Quantificare la colonizzazione di Vibrio cholerae e diarrea nel modello Zebrafish adulto

Riepilogo

Zebrafish sono un naturale Vibrio cholerae host e può essere utilizzato per riassumere e studiare l'intero ciclo infettivo dalla colonizzazione alla trasmissione. Qui, dimostriamo come valutare i livelli di colonizzazione di V. cholerae e quantificare la diarrea in zebrafish.

Abstract

Vibrio cholerae è meglio conosciuto come l'agente infettivo che causa il colera malattia umana. All'esterno l'ospite umano, V. cholerae esiste principalmente per l'ambiente acquatico, dove interagisce con una varietà di specie acquatiche superiori. Pesci vertebrati sono noti per essere un host ambientale e sono un potenziale serbatoio di V. cholerae in natura. V. cholerae e le specie di pesci teleostei Danio rerio, comunemente note come zebrafish, hanno origine dal subcontinente indiano, suggerendo una lunga interazione in ambienti acquatici. Zebrafish sono un organismo modello ideale per studiare molti aspetti della biologia, tra cui le malattie infettive. Zebrafish può essere facilmente e rapidamente colonizzato da V. cholerae dopo l'esposizione in acqua. Colonizzazione intestinale da V. cholerae conduce alla produzione di diarrea e l'escrezione di replicata V. cholerae. Questi escreti batteri possono quindi andare a colonizzare nuovi host di pesce. Qui, dimostriamo come valutare V. cholerae-colonizzazione intestinale in zebrafish e come quantificare V. cholerae-indotto diarrea di zebrafish. Il modello di colonizzazione dovrebbe essere utile per i ricercatori che stanno studiando se geni di interesse possono essere importanti per la colonizzazione di host e/o per la sopravvivenza dell'ambiente. La quantificazione di zebrafish diarrea dovrebbe essere utile ai ricercatori di studiare qualsiasi agente patogeno intestinale che sono interessati ad esplorare zebrafish come sistema modello.

Introduzione

Vibrio cholerae è un batterio gram-negativo, acquatico che causa il colera malattia umana così come diarrea sporadica^1,2. V. cholerae è trovato nell'ambiente in molte aree del globo, spesso associato con altri organismi acquatici. Questi organismi associazione includono plancton, ovature di insetti, crostacei e pesci vertebrati specie^3,4,5,6,7. Parecchi studi hanno isolato V. cholerae da tratti intestinali di pesce in diverse aree geografiche^7,8,9,10. La presenza di V. cholerae in pesce indica che il pesce può agire come un serbatoio ambientale. Pesce potrebbe essere implicato anche nella trasmissione della malattia agli esseri umani e nella diffusione geografica di V. cholerae ceppi⁶.

Per comprendere meglio come V. cholerae interagisce con pesce, Danio rerio, meglio conosciuto come pesce zebra, è stato sviluppato come sistema modello per lo studio di V. colerae¹¹. Zebrafish sono nativi di Asia del sud, compresa la regione del Golfo del Bengala, che è pensata per essere il primo serbatoio di V. cholerae. Prima del primo inizio pandemia colera nel 1817, il colera non era stato segnalato di fuori di quello che oggi è India e Bangladesh. Di conseguenza, zebrafish e V. cholerae quasi certamente associati con a vicenda su scale di tempo evolutivo, suggerendo che zebrafish sono un host V. cholerae nell' ambiente naturale¹².

Il modello di zebrafish per V. cholerae è semplice da eseguire e può essere usato per studiare l'intero patogeno V. cholerae ciclo di vita. Pesci sono esposti a V. cholerae di bagnarsi in acqua che è stato inoculato con un numero noto di V. cholerae. Entro poche ore, si svolge colonizzazione intestinale, seguita dalla produzione di diarrea. Diarrea è costituito da mucina, proteine, batteri escreti e altri contenuti intestinali. Il grado di diarrea può essere quantificato utilizzando pochi semplici misurazioni¹³. V. cholerae che è stata escreta dai pesci infettati può quindi andare per infettare pesce ingenuo, completando il ciclo infettivo. Di conseguenza, il modello di zebrafish ricapitola le V. cholerae malattia umana processo^12,14.

Il più delle volte usato V. cholerae modelli animali sono stati storicamente topi e conigli^{14,15,16,17,18}. Questi modelli sono stati strumentali in aggiunta alla nostra conoscenza della patogenesi di V. cholerae . Tuttavia, poiché topi e conigli non sono naturali V. cholerae padroni di casa, ci sono limitazioni a quali aspetti del ciclo di vita di V. cholerae possono essere studiati. La colonizzazione di V. cholerae di topi e conigli richiede in genere l'assenza di microbiota intestinale o un pretrattamento con gli antibiotici per danneggiare il microbiota intestinale. Entrambi i modelli richiedono o sonda gastrica per introdurre i batteri al tratto digestivo o manipolazione chirurgica per iniettare direttamente i batteri nell'intestino. Zebrafish hanno un vantaggio in quanto pesce adulto con un microbiota intestinale intatto sono prontamente colonizzati e il processo infettivo avviene naturalmente, senza alcuna manipolazione necessaria.

Il lavoro attuale dimostra l'utilizzo di zebrafish come un modello di infezione da V. cholerae . L'infezione, la dissezione, enumerazione di colonizzare V. choleraee la quantificazione di diarrea causata da V. cholerae sarà descritto^12,13. Questo modello rischia di essere utile agli scienziati interessati sia nel processo di malattia V. cholerae e il lifestyle di V. cholerae ambientale.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Wayne State University. Questo metodo è stato descritto in Runft et al. ¹²

1. determinazione dei livelli di colonizzazione intestinale

Nota: Colonizzazione intestinale è la metrica più utile nel modello zebrafish come può essere utilizzato per confrontare la relativa idoneità dei vari ceppi di V. cholerae o gli effetti di mutazioni o di knockout del gene.

1. Inoculazione di zebrafish per immersione
   Nota: Questo mezzo di esposizione è simile il corso naturale dell'infezione.
   1. Preparazione di V. cholerae
      1. Inoculare 5 mL di brodo di Lisogenesi (LB) con un isolato V. cholerae Colonia da un LB piastra e incubare a + 37 ° C con agitazione (180 giri/min) 6 – 8 h (cultura durante la notte).
      2. Inoculare 25 mL di terreno LB autoclavato fresco in una beuta da 250 mL con 50 µ l della coltura durante la notte precedente. Incubare per 16 – 18 h a 37 ° C con agitazione (150 rpm).
      3. Leggere la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) di una diluizione di 1/10 della cultura durante la notte per stimare il numero di batteri / mL (il OD₆₀₀ = 1 è ~ 10⁹ CFU/mL.)
      4. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 6.000 g per 10 min. Rimuovi il supporto con una pipetta o versarlo fuori in una soluzione disinfettante. Risospendere le cellule in PBS sterile fino alla concentrazione desiderata, in genere tra 1 x 10⁷ a 1 x 10¹⁰ per ml di PBS.
         Nota: Qui, ci riferiamo a sterilizzato nell'autoclave acqua ad osmosi inversa che contiene sali di mare di 60 mg/L come acqua sterile infezione.
   2. Inoculazione e incubazione
      1. Inserire quattro o cinque zebrafish in un becher da 400 mL contenente 200 mL di acqua sterile infezione.
      2. Aggiungere 1 mL di V. cholerae (dal passaggio 1.1.1.4.) per ottenere la concentrazione desiderata di infezione (in genere 5 x 10⁴ a 5 x 10⁷ CFU/mL) in 200 mL di acqua di infezione.
      3. Coprire il becher con un coperchio forato per impedire che il pesce che salta fuori; parte superiore di una casella di punta di 200 µ l funziona bene per questo.
      4. Etichettare ogni bicchiere e inserirli in un'incubatrice di vetro anteriore regolato a 28 ° C per la durata dell'esperimento.
   3. Procedura per l'esposizione transitoria
      Nota: Un'esposizione transitoria a V. cholerae (in genere 6 h) seguita dalla rimozione dei batteri da inoculo è utile per studiare la trasmissione e per la più accurata quantificazione dei batteri escreti.
      1. Dopo 6 h di esposizione, versare l'acqua Becher attraverso una rete da pesca per raccogliere i pesci. Gettare l'acqua infetto in un contenitore di candeggina per uccidere il V. cholerae.
      2. Mettere il pesce rimosso in un becher di 200 mL di acqua sterile infezione. Consentire il pesce a nuotare in questa acqua pulita per 5 min rimuovere i batteri dalla superficie del pesce.
      3. Ripetere la procedura netta (punto 1.2.2) e mettere il pesce in un becher da nuovo di 200 mL di acqua sterile infezione. Tenere i pesci in questo bicchiere per tutta la durata dell'esperimento.
2. Eutanasia
   1. Quando l'esperimento ha raggiunto il suo endpoint desiderato, prendere un campione dell'infezione dell'acqua (15 mL è in genere sufficiente) per consentire escreti conta batterica e la misurazione di diarrea (ad esempio analisi di mucina, contenuto proteico, e/o OD), se lo si desidera (sezione 2).
   2. Versare il resto dell'acqua attraverso una rete da pesca (per raccogliere il pesce) in candeggina per uccidere il V. cholerae in acqua.
   3. Mettere il pesce in un becher contenente acqua di infezione più 336 µ g/mL di etile 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaina) ed incubare il pesce in questa soluzione di tricaina per 20 minuti a TA.
      Nota: Le calze a rete sono stati sterilizzati con una soluzione di candeggina al 10%.
3. Dissezione
   1. Preparazione del pesce
      1. Scoop di un pesce dalla soluzione di tricaina con un cucchiaio di plastica usa e getta e posizionarlo sulla superficie per dissezione.
      2. Posizione il pesce con il suo lato ventrale rivolta verso l'alto e il pin attraverso la mascella inferiore, con l'estremità smussata del perno angolato lontano dal centro del corpo. Mettete un altro perno appena posteriormente all'ano, anche angolato lontano dal corpo.
   2. Esposizione del tratto intestinale
      1. Tamponare la superficie ventrale del pesce con un panno privo di lanugine tuffato in etanolo al 70%.
      2. Sterilizzare un bisturi e forbici di Allerød immergendoli in etanolo al 70% e fiammeggiante li.
      3. Praticare una piccola incisione longitudinale nella pancia appena sotto la pelle penetrando le squame e utilizzando il bisturi. Fare attenzione a non tagliare troppo in profondità, come il tratto intestinale si trova appena sotto la pelle.
      4. Usando le forbici, estendere l'incisione attentamente lungo la lunghezza del corpo, di taglio non più a livello cutaneo profondo ed evitando l'ano.
      5. Fare due tagli laterali con le forbici verso la testa del pesce per consentire un'apertura dell'incisione.
      6. Pin la pelle su ogni lato delle incisioni laterali alla superficie per dissezione, pesca i perni fuori, lontano dal corpo.
         Nota: Le punte dei perni sono state sterilizzate in precedenza da loro fiammeggiante con alcool.
   3. Rimozione del tratto intestinale
      Nota: Il tratto intestinale dovrebbe essere visibile come un tubo pallido, molto sottile in cima gli altri organi.
      1. Fiamma-sterilizzare il forcipe e quindi utilizzarli per rimuovere l'intero tratto intestinale (in genere 12 – 15 mm di lunghezza). Posizionare l'intestino in una provetta di omogeneizzazione contenente perle di vetro (Vedi passi 1.4.1–1.4.2) e 1 mL di 1X PBS o LB, sul ghiaccio.
4. Omogeneizzazione
   1. Preparare i tubi di omogeneizzazione in anticipo da versare ~1.5 g di perle di vetro di 1 mm in 2 mL tappo a vite provette (riempirli circa a metà strada) e poi li sterilizzare in autoclave.
   2. Aggiungere 1 mL di LB sterile o 1X PBS.
   3. Una volta che l'intestino di zebrafish sono state vite aggiunto (passo 1.3.3.1) per i tubi, i tappi su molto strettamente e poi fissare i tubi nell'omogeneizzatore di vortice.
   4. Omogeneizzare i campioni per 1 min all'impostazione massima, poi raffreddare li sul ghiaccio per un minimo di 1 – 2 Ripetere questo ciclo di omogeneizzazione ancora una volta per una completa omogeneizzazione.
      Nota: Diversi metodi alternativi per omogeneizzazione funziona anche.
5. Quantificare i livelli di colonizzazione intestinale
   1. Preparare le provette (provette di vetro piccolo o provette microcentrifuga da 1,5 mL) per la diluizione seriale dell'omogenato aggiungendo 900 µ l di LB o 1X PBS in ogni provetta. Per ogni pesce, preparare 5 – 6 provette e fai 10 volte diluizioni seriali dell'omogenato intestinale aggiungendo 100 µ l di omogenato al primo tubo, Vortex di mix e quindi aggiungendo 100 µ l dalla provetta prima il secondo tubo.
   2. Ripetere questa procedura fino a quando tutte le diluizioni sono state preparate.
   3. Piastra di 100-200 µ l di ciascuna diluizione su piastre di agar LB contenente 100 µ g/mL di streptomicina (se utilizza ceppi resistenti streptomicina) e 40 µ g/mL del X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Incubare le piastre a 30 ° C per 16 – 18 h.
   4. Dopo l'incubazione overnight, conteggio V. cholerae colonie sulle piastre, utilizzando un contatore automatico oppure manualmente contando le colonie; è utile contrassegnare le colonie contate con una punta di marcatore.
   5. Determinare il CFU per intestino pesce moltiplicando il conteggio di piatto per il fattore di diluizione della sospensione, tenendo conto del volume che è stato placcato.

2. misurazione del pesce diarrea

Nota: Quattro diverse metriche sono stati usati per valutare la diarrea di pesce: i livelli di mucina in acqua, i livelli di proteina escreti complessiva nell'acqua, il OD₆₀₀ dell'acqua e il V. cholerae CFU nell' acqua¹³. Diarrea, normalmente diventa visivamente evidente circa 6 h dopo l'esposizione di zebrafish di V. cholerae come descritto sopra.

1. Determinare i livelli di mucina
   Nota: Secrezione della mucina è indotta durante la colonizzazione di V. cholerae ed è una buona misura di livelli di escrezione, soprattutto nelle prime fasi di infezione¹³. Il dosaggio di mucina è una variazione sulla micropiastra dell'acido periodico Schiff dosaggio¹⁹.
   1. Preparare i seguenti materiali: 50% (p/v) soluzione di riserva di acido periodico e 0,1% soluzione di acido periodico lavoro (10 µ l di 50% acido periodico stock aggiunto a 5 mL di acido acetico 7% — utilizzare immediatamente dopo aver effettuato), standard di mucina, piastre microtiter a 96 pozzetti, Schiff reagente.
      1. Preparare gli standard della mucina sospendendo i seguenti importi di mucina (da un tipo di stomaco suino III) in un tampone di acetato di sodio (100 mM sodio acetato, 5mM di EDTA, pH 5,5 con acido acetico glaciale): 400 µ g/mL, 300 µ g/mL, 200 µ g/mL, 150 µ g/mL , 100 µ g/mL, 75 µ g/mL, 50 µ g/mL, 25 µ g/mL e 10 µ g/mL.
         Preparare il piatto aggiungendo 100 µ l di infezione acqua in ogni pozzetto che verrà utilizzato nel test come segue: blank 1X PBS; norme di mucina come descritto sopra, o un campione di acqua dall'infezione del pesce. Fare ogni campione in triplice copia.
   2. Aggiungere 50 µ l di soluzione di acido periodico 0,1% fresca di ogni bene con una pipetta multicanale e mescolare pipettando su e giù più volte.
   3. Avvolgere la piastra in involucro di plastica e incubare a 37 ° C per 1 – 1,5 h.
   4. Raffreddare la piastra a temperatura ambiente per 5 – 10 min. aggiungere 100 µ l di soluzione di fucsina (Schiff di reagente) in ciascun pozzetto e dispensare su e giù per mescolarlo.
   5. Avvolgere la piastra in involucro di plastica e incubare a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo fino a quando ha sviluppato il colore; il colore è generalmente sviluppato entro 20 min. leggere l'assorbanza a 560 nm utilizzando un lettore di piastra.
   6. Tracciare una curva standard di mucina (OD₅₆₀vs µ g/mL della mucina standard). Determinare i livelli di mucina delle incognite identificando dove il OD₅₆₀ di ogni sconosciuto cade sulla curva standard e leggere la concentrazione di mucina corrispondente per quel valore.
2. Determinare i livelli di proteina
   Nota: A parte la mucina, livelli complessivi di proteine in acqua sono un altro proxy per i livelli di diarrea (feci nuvoloso, liquido) prodotto dal pesce. Questa procedura utilizza un'analisi di Bradford standard per stimare i livelli della proteina. I livelli della proteina sono stimati in base a una curva standard di albumina di siero bovino (BSA).
   1. Mescolare 100 µ l di uno degli standard BSA (Vedi nota sotto) o 100 µ l di infezione (acqua dal becher contenente il pesce infetto) con 900 µ l di Bradford reagente test (il reagente di analisi della proteina di Pierce funziona bene per questo) in una cuvetta monouso. Incubare tutti i campioni a temperatura ambiente per 2 min.
      Nota: I seguenti standard di BSA sono stati utilizzati: 1.800 µ g/mL, 1.000 µ g/mL, 750 µ g/mL, 500 µ g/mL, 250 µ g/mL, 125 µ g/mL, 50 µ g/mL e 25 µ g/mL. Gli standard di BSA sono stati diluiti in acqua distillata in autoclave.
   2. Leggere il OD₆₆₀ di ogni standard o campione loro usando uno spettrofotometro.
   3. Tracciare la curva standard di BSA (OD₆₆₀vs µ g/mL). Determinare i livelli di proteina delle incognite identificando dove il OD₆₆₀ di ogni sconosciuto cade sulla curva standard BSA e leggere la concentrazione di mucina corrispondente per quel valore.
3. Misura OD₆₀₀
   Nota: La presenza di diarrea (feci nuvoloso, liquido) è visibilmente evidente dopo diverse ore e una determinazione di₆₀₀ OD semplice può essere utilizzati per quantificare questo.
   1. Capovolgere la provetta contenente l'acqua di infezione più volte per distribuire uniformemente il contenuto. Aggiungere 1 mL di campione per una cuvetta monouso. Usare 1 mL di acqua sterile infezione come controllo negativo.
   2. Eseguire una misurazione "in bianco" con lo spettrofotometro a 600 nm usando il campione di controllo negativo. Leggere ogni campione d'acqua a 600 nm e inserire i risultati.
4. Determinazione di secreti V. cholerae CFU/mL dopo una infezione
   Nota: Una componente importante della diarrea prodotto da zebrafish è escreto V. cholerae. La determinazione della CFU/mL può essere utilizzata per scopi quali stimare la replicazione batterica nel tratto intestinale di pesce e come misura di una dose infettiva negli esperimenti di trasmissione. Questa misura è meglio farlo quando un'infezione transitoria ha avuto luogo. Se viene utilizzato un infezione di 24 h, quindi questo test misurerà l'inoculo combinato più l' escreti V. cholerae.
   1. Prelevare un campione di acqua presso il punto di tempo desiderato e diluirlo in serie come descritto in precedenza.
   2. Piastra le diluizioni seriali su terreni selettivi (agar LB contenente streptomicina o un altro antibiotico appropriato o raccolte connessioni dati) e li Incubare a 30 ° C per 24 h.
   3. Contare le colonie. Calcolare il CFU per mL di acqua come descritto al punto 1.5.

Risultati

V. cholerae colonizzazione dei tratti intestinali zebrafish

Per fornire un esempio dei livelli tipici colonizzazione che osserviamo, abbiamo inoculato 5 x 10⁶ CFU di EL Tor V. cholerae ceppo pandemico N16961 in 200 mL di acqua in un becher contenente diversi zebrafish. Dopo 6 h di infezione, il pesce sono stato lavato in acqua dolce e trasferito in un becher di 200 mL di acqua in autoclave infezione com...

Discussione

Zebrafish è un relativamente nuovo modello per lo studio di V. cholerae ma molto promettente per la scoperta di futura aspetti inediti di V. cholerae biologia e patogenesi^11,12,13 . Il modello di zebrafish adulto ha i vantaggi di essere sia un naturale V. cholerae host che contiene il microbiota intestinale intatto, maturo e un modello dell'ambiente. Svantaggi del modello sono che i due fattori di vir...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument
Shaker incubator	New Brunswick Scientific, Edison, NJ	Excella E25
Incubator	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
Spectrophotometer	Thermo, Waltham, MA	Geaesys 6
Vortex homogenizer	Minibeadbeater24	112011
Weighing Machine	Ohaus, Columbia, MD	Adventurer Pro
Heat Stirer	Corning, Corning, NY	PC-420D
Burner
automated colony counter	REVSCI	120417B
Materials
400 ml glass beakers	Pyrex
perforated lids	Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons	Office Depot, Boca Raton, FL	D15-25-7008
Fish Tank System	Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier	Aqua FX	TK001
Fish net	Marina
fish food	Tetra fin
Brine Shrimp	Red jungle brand	O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels	Fine Scientific tools, Foster City, CA	10000-10
Forceps	Fine Scientific tools, Foster City, CA	11223-20
Vannas scissors	Fine Scientific tools, Foster City, CA	15000-11
2 ml screw cap tubes	Fisher Scientific, Hampton, NH	02-681-375
1 mm glass beads	Bio Spec	11079110
Glass beads for spreading	Sigma, St. Louis, MO	18406-500G
Petri plate	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1.5 ml centrifuge tube	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
50 ml centrifuge tube	Corning Falcon, Corning, NY	352098
Test tubes	Pyrex	9820
Glass Pipette	Fisher Brand, Hampton, NH	13675K
Micro pipettes	Sartorius Biohit, Göttingen, Germany	m1000/m200/m20
Tips	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline	VWR Life Science, Radnor, PA	K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma, St. Louis, MO	A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside	Sigma, St. Louis, MO	10651745001
Schiff’s reagent	Sigma, St. Louis, MO	84655-250 mL
periodic acid	Fisher Scientific, Hampton, NH	10450-60-9
Mucin from porcine stomach	Sigma, St. Louis, MO	M2378-100G
Bovine serum albumin	Fisher Scientific, Hampton, NH	9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent	Thermo, Waltham, MA	22660
LB medium
Trypton	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
Teast Extract	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NACL	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010
TCBS Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	265020
DCLS Agar	Sigma, St. Louis, MO	70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5