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요약

Zebrafish는 자연 비 브리 오 cholerae 호스트 하 고 정리 하 고 전송 식민지 로부터 전체 감염 주기를 연구 하는 데 사용 수 있습니다. 여기, V. cholerae 식민 수준을 평가 하 고 계량 zebrafish에 설사 하는 방법을 보여 줍니다.

초록

비 브리 오 cholerae 는 최고의 인간 질병 콜레라를 일으키는 전염 성 대리인 으로입니다. 인간 숙주 밖에 V. cholerae 주로 존재 수생 환경, 높은 수생 종의 다양 한 상호 작용 하는 곳에. 척 추가 있는 물고기 환경 호스트에 알려져 있습니다 그리고 자연에서 잠재적인 cholerae 대 저수지. V. cholerae와 모두 zebrafish로 일반적으로 알려진 teleost 물고기 종 Danio rerio, 인도 아 대륙에서 발생 한 수생 환경에 오랜 상호 작용을 제안. Zebrafish는 공부 하는 생물학, 전염 성 질환 등의 여러 측면에 대 한 이상적인 모델 유기 체. Zebrafish 수 있을 쉽고 빠르게 식민지 V. cholerae로 물에 노출 후. V. cholerae 여 장 식민지 설사의 생산 및 복제 cholerae V.배설 이끌어 낸다. 이러한 박테리아 수를 배설 후 새로운 물고기 호스트를 식민지로 이동. 여기, V. cholerae평가 하는 방법을 보여 줍니다-장 식민지 zebrafish에 V. cholerae계량 하는 방법-zebrafish 설사 유발. 식민 모델은 관심사의 유전자 또는 환경 생존을 위한 호스트 식민지에 대 한 중요 한 있을 수 있습니다 여부를 공부 하는 연구원에 게 유용 해야 한다. Zebrafish 설사의 정량화 zebrafish 모델 시스템으로 탐험에 관심이 어떤 장 병원 체를 공부 하는 연구자에 유용 해야 한다.

서문

비 브리 오 cholerae 산발적 설사1,2뿐만 아니라 인간의 질병 콜레라 발생 한 수생, 그램 음성 박테리아 이다. V. cholerae 종종 다른 해양 유기 체와 관련 된 전 세계의 많은 지역에서 환경에서 발견 된다. 이러한 연결 생물 등 플랑크톤, 곤충 계란 질량, 조개, 척 추가 있는 물고기 종3,,45,6,7. 여러 연구 V. cholerae 다른 지역7,8,,910에 물고기의 창 자 책자에서 고립 있다. V. cholerae의 물고기에 나타냅니다 물고기 환경 저수지로 작동할 수 있습니다. 물고기는 인 간에 게 질병을 전송 및 V. cholerae 긴장6의 지리적 확산에 연루 또한 수 있습니다.

어떻게 V. cholerae 물고기 상호 작용 이해, Danio rerio로 더 잘 알려진 zebrafish, 콜레라 대e11공부를 위한 모델 시스템으로 개발 되었습니다. Zebrafish는 남부 아시아, V. cholerae의초기 저수지 생각 된다 벵골만 지역 포함. 1817 년에 첫 콜레라 유행 성 시작, 이전 콜레라 무엇입니까 지금 인도 그리고 방글라데시 밖에 보고 되지 했다. 따라서, zebrafish, V. cholerae 거의 확실히 연관 서로 진화 시간의 척도에 그 zebrafish는 자연 환경12 V. cholerae 호스트 제안.

V. cholerae를 위한 zebrafish 모델 간단 실행 하 고 병원 성 전체를 공부 하는 데 사용 수 라이프 사이클 cholerae 대 . 물고기는 V. cholerae의알려진된 번호와 주사 된 물에 입욕 하 여 V. cholerae에 노출 됩니다. 몇 시간 장 식민지, 일어난다 뒤에 설사의 생산. 설사는 mucin, 단백질, 배설된 박테리아 및 다른 장 내용으로 이루어져 있다. 몇 가지 간단한 측정13를 사용 하 여 설사의 정도 측정할 수 있습니다. V. cholerae 감염 된 물고기에 의해 배설 되는 갈 수 있습니다 다음 순진한 물고기를 감염 감염 주기를 완료. 따라서, zebrafish 모델 cholerae 대 인간의 질병 과정12,14이.

V. cholerae 가장 자주 사용 되는 동물 모델 생쥐와 토끼14,15,16,,1718역사적으로 있다. 이러한 모델 V. cholerae pathogenesis의 우리의 지식에 추가 하는 수단이 되었습니다. 그러나, 쥐와 토끼 자연 V. cholerae 되지 않습니다 때문에 호스트, V. cholerae 라이프 사이클의 어떤 측면 공부 될 수 있는 제한이 있다. V. cholerae 식민 쥐와 토끼의 일반적으로 항생제 장 microbiota 손상 전처리 나를 장 microbiota를 필요 합니다. 두 모델 모두 gavage 소화를 박테리아를 소개 또는 직접 창 자 박테리아를 주입 하는 수술 조작 필요 합니다. 성인 물고기는 그대로 장 microbiota 쉽게 식민지 화와 감염 과정 조작 필요 없이 자연스럽 게, 발생 Zebrafish 이점을.

현재 작업 V. cholerae 감염에서 모델로 zebrafish의 사용률을 보여 줍니다. 감염, 해 부, 식민지 V. cholerae, 열거 및 V. cholerae 기인한 설사의 정량화 기술된12,13될 것입니다. 이 모델 V. cholerae 질병 프로세스와 cholerae 대 환경 생활에 관심 있는 과학자에 게 도움이 될 것입니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 웨인 주립 대학에 의해 승인 되었습니다. 이 메서드는 Runft 외 에 처음 설명 했다 12

1입니다. 장 식민지 수준 결정

참고: 창 자 식민지는 zebrafish 모델에서 가장 유용한 통계 다양 한 V. cholerae 긴장의 상대적인 적합성 또는 돌연변이 또는 유전자 녹아웃의 효과 비교 하는 데 사용할 수 있습니다.

  1. 침수로 zebrafish의 접종
    참고:이 즉, 노출의 감염의 자연 과정을 유사합니다.
    1. V. cholerae의 준비
      1. 격리 V. cholerae와 lysogeny 국물 (파운드)의 5 mL을 접종 한 파운드에서 식민지 접시 및 6-8 h (야간 문화)에 대 한 37 ° C (180 rpm)를 흔들어에서 품 어.
      2. 위의 숙박 문화 50 µ L로 250 mL 원뿔 플라스 크에 신선한 압력가 파운드 매체의 25 mL 접종 16-18 h 37 ° C (150 rpm)를 떨고에 대 한 그것을 품 어.
      3. 600에서 광학 밀도 읽고 mL 당 박테리아의 수를 추정 하는 야간 문화의 1/10 희석의 nm (OD600) (OD600 = 1 ~ 109 CFU/mL 이다.)
      4. 피 펫과 미디어 10 분 제거에 대 한 6000 g에서 원심 분리 하 여 셀을 수확 하거나 살 균 제 솔루션으로 그것을 부 어. 1 x 1010 ml PBS의 1 x 107 사이 일반적으로 원하는 농도에 살 균 PBS에 셀 resuspend
        참고: 여기, 우리가 압력가 역방향 삼 투 물 살 균 감염 물 60 mg/L 바다 소금 포함를 참조.
    2. 접종 및 배양
      1. 살 균 감염 물 200 mL를 포함 하는 400 mL 비 커에 4 개 또는 5 개의 zebrafish를 놓습니다.
      2. 감염 물 200 mL에 원하는 감염 농도 (일반적으로 5 x 104 5 x 107 CFU/mL)를 (에서 단계 1.1.1.4.) V. cholerae의 1 mL를 추가 합니다.
      3. 밖으로 점프에서 물고기를 방지 하기 위해 구멍이 뚫린된 뚜껑으로 비 커를 커버 200 µ L 팁 상자 상단의 이것을 위해 잘 작동합니다.
      4. 각 비 커에 레이블을 고 그들 유리 전면 인큐베이터 28 ° C에 실험의 기간에 대 한 설정 합니다.
    3. 일시적인 노출에 대 한 절차
      참고: inoculating 박테리아의 제거 다음 V. cholerae (일반적으로 6 h)에 일시적인 노출은 전송 공부 및 배설된 박테리아의 더 정확한 정량화에 대 한 유용 합니다.
      1. 노출의 6 h 후 엄마 랑 물고기를 수집을 통해 비 커 물 밖으로 붓는 다. 표 백제는 V. cholerae죽 일 용기에 감염 된 물을 삭제 합니다.
      2. 살 균 감염 물 200 mL의 비 커에 제거 된 물고기를 놓습니다. 물고기에서 표면 박테리아를 제거 하는 5 분이 깨끗 한 물에서 수영 하는 물고기를 허용 합니다.
      3. Net 절차 (1.2.2 단계)를 반복 하 고 200 살 균 감염 물의 새로운 비 커에 물고기를 놓습니다. 실험의 기간에 대 한이 비 커에서 물고기를 유지.
  2. 안락사
    1. 실험은의 원하는 끝점에 도달 하면 감염의 샘플에 물을 받아 (15 mL 보통 충분 한) 수 있도록 배설된 세균 수와 측정 (mucin 분석 결과, 단백질 콘텐츠, 마약 등), 설사의 경우 원하는 (2 절).
    2. 엄마 랑 (물고기를 수집)를 통해 물의 나머지를 붓고 표 백제는 V. cholerae 물에서 죽 일.
    3. 감염 물 플러스 에틸 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine)의 336 µ g/mL를 포함 하는 비 커에 생선을 놓고 실시간에 20 분이 tricaine 솔루션에 물고기를 품 어
      참고:는 어망 10% 표 백제 솔루션으로 살 균 되었다.
  3. 해 부
    1. 물고기의 준비
      1. 일회용 플라스틱 숟가락으로 tricaine 솔루션에서 물고기를 푸 고 해 표면에 놓습니다.
      2. 위치와 그것의 복 부 측에 위쪽으로 직면 핀 물고기 핀의 무뚝뚝한 끝과 아래 턱을 통해 신체의 중심에서 각도입니다. 또 다른 핀 장소 그냥 시체에서 각도 또한 항문 후부.
    2. 장로의 노출
      1. 70% 에탄올에 보풀 지우기와 물고기의 복 부 표면 면봉.
      2. 70% 에탄올에 담그고와 그들을 불타는 메스와 욕실이 위를 소독.
      3. 비늘을 관통 하 고 메스를 사용 하 여 피부 바로 아래에 세로로 작은 절 개를 확인 합니다. 조심 하지 너무 깊게 잘라 창 자 피부 바로 아래 위치 하 고 있습니다.
      4. 가 위를 사용 하 여 신중 하 게 몸, 피부 수준 보다 더 깊은 절단 및 항문 피하의 길이 따라 절 개를 확장 합니다.
      5. 절 개 개방 수 있도록 생선의 머리 쪽으로 위 두 측면 컷을 확인 합니다.
      6. 본문에서, 핀 낚시 해 표면에 측면 절 개의 각 측에 피부를 고정 합니다.
        참고: 핀의 끝은 알코올로 그들을 불타는 의해 이전 멸 균.
    3. 창 자 제거
      참고: 창 자는 다른 기관 위에 창백 하 고, 매우 얇은 튜브로 표시 되어야 합니다.
      1. 화 염 소독 된 집게 하 고 전체 장로 (일반적으로 길이 12-15mm)를 제거 하려면 그들을 사용 하 여. 유리 구슬 (단계 1.4.1–1.4.2 참조) 및 PBS 또는 얼음에 파운드 x 1의 1 mL를 포함 하는 균질 관으로 소장을 놓습니다.
  4. 균질
    1. 준비 균질 튜브 사전에 따르는 ~1.5 g 1 m m 유리 구슬의 2 mL에 스크류 캡 튜브 (채우려는 약 절반 방법) 하 고 압력가 마로 소독 하 여 그들을 소독.
    2. 살 균 파운드 또는 1 x PBS의 1 mL를 추가 합니다.
    3. 일단 제 브라 내장 추가 (단계 1.3.3.1) 관에, 나사 모자에 매우 긴밀 하 게, 그리고 소용돌이 균질 화기에 튜브 고정.
    4. 1 분 최대 설정에 대 한 샘플을 균질 다음 멋진 ice 1-2 분에 사이클을 반복이 균질 한 번 더 완전 한 균질에 대 한.
      참고: 균질에 대 한 여러 가지 대체 방법을 작동 합니다.
  5. 장 식민지 수준 측정
    1. 각 튜브를 파운드 또는 1 x PBS의 900 µ L을 추가 하 여 (작은 유리 시험관 또는 1.5 mL microcentrifuge 튜브) 튜브는 homogenate의 직렬 희석에 대 한 준비. 각 물고기에 대 한 5-6 튜브를 준비 하 고 첫 번째 튜브에 homogenate의 100 µ L을 추가 하 여 장 homogenate의 10 연속 희석 하 게 vortexing 혼합, 및 다음 두 번째 튜브를 첫 번째 관에서 100 µ L을 추가.
    2. 이 절차를 반복 하 여 모든 희석 준비 되었습니다.
    3. 100-200 µ L 파운드 한 천 배지 100 µ g/mL 스 (스 내성 변종을 사용) 하는 경우의 및 X-걸 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)의 40 µ g/mL에 각 희석의 접시 16-18 h 30 ° C에서 번호판을 품 어.
    4. 하룻밤 배양 후 플레이트, 자동된 식민지 카운터를 사용 하거나 수동으로 식민지; 계산에 식민지 V. cholerae 계산 마커 팁 계산된 식민지를 표시 하는 데 도움이 됩니다.
    5. 생선 내장 당 CFU 도금 했다 볼륨을 고려, 현 탁 액의 희석 비율 접시 수를 곱하여 결정 합니다.

2입니다. 물고기 설사의 측정

참고: 4 개의 서로 다른 통계 물고기 설사를 평가 하기 위해 사용 되었다: 물, 물, 물13물, 그리고는 V. cholerae CFU의 OD600 에서 전반적인 배설된 단백질 수준에서 mucin 수준. 설사는 일반적으로 시각적으로 분명 하 게 된다 V. cholerae 위에서 설명한 대로 하는 제 브라의 노출 후에 대략 6 h.

  1. Mucin 수준을 결정합니다
    참고: Mucin 분 비 V. cholerae 식민 동안 유도 하 고 배설 수준, 특히 초기 감염13의 좋은 측정 이다. Mucin 분석 결과 결정 정기 산 Schiff 분석 결과19에 변형입니다.
    1. 다음 재료 준비: 50% (w/v) 정기 산 재고 솔루션 및 0.1% 주기 산 작업 솔루션 (7% 아세트산 5 mL에 추가 50% 정기 산 주식의 10 µ L-후 즉시 사용), mucin 표준, 96-잘 결정 접시, Schiff의 시 약입니다.
      1. 나트륨 아세테이트 버퍼 (100 m m 나트륨 아세테이트, 5 m m EDTA, pH 5.5와 빙 초 산)에서 (돼지 위 유형 III)에서 mucin의 다음과 같은 금액을 일시 중단 하 여 준비 하는 mucin 표준: 400 µ g/mL, 300 µ g/mL, 200 µ g/mL, 150 µ g/mL 100 µ g/mL, 75 µ g/mL, 50 µ g/mL, 25 µ g/mL, 및 10 µ g/mL.
        감염의 100 µ L을 추가 하 여 다음과 같이 분석 결과에 사용 될 각 우물에 물 접시를 준비: 1 x PBS; 공백 위에서 설명한 대로 mucin 표준 또는 물고기 감염에서 물 샘플. 3 중에서 각 샘플을 할.
    2. 각 잘 멀티 채널 피 펫을 몇 번 위아래로 pipetting으로 혼합 신선한 0.1% 주기 산 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.
    3. 플라스틱 포장에 접시를 단단히 포장 하 고 그것을 1-1.5 h 37 ° C에서 품 어.
    4. 각 잘, 그리고 그것을 혼합 하는 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 Fuchsin 솔루션 (Schiff의 시 약)의 5-10 분 추가 100 µ L에 대 한 실 온으로 접시를 쿨.
    5. 플라스틱 포장에 접시를 포장 하 고 색상을 개발 했다;까지 락 플랫폼에서 실내 온도에 그것을 품 어 색상은 일반적으로 20 분 560에서 흡 광도 읽고 내 개발 nm 플레이트 리더를 사용 하 여.
    6. 플롯 mucin 표준 곡선 (OD560대 µ g/mL mucin 표준). 각 알 수 없의는 OD560 표준 곡선에 내리는 식별 하 고 해당 값에 대 한 해당 mucin 농도 읽고 여 신원 미상의 mucin 레벨을 결정 합니다.
  2. 단백질 수준을 결정합니다
    참고: mucin, 외 물에 전체 단백질 수준은 설사 (흐림, 액체의 자)는 물고기에 의해 생산의 수준에 대 한 다른 프록시입니다. 이 절차 표준 Bradford 분석 실험을 사용 하 여 단백질 수준 추정. 단백질 레벨은 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 표준 곡선에 따라 견적 된다.
    1. 혼합 (아래 참고 참조) BSA 기준 중 하나의 100 µ L 또는 감염 물 (감염 된 물고기를 포함 하는 비이 커에서 물) 100 µ L 브래드포드의 900 µ L 일회용 cuvette에 (이것을 위해 잘 작동 하는 피어스 단백질 분석 실험 시 약) 분석 실험 시 약. 2 분 동안 실 온에서 모든 샘플을 품 어.
      참고: 다음 BSA 기준 사용 되었다: 1, 800 µ g/mL, 1000 µ g/mL, 750 µ g/mL, 500 µ g/mL, 250 µ g/mL, 125 µ g/mL, 50 µ g/mL, 및 25 µ g/mL. BSA 기준 압력가 증류수에 희석 됐다.
    2. 각 표준의 OD660 읽거나는 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플.
    3. 플롯 표준 BSA 곡선 (OD660대 µ g/mL). 신원 미상 식별 하 여 각 알 수 없의는 OD660 표준 BSA 곡선에 고 읽고 해당 값에 대 한 해당 mucin 농도의 단백질 수준을 결정 합니다.
  3. 측정 세600
    참고: 여러 h 및 간단한 세600 결정이 척도를 사용할 수 있습니다 후 설사 (흐림, 액체의 자)의 존재 가시 분명 하다.
    1. 균일 하 게 배포 내용을 여러 번 감염 물에 들어 있는 튜브를 반전. 일회용 cuvette을 물 샘플의 1 mL를 추가 합니다. 살 균 감염 물 1 mL를 사용 하 여 부정적인 제어로.
    2. "빈" 측정 600에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 수행 nm 부정적인 컨트롤 샘플을 사용 하 여. 600 nm 및 기록에서 각 물 샘플을 읽고 결과.
  4. 감염 후 V. cholerae CFU/mL을 배설
    참고: 설사는 zebrafish에 의해 생산의 주요 구성 요소는 배설 cholerae 대. CFU/mL의 결정 생선 창 자에 박테리아 복제 전송 실험에서 감염 복용량의 예측 같은 목적을 위해 사용할 수 있습니다. 이 측정은 최고의 자리를 차지 하는 일시적인 감염 때 이루어집니다. 24 h 감염을 사용 하는이 분석 결과 결합된 inoculum 플러스는 배설 V. cholerae측정할 것 이다.
    1. 원하는 시간 지점에서 물 샘플을 받아 그리고 연속적으로 앞에서 설명한 대로 희석.
    2. 선택적인 매체 (파운드 천 스 또는 다른 적절 한 항생제 또는 DCL 포함)에 직렬 희석 접시 하 고 24 시간 30 ° C에서 그들을 품 어.
    3. 식민지를 계산 합니다. 1.5 단계에서 설명한 대로 물의 mL 당 CFU를 계산 합니다.

결과

V. cholerae zebrafish 장 책자의 식민

우리가 관찰 하는 전형적인 식민 레벨의 예를 제공 하려면 우리 5 x 106 CFU 유행 성 엘 토르 V. cholerae 긴장의 N16961 여러 zebrafish를 포함 하는 비 커에 물 200 mL에 접종. 감염의 6 h 후 생선 신선한 물에 씻 겨 되었고 프로토콜에 설명 된 대로 압력가 감염 물 200 mL의 비 커에 전송. 18 h...

토론

Zebrafish는 V. cholerae 공부에 대 한 상대적으로 새로운 모델 이지만 cholerae 대 생물학과 병 인11,,1213 의 이전에 알려지지 않은 측면의 미래의 발견에 대 한 많은 약속을 보유 하 고 . 성인 zebrafish 모델은 모두 자연의 장점이 그대로, 성숙한 장 microbiota 및 환경 모델 포함 V. cholerae 호스트. 모델의 두 가지 주요 인?...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

감사 합니다 멜로디 Neely, 존 앨런, 바젤 Abuaita, 그리고 zebrafish 모델을 개발 하는 데 그들의 노력에 대 한도 나 Runft. 여기에서 보고 된 연구는 알레르기 국립 연구소와 전염병의 수상 번호 R21AI095520 및 R01AI127390 (제프리 H. Withey) 하에서 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Instrument
Shaker incubatorNew Brunswick Scientific, Edison, NJExcella E25
IncubatorNUAIRE, Plymouth, MNAuto Flow
SpectrophotometerThermo, Waltham, MAGeaesys 6
Vortex homogenizerMinibeadbeater24112011
Weighing MachineOhaus, Columbia, MDAdventurer Pro
Heat StirerCorning, Corning, NYPC-420D
Burner
automated colony counterREVSCI120417B
Materials
400 ml glass beakersPyrex
perforated lidsMicrotip holder with holes from tip box
disposable plastic spoonsOffice Depot, Boca Raton, FLD15-25-7008
Fish Tank SystemAquaneering, San Diego, CA
RO Water PurifierAqua FXTK001
Fish netMarina
fish foodTetra fin
Brine ShrimpRed jungle brandO.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
ScalpelsFine Scientific tools, Foster City, CA10000-10
ForcepsFine Scientific tools, Foster City, CA11223-20
Vannas scissorsFine Scientific tools, Foster City, CA15000-11
2 ml screw cap tubesFisher Scientific, Hampton, NH02-681-375
1 mm glass beadsBio Spec11079110
Glass beads for spreadingSigma, St. Louis, MO18406-500G
Petri plateFisher Brand, Hampton, NHFB0875713
1.5 ml centrifuge tubeMidsci, Valley Park, MOAVSS1700
50 ml centrifuge tubeCorning Falcon, Corning, NY352098
Test tubesPyrex9820
Glass PipetteFisher Brand, Hampton, NH13675K
Micro pipettesSartorius Biohit, Göttingen, Germanym1000/m200/m20
TipsGenesee Scientific, San Diego, CA24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered salineVWR Life Science, Radnor, PAK813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate saltSigma, St. Louis, MOA5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosideSigma, St. Louis, MO10651745001
Schiff’s reagentSigma, St. Louis, MO84655-250 mL
periodic acidFisher Scientific, Hampton, NH10450-60-9
Mucin from porcine stomachSigma, St. Louis, MOM2378-100G
Bovine serum albuminFisher Scientific, Hampton, NH9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay ReagentThermo, Waltham, MA22660
LB medium
TryptonBD Biosciences, San Jose, CA211705
Teast ExtractBD Biosciences, San Jose, CA212750
NACLFisher Scientific, Hampton, NHBP358-212
AgarBD Biosciences, San Jose, CA214010
TCBS AgarBD Biosciences, San Jose, CA265020
DCLS AgarSigma, St. Louis, MO70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5

참고문헌

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