Iniezione di acido oleico in maiali come modello per la sindrome da Distress respiratorio

Riepilogo

In questo articolo, presentiamo un protocollo per indurre lesioni polmonari acute nei suini tramite l'iniezione venosa centrale di acido oleico. Si tratta di un modello animale stabilito per lo studio della sindrome da distress respiratorio (ARDS).

Abstract

La sindrome da distress respiratorio acuta è una malattia di rilevanti intensiva con un'incidenza compresa tra 2,2% e 19% dei pazienti di terapia intensiva. Nonostante i progressi del trattamento negli ultimi decenni, ARDS pazienti soffrono ancora i tassi di mortalità tra i 35 e 40%. C'è ancora una necessità di ulteriori ricerche migliorare l'outcome dei pazienti affetti da ARDS. Un problema è che nessun singolo modello animale può imitare il pathomechanism complesso della sindrome da distress respiratorio, ma esistono diversi modelli per studiare le diverse parti di esso. Iniezione di acido oleico (OAI)-ferita indotta del polmone è una modella ben affermata per studiare strategie di ventilazione, distribuzione di meccanica e ventilazione/perfusione polmonare negli animali. OAI conduce allo scambio di gas gravemente compromessa, deterioramento della meccanica polmonare e rottura della barriera alveolo-capillare. Lo svantaggio di questo modello è la controversa rilevanza meccanicistica di questo modello e la necessità di accesso venoso centrale, che è una sfida soprattutto in modelli animali più piccoli. In sintesi, OAI-indotta del polmone ferita conduce a risultati riproducibili in piccoli e grandi animali e quindi rappresenta un modello particolarmente adatto per lo studio di ARDS. Tuttavia, ulteriore ricerca è necessaria per trovare un modello che imita tutte le parti di ARDS e manca i problemi associati con i diversi modelli esistenti oggi.

Introduzione

La sindrome da distress respiratorio (ARDS) è una sindrome di cure intensive che è stato ampiamente studiata dalla relativa prima descrizione circa 50 anni fa¹. Questo corpo di ricerca hanno portato a una migliore comprensione della patofisiologia e provoca lo sviluppo di ARDS conseguente migliore cura del paziente e risultato^2,3. Tuttavia, la mortalità nei pazienti affetti da ARDS rimane molto alta con circa 35-40%^4,5,6. Il fatto che circa il 10% dei ricoveri di ICU e il 23% dei pazienti di ICU che richiedono la ventilazione meccanica è a causa di ARDS sottolinea la rilevanza per ulteriori ricerche in questo campo.

Modelli animali sono ampiamente utilizzati nella ricerca per esaminare i cambiamenti patofisiologici e potenziali modalità di trattamento per i diversi tipi di malattie. A causa della complessità di ARDS, non esiste nessun singolo modello animale di imitare questa malattia, ma diversi modelli che rappresentano diversi aspetti⁷. Un modello ben consolidato è iniezione di acido oleico (OAI)-ha indotto la lesione del polmone. Questo modello è stato utilizzato in una vasta gamma di animali, tra cui topi⁸, ratti⁹, maiali¹⁰, cani¹¹e pecore¹². L'acido oleico è un acido grasso insaturo e l'acido grasso più comune nel corpo di esseri umani sani¹³. È presente nel plasma, le membrane cellulari e del tessuto adiposo umano¹³. Fisiologicamente, è associato all'albumina mentre è trasportato attraverso il flusso sanguigno¹³. Aumento dei livelli di acidi grassi nel sangue è associati con diverse patologie e la gravità di alcune malattie correla con livelli di siero acido grasso¹³. L'acido oleico ARDS-modello è stato sviluppato nel tentativo di riprodurre ARDS causato da embolia lipidica, come si è visto in pazienti di trauma¹⁴. L'acido oleico ha effetti diretti su recettori immuni innati nel polmoni¹³ e trigger l'accumulazione del neutrofilo¹⁵, mediatore infiammatorio produzione¹⁶e delle cellule morte¹³. Fisiologicamente, acido oleico induce velocemente di progressione ipossiemia, aumento della pressione arteriosa polmonare e l'accumulo di acqua polmonare extravascolare. Inoltre, induce ipotensione arteriosa e depressione del miocardio⁷. Gli svantaggi di questo modello sono la necessità di accesso venoso centrale, la dubbia rilevanza meccanicistica e il potenziale progresso letale causata da rapida ipossiemia e depressione cardiaca. Il vantaggio di questo modello rispetto ad altri modelli è l'usabilità in piccoli e grandi animali, la riproducibilità valido dei meccanismi fisiopatologici in ARDS, l'inizio acuto di ARDS dopo l'iniezione di acido oleico, e la possibilità di studiare isolato ARDS senza infiammazione sistemica come molti altri sepsi modelli⁷. Nel seguente articolo, diamo una descrizione dettagliata della ferita polmonare indotta da acido oleico nei suini e fornire dati rappresentativi per caratterizzare la stabilità dei compromessi nella funzione polmonare. Esistono diversi protocolli per la ferita di polmone OAI-indotta. Il protocollo fornito qui è in grado di indurre in modo affidabile il danno polmonare acuto.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti qui sono stati approvati dal Comitato istituzionale e statale cura degli animali (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Coblenza, Germania; numero di omologazione G14-1-077) e sono stati condotti in conformità con le linee guida della Società europea e tedesca delle scienze animali di laboratorio. Gli esperimenti sono stati condotti in suini maschi anestetizzati (sus scrofa domestica) di età 2-3 mesi, peso kg 27-29.

1. anestesia, l'intubazione e ventilazione meccanica

1. Trattenere il cibo per 6 ore prima dell'anestesia per ridurre il rischio di aspirazione, ma consentire il libero accesso all'acqua per ridurre lo stress.
2. Per la sedazione, iniettare una combinazione di ketamina (4 mg kg^-1) e Azaperone (8 mg kg^-1) nel collo o il muscolo del gluteo del maiale con un ago per iniezione intramuscolare (20 G) mentre l'animale è nella finestra di animale.
   Attenzione: Usare i guanti quando si lavora con l'animale.
3. Inserire il catetere vena periferica (20 G) in una vena dell'orecchio dopo disinfezione locale con alcool.
4. Iniettare fentanil (4 µ g kg^-1), propofol (3 mg kg^-1) e atracurium (0,5 mg kg^-1) per via endovenosa per l'induzione dell'anestesia.
5. Quando il maiale smette di respirare, posto in posizione supina sulla barella e immobilizzare esso con bende.
6. Iniziare a monitorare la saturazione periferica di ossigeno (SpO₂) fissando il sensore su uno delle orecchie o la coda dell'animale.
7. Ventilare il maiale con una maschera per la ventilazione cani, taglia 2, con un picco di pressione inspiratoria sotto 20 cm H₂O, un positivo fine pressione espiratoria (PEEP) di 5 cm H₂O, una frequenza respiratoria di 14-16/min e una frazione inspiratoria di ossigeno (FiO₂) di 1.0.
8. Iniziare un'infusione continua con soluzione elettrolitica equilibrata (5 mLkg^-1 h^-1), propofol (8-12 mg kg^-1 h^-1) e del fentanyl (0.1-0.2 mg kg^-1 h^-1) per mantenere l'anestesia.
9. Per l'intubazione, preparare un comune tubo endotracheale adatto per l'animale (ad es., peso di 25-30 kg, diametro interno del tubo endotracheale (ID) 6-7 mm) armati con tubo endotracheale introduttore e un laringoscopio comune con un Macintosh lama 4.
   Nota: Due persone sono necessari per l'intubazione.
10. Persona 1: Tirare fuori la linguetta con una mano e premere il muso dorsalmente con l'altro.
11. Persona 2: Inserire il laringoscopio e come al solito farlo avanzare fino a visualizzare l'epiglottide.
12. Tirare il laringoscopio ventralmente per visualizzare le corde vocali.
    Nota: A volte l'epiglottide "si attacca" a Palatino morbido. In questo caso, mobilitare e con la punta del tubo.
13. Inserire il tubo attraverso le corde vocali e tirare fuori l'introduttore.
14. Bloccare il manicotto del tubo con una siringa con 10 mL di aria.
15. Collegare il tubo al ventilatore.
16. Verificare il corretto posizionamento del tubo di esalazione regolare di anidride carbonica (CO₂) con capnografia e ventilazione uguale di entrambi i polmoni con l'auscultazione.
17. Iniziare la ventilazione meccanica (tidal volume 6-8 mL/kg, positivo PEEP 5 cm H₂0, FiO₂ per mantenere la saturazione periferica dell'ossigeno (SpO₂) tra il 94-98%¹⁷, frequenza respiratoria per mantenere la pressione delle maree fine di biossido di carbonio (etCO ₂) tra 35 – 45 mmHG).

2. Strumentazione

1. Arti posteriori con bende per tendere la pelle sopra l'area femorale per cateterismo necessarie navi si ritraggono.
2. Preparare una siringa da 5 mL, una siringa da 10 mL, ago di un Seldinger, 3 guaine introduttore (5 Fr, 6 Fr, 8 Fr) con guide metalliche orientabili, un catetere venoso centrale con 3 porte (7 Fr, 30cm) con filo guida e un catetere arterioso polmonare (7,5 Fr, 110 cm).
3. Generosamente disinfettare la zona femorale con disinfettante della pelle applicando una tecnica di strofinare.
4. Riempire completamente i catetere con soluzione fisiologica.
5. Posizionare la sonda ad ultrasuoni sul legamento inguinale destra e scansione per vasi femorali.
6. Ruotare la sonda di 90° per visualizzare completamente l'arteria femorale in asse lungo.
7. Incannulare arteria femorale di destra sotto visualizzazione ad ultrasuoni in linea con l'ago di Seldinger.
   Nota: Ci sono diversi modi per ottenere l'accesso vascolare con o senza ultrasuoni. Ultrasuono-guida di incannulamento vascolare non è necessario per questo modello.
8. Quando il pulsante luminoso sangue scorre fuori, introdurre il filo guida e ritrarre l'ago.
9. Visualizzare la vena femorale e incannulare la vena sotto visualizzazione ad ultrasuoni in linea e aspirazione continua con l'ago.
10. Quando il sangue venoso è aspirabili, scollegare la siringa e inserire il filo guida.
11. Ritirare l'ago.
12. Controllare la posizione dei fili con l'ultrasuono.
13. Inserire l'introduttore arterioso (5 Fr) e catetere venoso centrale utilizzando la tecnica di Seldinger (per maggiori dettagli sulla tecnica di Seldinger, vedere Metodo pubblicato¹⁸).
14. Ripetere la puntura arteriosa e venosa su altro lato e inserire le guaine di introduttore con tecnica di Seldinger´s, come descritto in precedenza (arteria 6 Fr, vena 8 Fr).
15. Collegare l'introduttore arterioso e il catetere venoso centrale ad un sistema di trasduttore adatto all'attrezzatura.
16. Calibrare il monitoraggio invasivo contro atmosfera (zero) aprendo i tre-modo-rubinetti di arresto per l'atmosfera e premere Zero tutto sul monitor.
17. Tornare indietro tre-modo-Rubinetti per misurare emodinamica.
18. Avviare il monitoraggio emodinamica.
19. Posizionare tutti i trasduttori di pressione all'altezza dell'atrio destro.
20. Passare l'infusione di propofol (8-12 mg kg^-1 h^-1) e del fentanyl (0.1-0.2 mg kg^-1 h^-1) a una delle porte della linea venosa centrale per mantenere l'anestesia.

3. ultraveloce misurazione della pressione parziale dell'ossigeno (pO₂)

Nota: La misurazione della pO₂ con la sonda per ultraveloce pO₂-misurazione non è obbligatorio ma aiuta a visualizzare le modifiche in tempo reale a pO2.

1. Aprire il software NeoFox visualizzatore e fare clic su Opzioni.
2. Scegliere la scheda di calibrazione e fare clic sul pulsante di Calibrazione aperta .
3. Scegliere file di calibrazione e fare clic su Apri e Scarica.
4. Confermare la finestra popup facendo clic su Sì.
5. Aprire la finestra di dialogo Opzioni .
6. Scegliere la scheda di calibrazione e fare clic su calibrazione a punto singolo.
7. Immettere 21% nel campo dell'ossigeno e la temperatura nel campo di temperatura.
8. Fare clic su uso corrente Tau e scaricare. In seguito, confermare la finestra popup facendo clic su Sì.
9. Inserire la sonda per misure ultraveloce di pO₂ attraverso l'introduttore arterioso sinistro.

4. INSERIMENTO DEL CATETERE DELL'ARTERIA POLMONARE

1. Verifica il palloncino del catetere arterioso polmonare per danni.
2. Connettersi al sistema di trasduttore adatto all'attrezzatura.
3. Calibrare la pressione arteriosa polmonare monitoraggio contro l'atmosfera (zero) aprendo il rubinetto a tre vie per l'atmosfera e premere Zero sul monitor.
4. Girare il rubinetto a tre vie indietro per misurare la pressione arteriosa polmonare.
5. Avviare il monitoraggio della pressione arteriosa polmonare.
6. Inserire il catetere arterioso polmonare attraverso l'introduttore venoso sinistro (palloncino sgonfiata).
7. Quando il catetere dell'arteria polmonare è passato attraverso l'introduttore, gonfiare il palloncino con 1 mL di aria.
8. Far avanzare il catetere dell'arteria polmonare e monitorare le forme d'onda tipiche (vasi venosi, atrio destro, ventricolo destro, arteria polmonare e la pressione di cuneo capillare polmonare). Sgonfiare il palloncino e verificare, se è possibile aspirare il sangue attraverso tutte le porte del catetere dell'arteria polmonare.
   Nota: per istruzioni dettagliate su come inserire il catetere arterioso polmonare, fare riferimento alla precedente pubblicazione¹⁹.

5. l'induzione di danno polmonare

1. Preparare la soluzione di acido oleico: 0,1 mL kg^-1 di acido oleico in un 20ml siringa e collegarlo a un rubinetto a 3 vie.
2. Assumere 2 mL di sangue in un'altra siringa da 20 mL e aggiungere soluzione fisiologica per un volume totale di 20 mL in entrambi siringhe.
3. Collegare anche la seconda siringa al rubinetto a 3 vie.
   Attenzione: Utilizzare guanti e occhiali protettivi quando si lavora con acido oleico.
4. Preparare la norepinefrina (0,1 mg/mL) per infusione continua e per iniezione in bolo (10 µ g/mL).
5. Collegare la pompa a siringa noradrenalina a una delle porte del catetere venoso centrale senza avviarla.
6. Avviare l' ultraveloce pO₂-misura.
7. Prima dell'induzione del danno polmonare, registrare i valori (baseline) da tutti i parametri rilevanti.
8. Impostare il F_ioO₂ 1.0 e condurre una manovra di reclutamento del polmone (altopiano pressione 40 cm H₂O per 10 s).
9. Collegare il rubinetto a 3 vie alla porta prossimale del catetere dell'arteria polmonare.
10. Miscelare bene l'acido oleico e la miscela di sangue/saline, iniettando ripetutamente da una siringa a altra tramite il rubinetto a 3 vie e mantenere tutto il tempo di miscelazione.
11. Quando si tratta di un'emulsione omogenea, iniettare 2 mL di emulsione e continuare a mescolare.
    Nota: Se la miscelazione viene arrestato, l'emulsione può separare in un lipofilico e una parte idrofila.
12. Seguire da vicino l'emodinamica dopo l'iniezione di acido oleico e tenere a portata di mano la norepinefrina. Se necessario, dare noradrenalina come iniezione in bolo (10 – 100 µ g) o l'infusione continua per mantenere la pressione arteriosa media superiore a 60 mmHg.
13. Ripetere l'iniezione di 2 mL di soluzione ogni 3 minuti fino a quando la pressione parziale arteriosa di ossigeno (PaO₂) / FiO₂-rapporto è inferiore a 200 mmHg.
14. Se la siringa è vuota prima del PaO₂stato₂-rapporto tra 100 e 200 mmHg, preparare 2 siringhe più come descritto al punto 5.1.
15. Attendere 30 min e rivalutare il PaO₂stato₂-rapporto. Se è ancora oltre 200 mmHg, ripetere i passaggi da 5.5-5.8 fino al PaO₂stato₂-rapporto è compreso tra 100 e 200 mmHg.
16. Se PaO₂stato₂-rapporto è tra 100 e 200 mmHg, aspettare 30 minuti e verificare nuovamente.
17. Se è persistente inferiore a 200 mmHg avviare esperimento per trattamenti e massaggi, altrimenti preparare 2 siringhe più come descritto al punto 5.1 e ripetere i passaggi 5.5-5,9.
18. Impostare la ventilazione secondo i suggerimenti dalla rete ARDS²⁰.

6. fine dell'esperimento e l'eutanasia

1. Iniettare 0,5 mg di fentanil inoltre al continuo anestesia e attendere per 5 min. iniettare 200 mg di propofol e 40 mmol di cloruro di potassio per eutanasia animale in anestesia profonda.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

PaO₂stato₂-rapporto diminuisce dopo l'applicazione frazionata di acido oleico (Figura 1). Nello studio presentato, 0,185 ± 0,01 ml kg^-1 acido oleico era necessaria per l'induzione di danno polmonare. Tutti gli animali hanno mostrato un'alterata ossigenazione dopo l'induzione di danno polmonare, con varietà nel tempo ulteriore corso. In animale 1 e 3, è rimasto a un livello con piccole fluttuazioni; in animali 2, si osserva ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

In questo articolo viene descritto un metodo della lesione di polmone indotta da acido oleico come modello per studiare i vari aspetti della ARDS grave. Ci sono anche altri protocolli con emulsioni differenti, differenti siti di iniezione e diverse temperature dell'emulsione^{23,24,25,26,27,28 ,29<...}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-way-stopcock blue	Becton Dickinson Infusion Therapy AB Helsingborg, Sweden	394602
3-way-stopcock red	Becton Dickinson Infusion Therapy AB Helsingborg, Sweden	394605
Atracurium	Hikma Pharma GmbH , Martinsried	4262659
Canula 20 G	Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain	301300
Datex Ohmeda S5	GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland
Desinfection	Schülke & Mayr GmbH, Germany	104802
Endotracheal tube	Teleflex Medical Sdn. Bhd, Malaysia	112482
Endotracheal tube introducer	Rüsch	5033062
Engström Carestation	GE Heathcare, Madison USA
Fentanyl	Janssen-Cilag GmbH, Neuss
Gloves	Paul Hartmann, Germany	9422131
Incetomat-line 150 cm	Fresenius, Kabi Germany GmbH	9004112
Ketamine	Hameln Pharmaceuticals GmbH
Laryngoscope	Teleflex Medical Sdn. Bhd, Malaysia	671067-000020
Logical pressure monitoring system	Smith- Medical Germany GmbH	MX9606
Logicath 7 Fr 3-lumen 30cm	Smith- Medical Germany GmbH	MXA233x30x70-E
Masimo Radical 7	Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA
Mask for ventilating dogs	Henry Schein, Germany	730-246
Neofox Kit	Ocean optics Largo, FL USA	NEOFOX-KIT-PROBE
Norepinephrine	Sanofi- Aventis, Seutschland GmbH	73016
Oleic acid	Applichem GmbH Darmstadt, Germany	1,426,591,611
Original Perfusor syringe 50ml Luer Lock	B.Braun Melsungen AG, Germany	8728810F
PA-Katheter Swan Ganz 7,5 Fr 110cm	Edwards Lifesciences LLC, Irvine CA, USA	744F75
Percutaneous sheath introducer set 8,5 und 9 Fr, 10 cm with integral haemostasis valve/sideport	Arrow international inc. Reading, PA, USA	AK-07903
Perfusor FM Braun	B.Braun Melsungen AG, Germany	8713820
Potassium chloride	Fresenius, Kabi Germany GmbH	6178549
Propofol 2%	Fresenius, Kabi Germany GmbH
Saline	B.Braun Melsungen AG, Germany
Sonosite Micromaxx Ultrasoundsystem	Sonosite Bothell, WA, USA
Stainless Macintosh Size 4	Teleflex Medical Sdn. Bhd, Malaysia	670000
Sterofundin	B.Braun Melsungen AG, Germany
Stresnil 40mg/ml	Lilly Germany GmbH, Abteilung Elanco Animal Health
Syringe 10 mL	Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain	309110
Syringe 2 mL	Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain	300928
Syringe 20 mL	Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain	300296
Syringe 5 mL	Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain	309050
venous catheter 22G	B.Braun Melsungen AG, Germany	4269110S-01