Immagine-Guida di resezione del Glioblastoma e l'impianto intracranico di terapeutica delle cellule staminali-seminato ponteggi

Riepilogo

Alla ricerca di tumore terapeutiche cellule staminali mesenchimali (MSCs) mostrano la promessa come trattamento per glioblastoma dilagante. Trapianto ottimo coinvolge consegna delle MSC in cavità di resezione del tumore su ponteggi. Qui, preclinici tecniche per studiare il trattamento del MSC di glioblastoma sono forniti tra cui: resezione del tumore immagine-guida; impianto di scaffold MSC-seminato; e terapia postoperatoria di rilevamento.

Abstract

Glioblastoma (GBM), il tumore cerebrale primario più comune e più aggressivo, trasporta un'aspettativa di vita di 12-15 mesi. La breve aspettativa di vita è dovuto in parte all'incapacità del trattamento attuale, che consiste della resezione chirurgica seguita da radioterapia e chemioterapia, per eliminare i focolai di tumore invasivo. Trattamento di questi focolai può essere migliorato con tumoricidal umano cellule staminali mesenchimali (MSCs). MSCs esibiscono tropismo potente del tumore e possono essere ingegnerizzate per esprimere terapeutiche proteine che uccidono le cellule del tumore. Avanzamenti in modelli preclinici indicano che la resezione chirurgica induce la perdita prematura di MSC e riduce l'efficacia terapeutica. Efficacia del trattamento del MSC può essere migliorata da semina MSCs su un'impalcatura biodegradabile poly(lactic acid) (PLA). Consegna MSC nella cavità di resezione chirurgica su un'impalcatura PLA Ripristina di uccisione del tumore, la persistenza e la conservazione delle cellule. Per studiare gli effetti dell'impianto di PLA MSC-seminato il GBM, è necessario un accurato modello preclinico. Qui forniamo un protocollo chirurgico preclinico per resezione del tumore di immagine-Guida di GBM in topi immune-carenti ha seguito da impianto di impalcatura MSC-seminato. MSCs sono progettati con costrutti lentivirali costitutivamente esprimere e secernono terapeutico TNFα-correlati apoptosis-inducing ligand (TRAIL), come pure la proteina fluorescente verde (GFP) per consentire la registrazione fluorescente. Allo stesso modo, le cellule del tumore U87 sono progettate per espresso mCherry e luciferasi di lucciola, fornendo dual fluorescente/luminescenti di rilevamento. Mentre attualmente utilizzato per lo studio di cellule staminali mediate consegna di terapeutica, questo protocollo potrebbe essere modificato per studiare l'impatto della resezione chirurgica sugli altri interventi GBM.

Introduzione

Glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale primario più comune negli adulti, con una misera sopravvivenza mediana di soli 12-15 mesi^1,2,3,4,5. Sopravvivenza non è significativamente migliorata poiché 2005 quando l'attuale standard clinici di massima resezione chirurgica seguita da radioterapia e chemioterapia temozolomide concomitante e adiuvante è stato adottato^6,7. Mentre questo trattamento fornisce ai pazienti un sollievo temporaneo dei sintomi, standard di trattamento cura risultati invariabilmente in ricorrenza come fuochi del cancro invasivo eludere la resezione e sono protetti dalle terapie sistemiche da emato - encefalica (BBB). Strategie i focolai di tumore invasivo di destinazione mentre eludere la BBB sono urgentemente necessarie per guadagnare trazione contro questa malattia debilitante e aggressiva.

Cellule staminali mesenchimali (MSCs) mostrano la promessa come droga veicoli di consegna per GBM a causa del loro tumore nativo tropismo^8,9. MSCs possiedono i ricevitori per e migrare verso fattori solubili che tumori secernono, compreso 1 α fattore derivato da cellule stromali (SDF-1 α), matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) e monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) tra gli altri^{10, 11 , 12 , 13}. ingegneria MSCs per esprimere e secernono farmaci citotossici permette loro di essere sfruttato come veicoli di consegna di droga tumore-homing. MSCs derivati dal muoversi verso i fuochi del tumore invasivo e fornire proteine terapeutiche. Questo approccio ha dimostrato la fattibilità in una varietà di preclinici GBM modelli^9,14. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli non includono la resezione chirurgica nonostante la rilevanza clinica di questo componente. Emergendo studi utilizzando nuovi modelli di resezione ha rivelato che la rimozione chirurgica del tumore riduce la persistenza di cellule staminali che vengono iniettate direttamente nella cavità chirurgica¹⁵. Perdita di attuabilità ha provocato ridotta efficacia, probabilmente a causa di diminuzioni nella dose e la durata del farmaco consegnato ai fuochi del tumore invasivo.

Per aumentare la vitalità delle cellule staminali e drug delivery, MSCs possono essere seminate su impalcature prima dell'impianto. In questo protocollo, biocompatibili e riassorbibili elettrofilate nanofibrous poly(lactic acid) (PLA) viene utilizzato come ponteggio per MSCs. PLA si flette e si adatta alla forma della cavità di resezione al momento dell'impianto, che massimizza la copertura terapeutica e riduce al minimo il distanza MSCs deve percorrere per raggiungere le cellule del tumore. MSCs rimangono sul patibolo durante l'impianto e quindi migrare fuori il patibolo verso le cellule del tumore dopo l'impianto^16,17. MSCs e i farmaci citotossici che trasportano quindi si accumulano i focolai di tumore. Consegna della droga citotossica al tumore richiede MSC vitalità e persistenza, entrambi i quali sono aiutati da impianto su ponteggi.

In questa procedura vengono utilizzati vettori lentivirali di indurre l'espressione stabile di (fluorescentein vitro di rilevamento) e bioluminescenti (in vivo di rilevamento) marcatori nelle linee di cancro e di cellule staminali. La linea GBM umana U87 è infettata di mCherry e firefly luciferase (U87 mCh-Fl) e il MSCs non terapeutico con GFP e renilla luciferasi (MSC GFP-Rluc). La variante terapeutica delle MSC express TNFα-correlati apoptosis inducing ligand (MSC-TRAIL). SENTIERO, una proteina secernuta costitutivamente, associa a nelle vicinanze di recettori di morte sul cancro cellule e avvia gli apoptosi caspase-mediati¹⁸.

Qui, forniamo un protocollo per resezione chirurgica GBM preclinica immagine-guida e l'impianto di scaffold MSC-seminato. In breve, i topi nudi sono dato un craniotomy seguito tre giorni dopo da iniezione stereotactic ortotopico di U87 mCh-Fl per stabilire il tumore primario. Il tumore engrafted cresce per un periodo di circa una settimana. Impalcature PLA sono seminate con MSCs 48h prima dell'intervento chirurgico di resezione. Il tumore è quindi resecato sotto guida fluorescente e l'impalcatura MSC-caricato viene impiantato nella cavità di resezione. Sopravvivenza di onere e mouse di tumore sono quindi monitorati postoperatorio con bioluminescenza imaging (BLI). Una sequenza temporale di queste procedure è fornita qui sotto (Figura 1).

Figura 1: sequenza temporale delle procedure. Topi inizialmente ricevano una finestra cranica (giorno 0). Dopo un periodo di recupero di tre giorni, i tumori sono impiantati (giorno 3) e crescere per circa una settimana. Impalcature sono seminate con MSCs (giorno 8) due giorni in anticipo la procedura di resezione e l'impianto del tumore (giorno 10). Progressione del tumore ed efficacia terapeutica vengono valutati tramite post-operatorio in seguito di imaging (giorno 10 +). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di The University of North Carolina a Chapel Hill.

Nota: Questa procedura è eseguita su topi con una craniotomia aperta, come una versione modificata del protocollo da Mostany e Portera-Cailliau¹⁹ in cui viene eliminato il tessuto osseo che viene rimosso chirurgicamente, lasciando il cervello accessibile per istituzione e eventuale resezione dei tumori GBM. A seguito di craniotomia, tumori sono stabiliti attraverso l'impianto stereotassica come descritto in Ozawa e James²⁰. Abbiamo impiantare cellule mCh-Fl di 1 x 10⁵ U87 alle seguenti coordinate stereotassica (in mm dal bregma): (2.5, 0, -0,5).

1. cella cultura e preparazione di ponteggio

Nota: Impalcature devono essere preparate 48h prima dell'impianto in topi. I seguenti volumi sono forniti su base al patibolo. Moltiplicare la quantità come necessario per ulteriori scaffold.

1. Impalcature PLA tagliate a pezzi di resezione cavità di dimensioni medie (circa 2 mm x 2 mm). Impalcature possono essere tagliate a mano con le forbici o con un punzone di foro per la ripetibilità.
2. Sterilizzare mediante immersione in etanolo al 70% per 15 min seguita da immersione in PBS. Posto dell'impalcatura in mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina durante la preparazione di cellule per il seeding.
3. Sollevare MSCs coltivate utilizzando 0,05% tripsina (3-5 mL per un pallone da T75). Incubare a 37 ° C per 5 min, assicurarsi che le cellule hanno alzato, quindi aggiungere 7-10 mL DMEM al pallone per inattivare la tripsina.
4. Trasferire contenuto del pallone in una provetta per centrifuga 15 mL. Contare le celle utilizzando un emocitometro. Pellet di 5 x 10⁵ MSCs per ogni ponteggio tramite centrifugazione a 100 x g per 5 min.
5. Aspirare il supernatante e risospendere MSCs in 5 µ l DMEM 5x10⁵ cellule.
6. Preparare i ponteggi per il seeding tamponando loro secco.
   1. Rimuovere un'impalcatura da immersione DMEM con le pinzette e temporaneamente posizionarlo sul coperchio della piastra 6 pozzetti. Sollevare il patibolo il coperchio, lasciando dietro di sé una gocciolina di DMEM in eccesso.
   2. Riposizionare l'impalcatura sul coperchio nuovamente in un luogo nuovo e asciutto. Ripetere 3 - 5 volte, quindi posizionare il patibolo parzialmente appassito in una nuova piastra 6 pozzetti per il seeding. Ripetere per ogni ponteggio.
      Nota: Un'impalcatura parzialmente appassita fornisce cellulare ottimale semina risultati. Se il ponteggio è troppo umido, cellule saranno sfilare il patibolo e aderire alla piastra ben qui sotto. Se il ponteggio è troppo asciutto, la goccia non si diffonderà in intera impalcatura, conseguente distribuzione povera cella iniziale.
7. Utilizzando una pipetta, mescolare delicatamente il flaconcino di cellule staminali per omogeneizzare la sospensione come alcune cellule possono essere depositati alla parte inferiore.
8. Pipettare lentamente 2,5 µ l appena mescolato sospensione MSC direttamente sul patibolo, creando una piccola goccia sopra la parte superiore dell'impalcatura.
9. Aggiungere 300 µ l DMEM ai bordi di ciascun pozzetto. Ciò impedirà la rapida evaporazione della goccia delle cellule. Incubare a 37 ° C per 30 min, permettendo alle cellule di allegare al patibolo.
10. Con il forcipe, capovolgere delicatamente le impalcature sopra nella piastra di ben. Seme 2,5 µ l appena mescolato MSC sospensione (in questo modo un totale di 5 x 10⁵ cellule seminate al patibolo). Incubare a 37 ° C per 30 min, permettendo alle cellule di allegare al patibolo.
11. Coprire le impalcature in DMEM aggiungendo 2 mL in ciascun pozzetto della piastra 6 pozzetti. Sollevare delicatamente le impalcature per consentire media fluire sotto di loro. Incubare a 37 ° C in questo stato per 48 h prima dell'intervento di impianto.
12. Verifica le impalcature dopo 24 h e aggiungere/modificare media se evaporazione in eccesso o supporti scoloriti a causa dello squilibrio del pH sono osservati.

2. fluorescenza-guidato la resezione e l'impianto dell'impalcatura

Nota: Sterilizzare tutti gli strumenti prima dell'inizializzazione di chirurgia. Amministrare l'analgesia profilattica come descritto nel vostro protocollo IACUC istituzionale.

1. Posizionare la cornice stereotassica sul palco di una fluorescenza stereomicroscopio di dissezione.
2. Anestetizzare il mouse sotto inalato isoflurano in un'aula di induzione. Una volta anestetizzato, fissare il mouse nella cornice stereotassica con anestesia per inalazione continua di alimentazione tramite un adattatore ogiva isoflurano. Mantenere la temperatura corporea con un rilievo di riscaldamento e/o la sonda.
   Nota: 4-5% isoflurane è adatta per induzione e 2-3% è adatto per la manutenzione, ma questo deve essere adattato e monitorato per ogni mouse.
3. Applicare unguento oftalmico agli occhi per prevenire la secchezza della cornea. Sterilizzare il sito di incisione del cuoio capelluto con una serie di tre alcol e tre salviettine imbevute di betadine.
4. Eseguire la prova reflex di punta pizzico su ogni arto e confermare risposta negativa per garantire adeguata amputate. Garantire un costante tasso respiratorio a circa 55-65 respiri/min.
5. Usando il forcipe, pizzicare e sollevare delicatamente il cuoio capelluto. Fare un'incisione rostrale caudale lineare del midline con forbici chirurgiche. Irrigare il sito di incisione con PBS e rimuovere il grasso sottocutaneo con un cotton-fioc in un movimento circolare di spazzolatura. Organizzare la pelle tale che la finestra cranica precedentemente stabilita è completamente visibile.
6. Delicatamente la puntura dura solo interno ai bordi della finestra cranica utilizzando un ago da 18 G. Ripetere fino a quando l'incisione tracce completamente all'interno della finestra.
7. Rimuovere il dura da peeling via con una pinzetta, rivelando il parenchima sottostante e tumore.
8. Individuare il tumore di mCh-Fl U87 spegnendo luci in camera e accendere la fluorescenza-modalità di stereomicroscopio. Preparare per la resezione di un puntale di 1-200 µ l di caricamento nell'estremità del tubo di una pompa a vuoto.
9. Accendere la pompa del vuoto. Resecare il tumore aspirando delicatamente il tessuto fluorescente finché non rimane nessun segnale. Spegnere la pompa del vuoto e scartare la punta della pipetta. Girare la fluorescenza fuori e la camera luci torna su.
   Nota: Per controllare lo spurgo, irrigare con PBS freddo e applicare una pressione costante con un cotton-fioc. Nei casi più gravi, la cavità di resezione può anche essere imballata temporaneamente con un agente emostatico, finché viene rimosso dopo il sanguinamento si è fermato seguita da un'altra irrigazione di PBS.
10. Immediatamente prima dell'impianto, immergere lentamente un'impalcatura PLA MSC-seminato in PBS per rimuovere indesiderati media e componenti associati. Impiantare il patibolo in cavità di resezione. Se necessario, aggiungere 1 fibrinogeno µ l (67-106 mg/mL), seguito da trombina di 1 µ l (400-625 U/mL) per garantire l'impalcatura in luogo.
11. Con la dura madre rimosso e il lembo osseo dalla finestra cranica già scartato, sigillare la ferita semplicemente di chiudere la pelle e applicare la colla chirurgica. Rimuovere l'animale da anestetico per via inalatoria e permettono di recuperare su una superficie riscaldata.
12. Mouse una volta ambulatorio, ritorno alla gabbia. Somministrare analgesici puntualmente IACUC-approvato. Ripetere la procedura per ogni mouse.

3. post-operatorio di Imaging

1. Utilizzando la siringa di insulina 28g, iniettare topi con D-luciferina (150 mg/kg intraperitoneale).
2. Aspettare 10 min. Questo permetterà la luciferina di circolare in tutto il corpo e reagire con le cellule tumorali che esprimono luciferasi nel cervello per ottenere massima espressione.
3. Nell'ambito dell'anestesia di isoflurane (come accennato in precedenza), immagine topi in un bioluminescenza (BLI) sistema per visualizzare i tumori di imaging. Variare i tempi di esposizione come necessari (secondi a minuti) a seconda delle dimensioni del tumore.
4. Ripetere la procedura di imaging come necessario per determinare la cinetica di crescita del tumore. Continuare a monitorare la salute degli animali.
   Nota: MSCs terapeutico si esprimono costitutivamente TRAIL, uccidere le cellule tumorali e sopprimendo la crescita complessiva del tumore. Ogni 2-5 giorni di imaging fornisce una frequenza sufficiente per questo scopo.
5. Qualora ricorrano predeterminato endpoint descritte nel protocollo della IACUC, sacrificio topi mediante perfusione perfusione e raccogliere i tessuti per l'analisi.

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Risultati

U87 cellule del tumore sono state progettate per espresso mCherry e luciferasi di lucciola (U87 mCh-Fl) prima dell'iniezione e per consentire la resezione guidata da immagini e bioluminescenza (Figura 2A-C) di rilevamento. Cellule staminali erano similmente progettate con diagnostica GFP-Rluc (MSC-GFP) o GFP-prova terapeutica (MSC-TRAIL) e seminate su impalcature PLA per confermare allegato e proliferazione (Figura 2D

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Discussione

Chirurgia in genere può essere completata entro 30 min per topo, dato che i punti seguenti sono presi in considerazione per massimizzare la precisione ed evitare insidie che richiede tempo. Innanzitutto, assicurarsi che il mouse è posizionato correttamente nello strumento stereotassica prima di iniziare la procedura. Movimenti indesiderati della testa limiterà la precisione chirurgica del craniotomy, Ubicazione dell'impianto del tumore e del livello di resezione del tumore. Prima di resezione, rimuovere completamente ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Just for mouse stereotaxic instrument	Stoelting	51730	Maintains steady head positioning during surgery
Fluorescence dissecting stereomicroscope	Leica	M165 FC	Allows real-time imaging of tumor during resection
Motorized integrated stereotaxic injector (ISI) system	Stoelting	53315	Allows precise tumor cell injection volume and rate
Vetbond tissue adhesive	3M	1469	Sugical glue to close skin wound
Artificial tears	Akorn	664268	Prevents eyes from drying during surgery
Webcol alcohol preps	Covidien	6818	Sterilize incision site
Betadine surgical scrub	Purdue Fredick Company	6761815117	Sterilize incision site
Cotton-tipped applicators	Fisherbrand	23-400-115	Surgery tool
E-vac aspirating system	Argos	EV310	Vacuum pump used to resect tumor
Fibrinogen and thrombin extracted from as-received TISSEEL	Baxter		To temporarily secure the scaffold in the resection cavity
IVIS Kinetic in vivo optical imaging system	Caliper Life Science		Bioluminescent Imager
D-Luciferin potassium salt	PerkinElmer	122799	In vivo imaging agent