tipi di campioni. Ottimizzazione può verificarsi regolando la frequenza ultrasonica, durata di fiammate, pistone pressione libbre per pollice quadrato (psi) e il numero di passaggi attraverso la stampa. Uso di rottura meccanica a lisare cellule può essere la strategia tecnicamente più banale e meno costoso per lisi cellulare. Rottura meccanica può presentare particolari difficoltà nel recupero del campione e non è l'ideale per trattare più campioni. Rottura meccanica è più delicata ai campioni di alta pressione o frequenze ultrasoniche, ma non è elevato throughput ed è incline alla lisi inefficiente. Una significativa limitazione sperimentale di rottura meccanica, omogeneizzazione ad alta pressione e frequenze ultrasoniche, è la rottura incontrollabile dell'intera architettura cellulare tale che dopo lisi, tutti i componenti cellulari acquose sono mescolati insieme. Inoltre, tutti i compartimenti cellulari non perturbino allo stesso tempo; Pertanto, contenuto di compartimenti che lyse presto può essere soggetto a forze dirompenti in corso più di contenuto dei compartimenti che lyse tardi. Frazionamento cellulare permette poco costoso, tecnicamente semplice, efficiente basata su vano separazione del contenuto della cella, evitando la necessità di attrezzature costose e l'esposizione del campione a forze dure, dirompente.

Nel caso la SBP, importato substrato viene reintrodotto a potenzialmente apo proteina e proteina holo si rigenera durante la lisi, prima della cromatografia a valle o altre tecniche di purificazione. L'inclusione di chelante EDTA durante Lisi presenta un ulteriore ostacolo, dove affinità di metallo come un primo passo di purificazione della proteina non è possibile perché EDTA sarà striscia di metallo dalla resina di cromatografia e prevenire¹⁵di legame alle proteine. Una soluzione semplice ed economica è il frazionamento delle cellule da shock osmotico, dove centrifugazione differenziale e reagenti di laboratorio comuni permettono al ricercatore di estrarre delicatamente sufficienti proteine per l'analisi funzionale. Frazionamento di shock osmotico utilizza un cambiamento in due fasi di pressione osmotica per separare i compartimenti cellulari. In primo luogo, un buffer ipertonico induce le cellule a crenato come acqua lascia ogni cella e in secondo luogo, un buffer ipotonico induce le cellule a gonfiarsi come acqua ri-entra ogni cella. Controllando attentamente quanto tempo le cellule si gonfiano, le membrane esterne possono essere selettivamente lisate (a causa di accumulo di pressione osmotica dall'acqua in ingresso), così lo svuotamento loro contenuto nel buffer. Conservazione delle membrane interne garantisce che il contenuto citoplasmatico vengono mantenuto in Sferoplasti e è facilmente separato dalla periplasmico contenuto mediante centrifugazione.

YfeA è un polispecifico SBP in grado di legare il ferro, manganese e zinco atomi¹⁶. Le proporzioni relative di metallo incorporato può essere modificato secondo il completamento del metallo durante la crescita e analizzata mediante fluorescenza a raggi x come è disponibile presso Advanced Photon fonte^{16 di Argonne National Laboratory}. Fluorescenza a raggi x permette al ricercatore di profile rapidamente una vasta assemblea di metalli senza la necessità di grandi dimensioni o cristalli di qualità di diffrazione e può anche ricavare dati dalla soluzione del precipitato o proteinico della proteina.

Fluorescenza a raggi x può rapidamente rivelare risultati imprevisti come, in questo caso, il substrato primario di YfeA essere zinco e non documentata substrati fisiologici ferro o manganese¹⁶. Se usato prima di raccogliere dati di scattering di raggi x, fluorescenza a raggi x è in grado di informare lo sperimentatore nel disegno sperimentale, ad esempio quali energia metallo gli spigoli per utilizzare per la raccolta di dati anomalo x-ray scattering. Altrettanto utili come determinare l'abbondanza relativa di un metallo, fluorescenza a raggi x può anche determinare se un metallo è assente in un campione, fornendo un rapido metodo di separazione cristalli che contengono la proteina apo da proteina holo e stima in metallo potenza del segnale senza la necessità di elaborazione dei dati richiede molto tempo. All'identificazione di un campione con un forte segnale di metallo, la lunghezza d'onda precisa da utilizzare per la raccolta di dati anomalo x-ray scattering può essere determinata dall'esplorazione di dispersione anomala di multiplo-lunghezza d'onda (MAD).

Questo protocollo dettagliato è destinato per aiutare gli sperimentatori di nuovi correttamente eseguire il frazionamento delle cellule e rendere l'utilizzo efficace di sincrotrone beamline hardware di profilo contenuto totale di metallo e lo studio delle proteine metallo-leganti.

Protocollo

1. coltura Starter batterica (giorno 1)

1. In un pallone smussato 200 mL, 30 mL di brodo di Luria Bertani (LB) con Escherichia coli ceppo BL21-CodonPlus (DE3) di inoculare-RIPL cellule contenenti pYFE3 plasmide¹⁶.
2. Aggiungere 30 µ l di ampicillina 50 mg/mL nel matraccio aspirando con una pipetta e 200 µ l tip. Agitare durante la notte a 225 giri/min a 37 ˚ c.

2. completato M9 Media minima preparazione (giorno 2)

Nota: Questo è adattato dal Amresco manuale.

1. Preparare 6 L di liquidi tramite la procedura seguente. In un pallone da 2 L smussato, aggiungere 10,5 g di media minimi M9 a 1 L di ultra-puro di H₂O. Autoclave a 121 ° c per 20 min e poi raffreddare a temperatura ambiente.
2. Aggiungere asetticamente le seguenti soluzioni sterili supplemento: 1 mL/L di ampicillina 50 mg/mL, 10 mL/L di glucosio di 20% w/v, 0,1 mL/L di 1 M CaCl₂e 2 mL/L di 1 M MgSO₄. Eseguire questo passaggio in un armadietto per mantenere un ambiente sterile di sicurezza biologica. Scaldare i media a 37 ˚ c.

3. batterica sottocultura

1. Aggiungere 5 mL/L di pernottamento coltura starter media minimi M9 aspirando con una punta di pipetta e 5 mL automatizzata. Scuotere la sottocultura continuamente a 225 giri/min a 37 ˚ c per 9 h.
   Nota: Durante questa fase YfeABCDE overexpressed di autoinduzione dal suo nativo promotore di Y. pestis .
2. Recuperare le cellule mediante centrifugazione a 4.500 x g per 30 min a 4 ° c. Risospendere le cellule in 50 mL di una soluzione di tampone fosfato ghiacciata (20mm Na₂HPO₄ pH 7,6, 50 mM NaCl) aspirando con una pipetta e la punta di 1 mL e congelare tutta la notte a-80 ° c.

4. cellula frazionamento (giorno 3)

1. Scongelare la risospensione alle cellule di 4 ° C e pellet a 4.000 x g per 20 min a 4 ° c. Risospendere le cellule in 50 mL di ghiacciata alta tampone salino (200 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM NaCl e 2 mM EDTA) aspirando con una punta di pipetta e 25 mL automatizzata. Incubare la sospensione sopra il ghiaccio per 20 min, con occasionali inversione per la miscelazione.
2. Agglomerare le cellule a 4.500 x g per 20 min a 4 ° c. Risospendere le cellule in 50 mL di tampone salino basso ghiacciata (10 mM Tris-HCl a pH 8.0) aspirando con una punta di pipetta e 25 mL automatizzata. Incubare la sospensione sopra il ghiaccio per 20 min, con occasionali inversione per la miscelazione.
3. A pellet Sferoplasti a 4.500 x g per 20 min a 4 ° c. Recuperare il surnatante contenente Periplasma. Risospendere i pellettato Sferoplasti in soluzione salina tamponata con fosfato (punto 3.2) aspirando con una punta di pipetta e 25 mL automatizzata e lisare cellule da tre cicli di pressione francese cella premere a 1500 psi.
   Nota: Una pressa di cella di pressione francese può essere scomoda per operare e utilizza una pompa idraulica per guidare la lisi cellulare. Usare cautela quando si innesta la pompa idraulica, assicurando il corretto allineamento del pistone con la stampa e mantenendo le mani libere della pompa idraulica.
4. Pellet di detriti cellulari a 50.000 x g per 20 min a 4 ° c. Recuperare il surnatante contenente citoplasma. Se necessario, le membrane esterne ed interne possono essere ulteriormente frazionato¹⁶.

5. proteina purificazione usando FPLC

1. Immediatamente dopo il frazionamento, filtrare la frazione periplasmica utilizzando un'unità di membrana da 0,45 µm. Utilizzare un filtro per siringa Luer lock per la facilità e filtrazione rapida. Equilibrare una colonna di scambio anionico 5ml Q utilizzando 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 0,05% w/v NaN₃ caricamento buffer a una portata di 5 mL/min.
2. Caricare il filtrato periplasmico sulla colonna di scambio anionico pre-equilibrato 5ml Q utilizzando 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 0,05% w/v NaN₃ caricamento buffer a una portata di 2 mL/min continua a lavare la colonna di scambio 5ml Q anione utilizzando 20 millimetri Tris pH 7,6 , buffer di 0,05% w/v NaN₃ caricamento fino ad ottenere una lettura della linea di base di A280 a una portata di 5 mL/min.
3. Eluire la proteina associata utilizzando 20 millimetri Tris pH 7,6, 0,05% w/v NaN₃, 0 - 1 M NaCl di volumi di colonna oltre 10 gradienti lineari a una portata di 5 mL/min Combine frazioni contenenti un picco di₂₈₀ . APO YfeA eluisce tra 200 mM NaCl e 300 mM NaCl.
4. Concentrare l'eluato di concentratore centrifugo fino a quando il volume raggiunge ~ 5 mL.
5. Equilibrare una colonna di filtrazione del gel di Superdex 200 pg con 20 mM Bis-Tris-HCl pH 6.3, 50 mM NaCl, buffer di 0,05% w/v NaN₃ gel filtrazione a una portata di 2,5 mL/min.
6. Carico l'anione concentrato scambiare eluato sulla colonna di filtrazione del gel Superdex 200 pg pre-equilibrato e purificare utilizzando il buffer di gel filtrazione da 5.5 di passaggio a una portata di 2,5 mL/min. unire le frazioni contenenti un picco di₂₈₀ corrispondente a un ~ 30 proteina kilodalton (kDa).
   Nota: Il riferimento riportato di seguito è un esempio di esperimento FPLC per dimostrare il protocollo¹⁷.

6. proteina cristallizzazione

1. Concentrare l'eluato di gel filtrazione di concentratore centrifugo ad una concentrazione finale di proteine di 22 mg/mL.
   1. Calcolare la concentrazione nella proteina dividendo A₂₈₀ lettura da 1,276 mg/mL. Questo coefficiente di estinzione teorica è stata prevista da ExPASY ProtParam¹⁸.
      Nota: Un'una₂₈₀ esempio lettura di 5.104 AU corrisponde ad una soluzione di 4,000 mg/mL; 5.104 AU ÷ 1,276 mg / mL = 4,00 mg / mL.
2. Mix 1,5 µ l di proteina con 1,5 µ l di 30% w/v PEG 4000, 50 mM NaCl, 20 mM Bis-Tris-HCl pH 6.3, 0,05% w/v NaN₃ in seduta goccia o appendere goccia installazione aspirando con una pipetta e 10 µ l tip.
3. Incubare gocce di cristallizzazione a 293 K per 2-4 settimane.
4. Flash-congelare cristalli nel pool di azoto liquido per la spedizione per il sincrotrone.

7. fluorescenza x (utilizzando Software Beamline GM/CA)

1. Passare alla scheda Hutch uso della sottovoce energia impostare energia a 10.0 keV.
2. Passare alla scheda Scan Navigate al campione di Monte Tab. Interactive .
3. Selezionare il segnale di fluorescenza Optimize. Ingresso 4,00 s nel sottotitolo del tempo . Selezionare prendere spettro di fluorescenza. Mostra lo spettro mediante scheda trama .

8. MAD scansione per picco di assorbimento di energia metallo (utilizzando Software Beamline GM/CA)

1. Spostare il campione fuori fascio. Passare alla scheda Scan Navigate alla scheda tavola periodica Selezionare il K-bordo dell'elemento di interesse.
   Nota: Il valore di energia in energia sottovoce è in eV.
2. Passare alla scheda Hutch uso della sottovoce di energia per impostare energia valore passo 8.1 in keV.
3. Spostare il campione il fascio di luce. Passare alla scheda Scan Navigate alla scheda Auto ingresso 2,00 s nel sottotitolo del tempo .
4. Selezionare Start Scan. Mostra la scansione di MAD utilizzando la scheda trama .
   Nota: Il valore di energia nella sottovoce picco è in eV anziché keV.
5. Selezionare fatto con fluorescenza.
6. Spostare il campione rispetto al fascio. Passare alla scheda Hutch uso della sottovoce di energia per impostare energia valore al passo 8.4 arrotondata fino alla prossima eV (cioè, picco: 9658,3 eV, impostare energia 9659 eV).
7. Spostare il campione il fascio di luce. Raccogliere il set di dati. Ripetere il passaggio 8.1-8.6 per tutti i metalli di interesse.

9. analisi protocollo per analisi di assorbimento del metallo radioattivo

1. In un tubo di cultura 14ml, inoculare 5 mL di LB con ceppo di e. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL cellule contenenti pYFE3 plasmide¹⁶. Aggiungere 5 µ l di ampicillina 50 mg/mL aspirando con una pipetta e 10 µ l tip. Agitare a 225 giri/min a 37 ˚ c per 7 h.
2. Agglomerare le cellule a 15.000 x g per 1 min a temperatura ambiente utilizzando una centrifuga da tavolo. Lavare le cellule in 1 mL di completati media minimi M9 aspirando con una punta di pipetta e 1 mL. Ripetere una volta.
3. In una provetta conica da 50 mL, cellule di sottocultura in 30 mL completati media minimi M9 aspirando con una punta di pipetta e 1 mL. Agitare a 225 giri/min a 37 ˚ c per 9 h.
4. Determinare la quantità di radioattività necessaria per raggiungere circa 100.000 conteggi al minuto (cpm).
   Nota: Questo può variare a seconda dello strumento utilizzato per il rilevamento e del radioisotopo. Ad esempio, un campione contenente kilobecquerel 7,4 (kBq) (0,2 microcurie (µ ci)) di ⁵²Mn dà una lettura di 550.000 cpm su un rilevatore gamma automatizzato (NaI). Così, la quantità di radioattività necessaria per ottenere un conteggio di 100.000 cpm può essere determinata utilizzando la seguente equazione: (100.000 cpm/550.000 cpm) * 7.4 kBq (0,2 µ ci) = 1,35 kBq (0,036 µ ci).
   Attenzione: decadimento radioattivo provoca il rilascio di radiazioni ionizzanti, che è pericoloso. Quando si lavora con radioattività sempre utilizzare la schermatura appropriata e seguire i principi di come basso come ragionevolmente conseguibile (ALARA) aumentando la distanza e schermatura, riducendo il tempo di esposizione. Solo personale addestrato dovrebbe maneggiare radioattività in laboratori appositamente designati, che sono concessi in licenza per l'uso di materiali radioattivi.
5. Moltiplicare la radioattività richiesta calcolata nella fase 9.4 dal volume totale della sottocultura, per determinare la quantità totale di radioattività necessaria. Aggiungere questo importo (preferibilmente in un piccolo volume di 50-100 µ l) nella provetta contenente la sottocultura affinché ci sono 100.000 cpm/mL e agitare bene per 30 s.
   Nota: Per 31 mL di sottocultura, la quantità totale di radioattività necessaria è 1,35 kBq (0,036 µ ci) x 31 mL = 41,3 kBq (1.12 µ ci).
6. Tubi di aliquota 1 mL della subcoltura (ora contenente il tracciante radioattivo) nella centrifuga individuali 1,5 mL aspirando con una punta di pipetta e 1 mL e posto in un thermomixer 37, con vortex a 1 × g. Includi abbastanza tubi in modo che ci siano tre replica per ciascuna desiderato di misurazione, nonché tre repliche aggiuntive da utilizzare come standard (mettere da parte gli standard, non eseguire il dosaggio di frazionamento sugli standard).
   Nota: Diluire a 1, 2 e 4 h richiederebbe 12 tubi totale.
7. Dopo l'incubazione, centrifugare le provette a 15.000 × g per 30 s utilizzando una centrifuga da banco (preferibilmente raffreddata a 4 ° c) ed eliminare i sovranatante.
8. Risospendere le cellule in 1 mL di ghiaccio freddo, sale alto buffer (punto 4.1) aspirando con una punta di pipetta e 1 mL e mettere immediatamente in ghiaccio per 20 min.
9. Agglomerare le cellule nuovamente a 15.000 × g per 30 s utilizzando una centrifuga da banco (preferibilmente raffreddata a 4 ° c) ed eliminare i sovranatante.
   Nota: Il surnatante contiene metallo libero non associato.
10. Risospendere le cellule in ghiaccio freddo, basso contenuto di sale (passo 4.2) del buffer aspirando con una punta di pipetta e 1 mL e incubare in ghiaccio per 20 min.
    Nota: È importante aspirare delicatamente tramite pipetta per questo passaggio.
11. Agglomerare le cellule a 15.000 × g per 30 s e raccogliere ogni dei surnatanti in nuovo 1,5 mL provette da centrifuga. Ci dovrebbe essere ora sei tubi al punto di tempo.
    Nota: Il surnatante contiene la frazione periplasmico e il pellet contiene la membranosa e frazione citoplasmatica. Ci riferiamo al pellet come la frazione citoplasmatica.
12. Misurare la radioattività in ogni frazione (sei tubi al punto di tempo), così come delle norme accantonato nel passaggio 9,6. Utilizzare la quantità di radioattività nelle norme per determinare la quantità totale di radioattività originariamente aggiunto ad ogni campione.
13. Per determinare la percentuale di assorbimento radioattivo nel Periplasma, utilizzare la seguente equazione: (cpm medio di cpm periplasmico frazione/media degli standard) x 100.
14. Per determinare la percentuale di assorbimento radioattivo nel citoplasma, utilizzare la seguente equazione: (cpm medio di cpm media/frazione citoplasmatica degli standard) x 100.
15. Per determinare l'assorbimento totale %, utilizzare la seguente equazione: ((cpm medio della frazione periplasmico + cpm medio della corrispondente frazione citoplasmatica) / (media cpm degli standard)) x 100.

Risultati

Gel di SDS-PAGE e cromatogrammi di gel filtrazione sono stati raccolti per valutare la qualità di purificazione della proteina dal frazionamento Periplasma preparativa. La purificazione di holo che yfea è stato precedentemente descritto¹⁶; Tuttavia, la purificazione del apo YfeA non è stata segnalata. La strategia per purificare apo YfeA descritto da questo metodo utilizza un costrutto di ricombinanti wild-type che non contiene un tag di affinità di qualsiasi tipo, in particolare uno che potrebbe essere utilizzato per proteina immunoblot (cioè, His-tag) e un anticorpo monoclonale che riconosce che YfeA non è stato descritto. Di conseguenza, analisi di spettrometria di massa è stata utilizzata per verificare la purificazione di YfeA. Per purificare YfeA di frazionamento, è consigliabile usare un gradiente di eluizione lineare per cromatografia a scambio anionico (Figura 1). Il gradiente di eluizione lineare migliora in modo significativo arricchimento di YfeA da che compongono circa l'8% della frazione periplasma al 49% del prodotto di scambio anionico calcolato mediante densitometria (Figura 1). Questa composizione è migliorata al 61% di gel filtrazione, e il volume di eluizione della proteina apo è identico per il volume di eluizione della proteina holo (Figura 2). Analisi di spettrometria di massa verifica la purificazione di YfeA attraverso il 92,5% di sequenza dell'amminoacido di YfeA, 246 totale YfeA polipeptide spettri, 24 unici peptidi e 50 spettri di polipeptide unico. In alternativa, per contrastare il prodotto gradiente lineare con il prodotto da un'eluizione di pendenza di passaggio, YfeA è stato purificato mediante scambio anionico utilizzando un passaggio di lavaggio di 50 mM NaCl seguita da un passo di eluizione di 250 mM NaCl (Figura 1). Il gradiente di passaggio arricchisce marginalmente YfeA dalla composizione di 17% della frazione periplasma al 18% del prodotto di scambio anionico calcolato mediante densitometria. L'eluizione di pendenza passo arricchisce anche una banda di contaminante della proteina quella spettrometria di massa identificata come contenenti più Escherichia coli SBPs di simile peso molecolare. A causa dei limiti di risoluzione del HiLoad 26/600 Superdex 200 pg, somiglianza con i pesi molecolari e le strutture di SBPs contaminanti, gel filtrazione marginalmente migliorato YfeA arricchimento al 20% del prodotto gel filtrazione. Dovrebbe un gradiente di eluizione lineare essere irraggiungibile per scambio anionico, si consiglia di esplorare diversi lavaggi di passaggio in incrementi di 25-50 mM NaCl per identificare la concentrazione di NaCl necessari per rimuovere questi contaminanti.

Holo e purificata apo YfeA cristallizzare nelle stesse condizioni di cristallizzazione, anche se immagini di apo e holo morfologie di cristallo di YfeA mostrano differenze nella crescita dei cristalli apo e holo YfeA stati (Figura 3). Oltre alla verifica di spettrometria di massa, i dati di diffrazione di raggi x (non mostrati) raccolti da cristalli sviluppati dalla proteina purificata da questo metodo confermano la purificazione e cristallizzazione di YfeA. L'entità della contaminazione vano (citoplasmatico zinco ripristino apo a holo proteina nella frazione Periplasma) può essere valutato mediante l'acquisizione di spettri di fluorescenza di raggi x (Figura 4). Dato che lo zinco è il substrato primario associato a ricombinante YfeA¹⁶, spettri di fluorescenza di raggi x rapidamente possono differenziare fra un campione di YfeA contenente un segnale di forte zinco commisurato holo YfeA (Figura 4A), indicativo di croce contaminazione, o un segnale debole zinco indicativo di apo YfeA e minima contaminazione trasversale (Figura 4B). ICP-MS analisi dei media minimi M9 ha confermato i livelli di metalli di transizione sono nella gamma micromolar-sub (non mostrata); Pertanto, rilevamento di solo minime quantità di metalli di transizione dovrebbe essere previsto dopo un frazionamento di successo. Frazionamento analitica (Figura 5) può essere utilizzato per misurare i tassi di trasporto radiometal e acquisire dati funzionali. 60 minuti snapshot confronto tra frazioni periplasmica e citoplasmatiche delle cellule di e. coli che esprimono YfeA unica, il trasportatore di YfeABCDE completo e nessuno dei componenti del YfeABCDE rivela le conseguenze di esprimere una singola proteina ricombinante o una proteina complessa sull'assorbimento del metallo (Figura 6). Le cellule di e. coli che esprimono nessuna proteina ricombinante trasportati circa metà del ⁵²Mn aggiunto ai media nel citoplasma con ritenzione minima nel Periplasma. Questo controllo negativo rappresenta trasporto endogeno del manganese. Le cellule di e. coli che esprimono ricombinante YfeA trasportato circa un quarto del ⁵²Mn aggiunto ai media nel citoplasma con un altro quarto mantenuto nel Periplasma. Ritenzione di manganese nel Periplasma e trasporto limitato nel citoplasma dimostra la richiesta metabolica e il collo di bottiglia imposto con la produzione di YfeA in assenza del trasportatore Yfe. Le cellule di e. coli che esprimono ricombinante YfeABCDE transporter trasportato quasi il 100% del ⁵²Mn aggiunto ai media nel citoplasma con ritenzione minima nel Periplasma. Trasporto di manganese aumentata nel citoplasma illustra il contributo del trasportatore Yfe nel trasporto di manganese.

Figura 1. Purificazione di YfeA con frazionamento. A. modello ipotetico per Yfe transporter. B. gel di SDS-PAGE di purificazione di YfeA dalla frazione Periplasma, mediante eluizione di pendenza lineare da scambio anionico. Gel di SDS-PAGE mostra l'arricchimento di YfeA (30 kDa) nei vari passaggi di purificazione. Freccia nera denota la posizione di migrazione elettroforetica per YfeA. Standard di peso molecolare sulla destra. (1) frazione Periplasma. (2) flusso di colonna anione exchange Q attraverso. (3) eluizione di Q anione cambio colonna picco. (4) picco di superdex 200 pg gel filtrazione colonna. C. YfeA arricchimento – buon esempio. Elaborazione di immagini del gel di SDS-PAGE da B calcola arricchimento globale di YfeA da densitometria ad aumentare dall'8% della frazione periplasmica al 61% del prodotto gel filtrazione. Scatole blu indicano il segnale di YfeA/totale utilizzato per i calcoli di densitometria. Analisi di spettrometria di massa della band "in box" in corsia 4 rilevato 259/280 YfeA amino acidi, presentati in luce verde. Amminoacidi presenti nel polipeptide maturo sono rappresentati in grassetto maiuscolo nero, e gli aminoacidi che compongono il peptide segnale spaccati sono rappresentati in corsivo minuscolo di grigio. D. YfeA arricchimento - cattivo esempio. SDS-PAGE gel di YfeA purificazione dalla frazione Periplasma, mediante eluizione di pendenza del passaggio da scambio anionico. Gel di SDS-PAGE Mostra arricchimento di YfeA nei vari passaggi di purificazione. Freccia nera denota la posizione di migrazione elettroforetica di contaminante principale proteina avanzata durante la cromatografia a scambio anionico. Standard di peso molecolare sulla destra. (1) picco di superdex 200 pg gel filtrazione colonna. (2) Q anione cambio colonna 250 mM NaCl passo eluizione di pendenza. (3) frazione Periplasma. Elaborazione delle immagini del gel di SDS-PAGE da D calcola marginale generale arricchimento di YfeA da densitometria ad un massimo del 20% del prodotto gel filtrazione. Scatole blu indicano il segnale di YfeA/totale utilizzato per i calcoli di densitometria. Totale analisi di spettrometria della della banda indicata da una freccia nera nella corsia 1 rilevato 26 peptidi unici di LivJ (39 kDa), unici 25 peptidi dell'EfeO (41 kDa) e 17 unici peptidi di LivK (39 kDa). Tutti e tre i contaminanti sono periplasmico Escherichia coli SBPs. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. APO YfeA e holo YfeA gel cromatogrammi filtrazione. Freccia nera indica la posizione del volume vuoto. Picchi di gel filtrazione per apo YfeA (curva nera) e holo YfeA (curva blu) Visualizza le proteine afferma eluire allo stesso volume di eluizione, che indica che apo che yfea purificato dalla frazione Periplasma ha un raggio idrodinamico simile come holo che yfea purificato dal totale contenuto cellulare dopo stampa francese.

Figura 3. APO YfeA e holo YfeA cristallo morfologie. Holo YfeA si cristallizza come un cristallo monolitico, mentre apo YfeA generalmente produce cristalli geminati nelle stesse condizioni di cristallizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. APO YfeA e spettri di fluorescenza di raggi x YfeA holo. A. spettri di fluorescenza di raggi x di holo YfeA che è stato purificato da media minimi M9 con nessuna curva di supplementazione, verde di altri metalli di transizione. Picchi caratteristici sono etichettati per manganese, Ferro e zinco. B. spettri di fluorescenza di raggi x da YfeA campione prodotto nel contesto del YfeBCDE. Picchi caratteristici sono etichettati per manganese, Ferro e zinco. Curva blu. Spettri di fluorescenza di raggi x di YfeA purificato dal contesto di YfeBCDE e successo frazionamento della frazione Periplasma con contaminazione minima di citoplasmici metalli di transizione e/o holo YfeA della proteina. Curva rossa. Spettri di fluorescenza di raggi x di YfeA purificato dal contesto del YfeBCDE con frazionamento infruttuoso da eccessiva Lisi e significativa contaminazione di metalli di transizione citoplasmatiche e/o holo YfeA proteina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Generalizzata del flusso di lavoro per frazionamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nella figura 6. dati di frazionamento l'assorbimento del metallo radioattivo 60 min. Ogni esperimento è stato effettuato tre volte, e barre di errore indicano deviazione standard. Barra rossa. Le cellule di Escherichia coli che non contengono il trasportatore Yfe ~ 50% circa dei ⁵²Mn nel citoplasma di trasporto dopo 60 minuti e mantengono bassi i livelli di periplasmico ⁵²Mn. barra blu. Le cellule di e. coli contenente il trasporto trasportatore Yfe > 90% dei ⁵²Mn nel citoplasma dopo 60 minuti e mantenere bassi i livelli di periplasmico ⁵²Mn. barra verde. Cellule di Escherichia coli che contengono solo YfeA ~ 25% circa del ⁵²Mn nel citoplasma di trasporto e trattengono il ~ 25% dei ⁵²Mn nel Periplasma dopo 60 minuti.

Il radiometal utilizzato in questo lavoro, ⁵²Mn (t_1/2 = 5,59 d), è stato prodotto presso lo stabilimento di ciclotrone UAB (Birmingham, AL) da bombardamento del protone su un bersaglio naturale di Cr e purificato come precedentemente segnalati¹⁹. Attenzione: ⁵²Mn è un emettitore di positroni (β⁺_medio = 242 keV, 29,4%) ed inoltre emette diversi raggi gamma di alta energia ad alta intensità (E_γ = 744,2, 935.5, 1434.0 keV; Io = 90,0%, 94,5%, 100%). Per questi motivi, l'esperimento deve essere eseguito seguendo i principi di protezione di radiazione di ALARA, come descritto sopra. Tutti gli elementi indicati come rifiuti radioattivi devono essere adeguatamente contenuti, chiaramente etichettati e scartati secondo le procedure stabilite.

Discussione

Il frazionamento delle cellule è un utile strumento per sondare in modo specifico il contenuto di un compartimento cellulare e può servire come un utile strumento per l'estrazione di piccole molecole quali atomi del metallo, così come le macromolecole quali proteine. Vale la pena notare quel frazionamento delle cellule non è una tecnica di assoluta e può essere soggetto senza attenzione alla miscelazione/risospensione, temperatura di incubazione e incubazione a errori. Miscelazione incompleta può causare Lisi membranosa minimal e frazionamento così trascurabile, frazionamento a temperatura ambiente possa causare rapida lisi di entrambe le membrane con conseguente contaminazione della frazione periplasmica con contenuto citoplasmatico, e tempi di incubazione prolungato possono anche provocare la lisi eccessiva e quindi contaminazione di frazione. Un ragionevole compromesso per raggiungere lisi della membrana esterna relativamente completi ed efficienti (preservando la membrana interna) è di incubazione di 20 minuti sul ghiaccio nel buffer ipotonico frazionamento. Un'altra considerazione è il metodo di estrazione, dove duro estrazione mediante agitazione o vortice potrebbe compromettere la qualità dell'estratto quali causando l'aggregazione proteica. Si consiglia di mescolare delicatamente come spatola, inversione o ad aspirazione di pipetta per mantenere il materiale di alta qualità per analisi a valle. Purificazione da frazionamento cellulare preparativa può avvenire con efficienze variabili come evidenziato dalla Figura 1. In un esperimento, YfeA ha cominciato come 8% del contenuto periplasmico Estratto (Figura 1), mentre in un altro esperimento, YfeA ha cominciato come 17% del contenuto periplasmico (Figura 1). Queste differenze possono derivare da diversi motivi come condizioni di espressione variabile (aggiunta di EDTA ai media crescita può aumentare l'espressione di geni regolati da meccanismi di fame come regolamento di pelliccia del promotore Yfe), l'uso ripetuto di congelati stock permanente ed errori umani. Invece di regolare i tempi di incubazione, si raccomanda di scalabilità della preparazione. Purificazione dalla frazione Periplasma è consigliabile includere un'eluizione di pendenza lineare dal passaggio cromatografico scambio anionico. Un'eluizione di pendenza di passaggio è una strategia di eluizione gli usi discreti e bruschi cambiamenti nella composizione della fase mobile (cioè., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl, ecc.). Un'eluizione di pendenza lineare è una strategia di eluizione che utilizza il cambiamento graduale in mobile fase composizione (cioè, 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 millimetri di NaCl, ecc.). Una sfumatura di passaggio è utile per la separazione di molecole che hanno diverse affinità per la fase stazionaria e un'eluizione di pendenza lineare è utile per la separazione di molecole che hanno affinità simile per la fase stazionaria. Nel caso di purificazione della proteina con nessun tag di depurazione artificiale (per migliorare l'affinità per la fase stazionaria) da un compartimento cellulare che è ricco di specie di proteina unica, un'eluizione di pendenza lineare è consigliabile separare proteine di noninterest che possono hanno simile affinità per la fase stazionaria come la proteina di interesse. In genere, una resa di 1-2 mg di purificato apo YfeA è prevista da ogni litro di cultura espressione YfeA dalla sua endogeno promotore di Y. pestis .

Fluorescenza a raggi x è una tecnica che permette al ricercatore di rapidamente determinare il contenuto di metallo in un campione e informare lo sperimentatore imprevisto incorporazione di metallo che sarebbe altrimenti sconosciuto. Anche se EDTA è incluso nel buffer di frazionamento ipertonica per rimuovere il metallo liberamente associati o libero, YfeA derivato dalla frazione Periplasma può contenere alcune proteine holo. Dato che il trasporto del metallo è un processo dinamico, forse il contenuto proteico di holo proviene da YfeA che ancora ha donato non suo carico al YfeBCDE. Vale la pena notare che fluorescenza a raggi x solo misura il contenuto totale di metallo e non indica se il metallo è ordinato in un reticolo cristallino, o specificamente legato ad una proteina. Per determinare se metallo è ordinato in un reticolo cristallino e/o specificamente legato a una molecola di proteina, x-ray scattering dati raccolta e trattamento è richiesto. Tuttavia, fluorescenza a raggi x permette per la valutazione del campione rapido di contaminazione di metallo e/o integrazione di proteine residue holo. Tempo di radiazione di sincrotrone è limitato e non c'è sempre tempo per elaborare una strategia per la raccolta dati di scattering di raggi x su ogni campione, così la fluorescenza a raggi x è una tecnica importante per molti cristalli di screening e la priorità per i campioni che raggi x devono essere raccolti dati di scattering. Fluorescenza a raggi x permette inoltre la raccolta di dati da campioni che non può rifrangere i raggi x. Durante la raccolta dati di fluorescenza di raggi x, a volte il segnale può essere molto debole e gli spettri risultanti uninformative. Per migliorare la potenza del segnale, sia per la fluorescenza a raggi x o scansione MAD, considerare aumentando il tempo di esposizione e/o diminuire l'attenuazione del fascio di raggi x. Quando un campione viene identificato per la raccolta dati di scattering di raggi x, si raccomanda di raccogliere dati di scattering di raggi x su una parte diversa del campione di quello che è stato usato per fluorescenza a raggi x e MAD scansione per ridurre al minimo il danno da radiazione, migliorare la qualità dei dati collezione e ridurre al minimo ogni potenziale per la riduzione del segnale anomalo.

Rilevamento di traccianti radioattivi richiede quantità nanomolari di materiale o meno, e l'uso di tali rivelatori come agenti di monitoraggio molecolare fornisce un metodo semplice e altamente sensibile di sondare i processi cellulari. Il saggio di radiometal sopra indicato consente di determinare l'assorbimento del metallo totale, distribuzione attraverso compartimenti cellulari, così come i tassi di assorbimento. Infatti, ogni punto del tempo di dati richiede un frazionamento di 40 minuti; Tuttavia, come viene raggiunto ogni punto del tempo, le cellule sono immediatamente pellettate e incubate in tampone salino elevato (Figura 5passaggio 1). Radiometal misure dei media, scartati tampone salino elevato (Figura 5passaggio 1) e le frazioni periplasmica e citoplasmatiche dopo (Figura 5punto 3) indicano che l'incubazione di alta tampone salino rimuove correttamente tutti i rimanente metallo libero non associati che si sono protratte dopo la centrifugazione iniziale dopo aver raggiunto il punto di tempo. La centrifugazione iniziale rimuove la maggior parte (fino all'80%) di metallo libero non associato e la centrifugazione dopo incubazione nel buffer sale alto rimuove anche ulteriore rimanenti metallo libero non associati. Qualsiasi metallo libero non associato persistente non dovrebbe influenzare significativamente il trasporto del metallo durante il frazionamento di 40 minuti. L'influenza di frazionamento 40 minuti il trasporto intracellulare del metallo è un'altra considerazione per interpretazione prudente dei dati. Praticamente il protocollo intero frazionamento si verifica sopra ghiaccio, a parte la centrifugazione secondo 30 tra i passaggi. Tempo di trasporto corso esperimenti hanno indicato che il mantenimento delle cellule a 4 ° C abroga trasporto metallo^20,21,22; in metallo Pertanto, poiché gli esperimenti si verifica sopra ghiaccio, il frazionamento di 40 minuti non dovrebbe aumentare significativamente livelli di metallo nel Periplasma di citoplasma e i livelli del metallo dovrebbero essere rappresentante dei punti di tempo in cui le cellule sono state inizialmente centrifugalized.

Determinazione dell'assorbimento relativo in diversi compartimenti cellulari può aiutare a comunicare dati XFS, confermano la natura fisiologica di un substrato così come attivare l'investigatore sondare ulteriormente i dettagli molecolari di un meccanismo. Ad esempio, aggiunta di mutagenesi genetica agli esperimenti di assorbimento radiometal fornisce un metodo diretto per rafforzare residui funzionali chiave o molecole coinvolte nel trasporto di substrato. Vantaggi di radiometal assorbimento esperimenti e analisi includono turnaround, alto rendimento, elevata riproducibilità e parallelizzazione di esperimenti di confrontare le condizioni di crescita e costrutti genetici.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore	Fisher	M1097270100
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder)	Fisher	BP1760-5
AMRESCO M9 Medium Broth	Fisher	NC9688886
Bis-Tris, Fisher BioReagents	Fisher	BP301-100
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS)	Fisher	C79-500
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)	Fisher	D16-500
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS)	Fisher	S311-100
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller	Fisher	BP1426-500
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS)	Fisher	M63-500
Sodium Azide, White Powder	Fisher	BP922I-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher	S271-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS)	Fisher	S374-500
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology)	Fisher	BP153-500
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Cryschem Plate	Hampton	HR3-158
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	Fisher	UFC903024
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane	Fisher	SLHV013SL
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg	Fisher	28-9893-36
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns	Fisher	17-1154-01
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS	Fisher	230280