Visual condizionamento classico in legna formiche

Riepilogo

Vi presentiamo un protocollo per il condizionamento classico di formiche bardati che permette ai ricercatori di studiare la formazione apprendimento e la memoria visiva a un livello di analisi non è possibile con gli individui liberi di muoversi.

Abstract

Parecchie specie di insetti sono diventati sistemi modello per lo studio della formazione di apprendimento e memoria. Anche se molti studi si concentrano su animali liberi di muoversi, studi paradigmi di condizionamento classico con insetti bardati di esecuzione sono stati importanti per indagare i segnali esatti che gli individui imparano e i meccanismi neurali alla base di apprendimento e Formazione di memoria. Qui presentiamo un protocollo per evocare visual apprendimento associativo in legna formiche attraverso condizionamento classico. In questo paradigma, formiche sono imbrigliate e presentate con un segnale visivo (un cartone blu), lo stimolo condizionato (CS), accoppiato con una ricompensa di zucchero appetitiva, lo stimolo incondizionato (US). Le formiche eseguono una mascella superiore-Labium estensione Reflex (MaLER), la risposta incondizionata (UR), che può essere utilizzata come una lettura per l'apprendimento. Formazione è costituito da 10 prove, separate da un intervallo di 5 minuti intertrial (ITI). Le formiche sono testate anche per ritegno di memoria 10 minuti o 1 ora dopo l'allenamento. Questo protocollo ha il potenziale per consentire ai ricercatori di analizzare, in modo preciso e controllato, i dettagli della formazione della memoria visiva e le basi neurali di apprendimento e memoria formazione in legna formiche.

Introduzione

Gli insetti sono stati ampiamente utilizzati come modelli per lo studio della memoria e dell'apprendimento formazione¹. Una vena particolarmente riuscita della ricerca prevede l'utilizzo di condizionamento classico degli animali sobri, che permette un controllo preciso sulle indicazioni essere imparato e permette ai ricercatori di studiare i meccanismi neurali alla base della memoria e dell'apprendimento. La maggior parte degli studi si è concentrati sul condizionamento classico appetitiva dei lavoratori ape, Apis mellifera. I lavoratori dell'ape mellifica sono addestrati per associare un CS con un americano che evoca l'UR. In questo paradigma, sviluppato originariamente da Takeda² e Bitterman et al. ³, l'UR è il riflesso di estensione proboscide (PER), gli Stati Uniti sono lo zucchero e il CS è un odore. Le API imparare l'associazione fra il CS e gli Stati Uniti e possono formare una memoria a lungo termine di questa associazione.

Il paradigma originale utilizzando il PER come l'UR è stato usato per svelare i percorsi neurali alla base di apprendimento olfattivo in API⁴. È stato modificato in diversi modi per verificare l'apprendimento degli stimoli sensoriali differenti, tra cui gli stimoli visivi^5,6,7, incorporare aversiva apprendimento tramite soppressione della PER⁸ o l'estensione di Sting Riflesso (SER)⁹ come l'UR e per testare l'apprendimento in altre specie, come bombi mosche di frutta e^{10 11}. Anche se con parecchie modalità di formazione della memoria è stata studiata attraverso il condizionamento classico, è ancora difficile da osservare utilizzando questo approccio, l'apprendimento visivo anche in quelle specie che mostrano un alto grado di capacità di apprendimento visivo durante il foraggiamento, come API da miele.

Recenti studi hanno applicato un approccio simile agli insetti che non dispongono di una proboscide, come le locuste, che consentono di eseguire il palpo apertura risposta (POR)¹²e le formiche, che eseguire la mascella superiore-Labium estensione Reflex (MaLER)¹³. Questo ha già rivelato le capacità di apprendimento di fase-specifici che corrispondono le strategie di alimentazione fase-specifici i due fenotipi diversi locusta del deserto, il gregario e le forme solitarious, re-imporre l'idea che la formazione della memoria deve corrispondere esigenze ecologiche¹⁴. Inoltre, gli studi sull'apprendimento olfattivo in formiche ha mostrato somiglianze tra le formiche e le API da miele nella formazione della memoria e mantenimento, con conservazione della memoria a lungo termine, 72 ore dopo l'allenamento, essendo dipendente dalla proteina sintesi¹⁵.

Questi adattamenti del paradigma originale hanno permesso la formazione di apprendimento e la memoria essere studiato con molte modalità e diverse specie di modello. Ciò è essenziale per l'identificazione dei meccanismi di memoria comune di formazione per gli insetti, ma anche per individuare differenze che riflettono la particolare ecologia di apprendimento e memoria in specie diverse. L'obiettivo principale del protocollo che descriviamo qui è quello di fornire un modo per eseguire esperimenti di condizionamento classico utilizzando uno stimolo visivo condizionale con una specie di formiche ampiamente studiati, Formica rufa. È rilasciato dal nostro studio di apprendimento visivo in formiche legno¹⁶, che è anche un adattamento dei paradigmi di condizionamento classico visual.

Protocollo

1. mantenimento di colonie di Formica rufa

Nota: Le colonie di formica (Formica rufa, L.) utilizzate per questo studio sono stati raccolti da Ashdown Forest, Sussex, UK (N 51 4.680, E 0 1.800). All'interno del Regno Unito, F. rufa colonie dovrebbero essere raccolti tra luglio e agosto. Una buona percentuale del nido dovrà essere rimossi, tra cui diverse centinaia di lavoratori e Covata, affinché la Colonia è sostenuta e attivo per lunghi periodi di tempo (fino a un anno). Deve richiedere l'autorizzazione da parte delle autorità interessate prima della rimozione del nido.

1. Le colonie di formica in un ampio box di casa (circa cm 135 x 70 x 35 cm) con pareti rivestite con resina di politetrafluoroetilene (PTFE) (ad es., Fluon) per impedire la fuga, a 21 ° C, le formiche sotto una luce: 12 12-h-h ciclo scuro.
   1. Fornire acqua e saccarosio (333 g/L) per le formiche, utilizzando distributori d'acqua. Per garantire che la dieta delle formiche è ricca di proteine, nutrire la Colonia con i grilli congelati 2 volte alla settimana. Spruzzare il nido con acqua ogni giorno per mantenerlo umido.
   2. Per migliorare le condizioni sanitarie della Colonia, aggiungere resina di pino quando necessario; resina di pino riduce parassitismo in formica colonie¹⁷. Posizionare un piccolo contenitore (circa 15 cm di diametro e 5 cm di profondità) all'interno del nido, in modo che le formiche possono depositare qualsiasi membri della Colonia morto in esso.
2. Mantenere le formiche sotto le suddette condizioni per almeno 2 settimane dopo la raccolta prima di tentare qualsiasi esperimenti. Rimuovere il saccarosio dal nido a morire di fame le formiche 2 d prima gli esperimenti, migliorando la loro motivazione.

2. selezione e sfruttando le formiche

Nota: Per sfruttare le formiche, è necessario un supporto su misura. Questo può essere realizzato con argilla di modellistica e un cartone con un taglio di apertura fissato ad esso orizzontalmente. La superficie superiore del cartone dovrebbe essere parzialmente rivestita con cera, permettendo spilli entomologici da allegare durante la riparazione. Manipolazione attenta è necessaria per ogni passo di questo protocollo (tra cui l'esperimento, trasporto e manutenzione), ma in particolare quando sfruttando le formiche, per evitare sottoponendoli ad alti livelli di stress prima dell'allenamento.

1. Per selezionare le formiche che sono motivate a mangiare, inserire una diapositiva con una goccia di saccarosio (200 g/L) all'interno di una piccola scatola (circa 14 x 8 cm x 5 cm) con pareti ricoperte di resina PTF per impedire la fuga. Non selezionare le formiche che trasportano legna o morte formiche dal nido. Invece, prendere le formiche che sono arrampicarsi sulle pareti del nido, perché questi sono più probabili essere raccoglitrici cercando di lasciare il nido alla ricerca di cibo.
2. Posizionare ogni formica nella casella e attendere per vedere se si nutre la goccia di saccarosio. Se lo fa, trasferirlo immediatamente un'altra scatola vuota per evitare la sazietà.
3. Trasferire ogni formica un tubo separato. Collocare ciascuna provetta nel congelatore per 1-2 min, o nel ghiaccio tritato per fino a 5 min, per immobilizzare la formica.
4. Posizionare la formica immobilizzata nel supporto, attraverso il taglio sul cartone, dall'articolazione tra la testa e il torace. Garantire che le antenne rimangono sul lato della testa, utilizzando spilli entomologici incorporati nello strato di cera in cima al cartone.
5. Utilizzare un elemento di riscaldamento su misura per cera la punta di un insetto pin alla testa della formica, parallelo al cartone. Durante questa procedura, non toccare le antenne con l'elemento di riscaldamento filo per evitare di incorrere in eventuali danni a loro.
6. Dopo che la cera si asciuga, rimuovere i perni dell'insetto che tiene le antenne e rimuovere con attenzione la formica da parte del titolare.
7. Fissare il perno dell'insetto che tiene la formica in un'argilla di modellistica cilindro e correzione di un supporto di plastica su misura sotto di esso, assicurando la formica mantiene una posizione eretta tipica e che tutto il corpo è libero di muoversi, tranne la testa.
8. Mantenere le formiche imbrigliate nel buio per almeno 2 h prima dell'allenamento.

3. formazione e test

1. Set-up, stimolo condizionato e incondizionato stimolo
   1. Condurre gli esperimenti in una casella bianca acrilica (50 x 50 x 50 cm), aperta sul davanti per consentire l'accesso per lo sperimentatore. Registrare il comportamento della formica con una macchina fotografica.
      1. Posizionare la fotocamera con un obiettivo macro direttamente sopra la formica, attraverso un foro sulla superficie superiore della scatola.
      2. Per ridurre eventuali segnali visivi estranei, tenere la camera al buio ad eccezione di una sorgente di luce che punta direttamente alla parte superiore della casella di acrilico (due luci 26-W).
   2. Utilizzare come un segnale visivo (CS) un rettangolo di cartone blu brillante (spettro nella Figura S1) (60 x 45 mm) attaccato al suo centro ad un ago, collegato ad una siringa (2 mL) con cui gli Stati Uniti (saccarosio 200 g/L) manualmente viene consegnato alla formica (Figura 1A e 1B ).
      Nota: La soluzione di saccarosio può essere fatta con qualsiasi zucchero bianco, purché non ha colore e odore quando disciolto in acqua.
   3. Effettuare due tipi di formazione in parallelo, in coppia e spaiati (Vedi la spiegazione qui sotto), in un ordine randomizzato.
      Nota: In questo studio, abbiamo non ha prestato attenzione alla natura del segnale visivo. Solo l'associazione tra la stecca e la ricompensa sono state prese in considerazione. Colore e forma non sono stati testati, ed è probabile che un CS con altre caratteristiche produrrebbe risultati simili. Tuttavia, il colore blu è stato scelto perché le formiche dal medesimo genere hanno dimostrate di essere sensibile alle lunghezze d'onda che coprono il¹⁸di colore blu.
2. Formazione in coppia
   Nota: In formazione accoppiati, il CS e Stati Uniti sono presentati in ogni prova, associato a vicenda (Figura 1).
   1. Avviare la registrazione la s formiche 10 prima di presentare il CS per garantire che le formiche non eseguono spontaneamente MaLER prima della presentazione. Se le formiche eseguire MaLER durante questo periodo, rinviare il processo per pochi secondi. Se qualsiasi formica mostra continuamente questo comportamento, è possibile escluderlo dall'analisi.
   2. Spostare la siringa + CS davanti la formica per ~ 10 s, con la punta dell'ago tenuto tra il viso della formica e un massimo di 5 mm di sopra e a ogni lato. Durante questo tempo, spostare la punta dell'ago più vicino possibile alla testa della formica, ma senza toccare le antenne (Figura 1B).
      Nota: Motion è stato incluso quando presentando il CS, perché ha dimostrato di giocare un ruolo in visual apprendimento associativo in honeybees⁶.
   3. Applicare pressione per trasudano una sola goccia di saccarosio dalla punta della siringa e posizionare la goccia di saccarosio accanto al antenne e apparato boccale per consentire la formica rilevare il saccarosio. Consentire la formica sfamare per circa 5 s.
      Nota: La quantità di formiche di saccarosio consumato in ogni prova non è stata controllata in questi esperimenti. La goccia di saccarosio su quali formiche feed dovrebbe essere abbastanza grande da permettere loro di sfamare liberamente per circa 5 s.
   4. Ripetere questa procedura 10 x, con un ITI di 5 min.
      Nota: In questi esperimenti, le formiche erano sempre girate a destra, con il loro occhio destro vicino al lato aperto della casella di acrilico. Pertanto, il CS si avvicinò sempre le formiche dal loro lato destro. Anche se questo non invalida apprendimento, questi esperimenti possono essere condotta ruotando metà delle formiche a sinistra e destra, per evitare qualsiasi effetto di lateralizzazione possibili.
3. Formazione spaiato
   Nota: Questa formazione consiste nel presentare alle formiche il CS o Stati Uniti separatamente, questi due stimoli essendo, dunque, dissociato da altro nel corso del tempo (Figura 1).
   1. Avviare la registrazione la s formiche 10 prima di ogni prova.
   2. Presente il CS nello stesso modo come in formazione accoppiato ma non consegnare il saccarosio alla formica.
   3. Dopo 2,5 min, consegnare direttamente negli Stati Uniti l'apparato boccale (anche toccare le antenne) utilizzando una siringa senza il CS attaccato.
   4. Iniziare con una prova di CS e ripetere questa procedura 10 x per ogni tipo di prova, intercalanti li con un ITI di 2,5 min.
4. Test
   Nota: Un test dovrebbe essere condotta soltanto 1 x, entrambi 10 min o 1 h dopo l'ultima prova di formazione; un test in cui la formica è presentata con il CS, ma non con gli Stati Uniti poteva causare l'estinzione della memoria associativa formata in precedenza.
   1. Avviare la registrazione la s formiche 10 prima del test.
   2. Presento il CS la formica per circa 10 s.
   3. Garantire che la formica è ancora motivata per alimentare fornendo saccarosio dopo il test.

4. analisi e raccolta dati

1. Registrare il comportamento della formica, dall'alto, 10 s prima di ogni prova e durante le presentazioni di CS e Stati Uniti. Garantire che tutte le prove e le analisi vengono registrate per analisi posteriore.
2. Utilizzando le registrazioni fatte durante l'allenamento e test, Punteggio ottenuto risposte delle formiche durante il 10 s di presentazione di CS.
3. Separare le risposte delle formiche durante la presentazione di CS in tre tipi di comportamento, a seconda dell'estensione e movimento dell'apparato boccale: estensione completa con movimento (FEM) come se l'alimentazione, estensione completa senza movimento (FE) o parziale estensione (PE) del mascella superiore-labium o mascellare palpi (Figura 2A - 2D). Per l'analisi, è possibile raggruppare tutti i tipi di MaLER come una singola risposta (Figura 2E).
4. Escludere qualsiasi formica che ha fatto non alimentata in ogni prova e prova.
   Nota: Per l'analisi, è consigliabile un test statistico che tenga conto di singole formiche, quindi rappresentando variabilità all'interno di individui. Quando classificare le risposte delle formiche durante l'allenamento in modo binario (1 per le risposte positive e 0 per nessuna risposta), la regressione logistica con effetti misti è consigliabile^16,19. Per confrontare la proporzione di formiche blocca in ogni prova di addestramento o test, un G-test o il test esatto di Fisher è raccomandato, a seconda del numero di formiche analizzato^16,20.

Risultati

Durante gli esperimenti di condizionamento classico, il CS non deve indurre una risposta spontanea negli animali. Negli esperimenti che abbiamo condotto, solo il 3% - 4% delle formiche eseguita MaLER in risposta al segnale visivo sulla prima prova, prima dell'allenamento. Formiche che stavano subendo una formazione accoppiato eseguite sempre più MaLER in risposta al CS (Figura 3A; regressione logistica, N = 51, gradi di libertà (df) = 507, z = 5.949, p < 0.01). La percentuale di formiche accoppiate che rispondono al CS stabilizzato intorno 50%, dalla terza prova in poi. Al contrario, formiche spaiate ha mostrate non significative aumentano MaLER durante l'allenamento (Figura 3B; regressione logistica, N = 29, df = 287, z = 0.758, p = 0.45). L'avvenimento di MaLER in risposta al segnale visivo era significativamente più alta durante abbinato che spaiati formazione (regressione logistica, N = 80, df = 796, z =-5.306, p < 0.01), che era vero per ogni prova tranne il primo (tabella 1).

Per l'esame di loro a breve e a medio termine memoria¹⁵, le formiche sono state testate 10 min o 1 h dopo l'ultima prova di addestramento. Per entrambi i test, la proporzione di formiche esecuzione MaLER in risposta al CS era significativamente più alta quando avevano subito formazione accoppiata anziché spaiata (Figura 3 e 3D; Tabella 1).

Durante la formazione, singole formiche ha mostrato una variazione sostanziale del numero e tipo di MaLER che visualizzati (Figura 4A e 4B). Solo il 14% di formiche accoppiati ha risposto ad ogni prova dalla seconda o terza prova in avanti, mentre la maggior parte delle formiche si alternavano tra studi nei quali hanno risposto e in cui non lo fecero. Su quelle prove di formazione in cui le formiche ha risposto, ha variato il grado a cui hanno esteso e spostato il loro apparato boccale. Di conseguenza, abbiamo diviso MaLER in tre diversi tipi: FEM, FE o PE. In genere, le formiche eseguita più spesso di FE FEM o PE. Tuttavia, solo pochi formiche eseguita costantemente lo stesso tipo di risposta; nella maggior parte dei casi, le formiche hanno mostrato poca coerenza sul tipo di MaLER che si sono esibiti (Figura 4).

Figura 1 : Set-up sperimentale e programma di formazione. (A) Fix ant con cera ad un insetto pin collegato a una modellazione di argilla cilindro (arancia) e posto un supporto su misura sotto di esso per consentire un atteggiamento naturalistico. Inserirlo all'interno di una casella di acrilico bianca illuminata da due fonti di luce, direttamente sotto una macchina fotografica. Utilizzare come lo stimolo condizionato (CS) un cartone (quadrato blu) collegato alla siringa che fornisce lo stimolo incondizionato (noi), una ricompensa di zucchero. L' inserto Mostra una vista ravvicinata di una formica nel supporto. (B), la punta della siringa ago viene spostato più vicino possibile alla testa della formica, ma senza toccare le antenne come illustrato in questo schema. Formiche di treno attraverso sia una (C) accoppiato o spaiati (D) formazione. Questa figura è stata modificata da Fernandes et al. ¹⁶. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : La mascella superiore-Labium estensione risposta di formiche legna. Singoli fotogrammi da registrazioni video mostrano i movimenti delle formiche bocca parte durante l'allenamento. (A), questo pannello mostra nessuna risposta. (B) questo pannello mostra un'estensione completa (FE) della mascella superiore-labbro inferiore che termina al glossa. (C), questo pannello mostra una parziale estensione (PE) con solo il palpo visibile. (D) questo pannello mostra una parziale estensione (PE) delle strutture del mascellare superiore-labium. Le formiche (E) in fase di formazione accoppiati (N = 51) eseguire un'estensione completa con movimento (FEM; marrone scuro), un FE (metà marrone) o a una PE (marrone chiaro). Questa figura è stata modificata da Fernandes et al. ¹⁶. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Forma di formiche memorie associative di un segnale visivo abbinate con una ricompensa di zucchero di legno. (A) la percentuale di formiche accoppiate (N = 51) esecuzione di MaLER in risposta alla presentazione di CS significativamente aumentato durante l'addestramento. (B) la percentuale di esecuzione MaLER le formiche non è aumentato significativamente durante l'addestramento spaiato (N = 29). Le formiche erano testati (C) 10 minuti (accoppiati: N = 15; spaiati: N = 15) o (D) 1 ora (accoppiati: N = 15; spaiati: N = 14) dopo l'ultima prova di addestramento. La percentuale di formiche risponde al CS durante e dopo l'allenamento accoppiato o spaiato sono rappresentati in marrone o grigio, rispettivamente. I tre tipi di MaLER sono rappresentati nel buio (FEM), medie (FE) e toni di luce (PE). Questa figura è stata modificata da Fernandes et al. ¹⁶. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Prestazioni individuali di formiche durante l'allenamento. Questi pannelli mostrano le prestazioni individuali di (A) accoppiate formiche e (B) spaiati formiche. I tre tipi di MaLER sono rappresentati nel buio (FEM), medio (FE) e marrone chiaro (PE) o grigio. Questa figura è stata modificata da Fernandes et al. ¹⁶. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Versione di prova	N	DF	G (regolato)	P
1	80	na	na	> 0,1
2	80	1	3,86	< 0.05
3	80	1	8,41	< 0.01
4	80	1	6,63	< 0.01
5	80	1	8,41	< 0.01
6	80	1	7.5	< 0.01
7	80	1	10.69	< 0.01
8	80	1	11,76	< 0.01
9	80	1	17,13	< 0.01
10	80	1	17,13	< 0.01
10 min	59	1	5.5	< 0.05
1 h	59	1	4,42	< 0.05

Tabella 1: confronto delle risposte di MaLER al CS tra formiche che aveva subito in coppia e spaiati formazione, per ogni prova e test. Il numero di formiche (N), gradi di libertà (df), G-prova di indipendenza (G) e p-valore sono mostrati. La prima prova è stata analizzata con il test esatto di Fisher, un. Questa tabella è stata modificata da Fernandes et al. ¹⁶.

Discussione

Condizionamento classico è uno dei paradigmi più consolidati per studiare l'apprendimento e la memoria. Il protocollo che abbiamo presentato qui è un adattamento del paradigma progettato per miele ape lavoratori^2,3 e successivamente utilizzato con numerose altre specie, come bombi, mosche della frutta, che usano anche PER come una lettura per l'apprendimento^{10 ,11}e cavallette e formiche, che utilizzano POR e MaLER, rispettivamente^12,13. Utilizzando questo protocollo, è possibile addestrare imbrigliate formiche legno per imparare l'associazione tra un segnale visivo e una ricompensa di zucchero e analizzare il mantenimento di questa breve - (10 min) e a medio termine (1 ora) memoria¹⁶.

In ogni esperimento comportamentale, è necessario prendere in considerazione i passaggi critici che possono ridurre al minimo la variabilità nelle risposte degli animali. Nel protocollo presentato qui, vengono adottate diverse misure per ridurre al minimo la variabilità prima e durante l'allenamento. Prima dell'inizio degli esperimenti, la Colonia ha bisogno di essere affamato per almeno due giorni e formiche dovrebbero essere selezionate sulla loro volontà di mangiare da una goccia di zucchero nella casella della holding della base. Selezionando le formiche in questo modo è destinato per massimizzare le possibilità di formiche di formazione che sono motivati da sfamare. Un'attenta gestione è anche una considerazione importante, poiché può aiutare a ridurre i livelli di stress, che sconvolge apprendimento se è troppo intenso²¹. A tal fine, le formiche dovrebbero essere anestetizzate con freddo di rimanere immobili mentre essere imbrigliato, perché qualsiasi movimento (per fuggire) durante questa procedura potrebbe essere una fonte di stress. Inoltre, il contatto tra la formica e la cera deve essere minimo, evitando il contatto tra le antenne e la cera calda o filo, che poteva causare danni. Sebbene queste osservazioni non sono state analizzate formalmente, le antenne sembravano muoversi con un modello specifico durante l'apprendimento.

Durante gli esperimenti, attento consegna dello zucchero è anche importante per mantenere le formiche motivati. Ancora, mentre questo non è stato analizzato formalmente, consegna del cibo brusco sembrava causare ulteriore stress alla formica, che a sua volta ha portato ad una mancanza di motivazione e apprendimento. Inoltre, dovrebbe essere il saccarosio consegnato durante l'addestramento di una concentrazione ridotta (200 g/L) per evitare la sazietà prima della fine dell'addestramento e prova. In questo modo MaLER essere una risposta incondizionata di buon candidato perché, insieme ad un basso rendimento spontaneo di questa risposta per il segnale visivo, esso inoltre non saturare sopra prove. Infine, contrariamente a condizionamento classico la maggior parte studia^{2,3,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13}, ci siamo allenati una formica al momento fino alla fine dell'esperimento, lasciando al posto tra prove piuttosto che rimuoverlo per testare un'altra formica. Formazione diverse formiche insieme sembrava per produrre risultati più variabili, che possono essere dovuto ad un aumento dello stress e/o conflitto tra informazioni visive causate dal cambiamento completo del paesaggio. Per ridurre la durata di ciascun esperimento, abbiamo usato un ITI 5 minuti anziché 10 minuti ITI utilizzato nella maggior parte dei studi di condizionamento classico¹⁶. Anche se tutte queste considerazioni dovrebbero aiutare a garantire che le formiche sono motivate per nutrire e imparare durante l'allenamento, alcuni variabilità non può essere evitato. Si consiglia di utilizzando le formiche che sembrano avere un comportamento sociale, appetitiva e locomozione normale ed escludendo le formiche dall'analisi al momento che non riescono a nutrirsi di una prova di formazione o di un test.

La natura del CS non è stata testata in questo studio. Anche se abbiamo usato uno stimolo visivo blu perché le formiche dello stesso genere sono sensibili a queste lunghezze d'onda¹⁸, altri colori potrebbero anche essere apprese in associazione con una ricompensa. Ulteriori esperimenti sarebbero stato necessario caratterizzare completamente i colori essendo visto e imparato in questo set-up. Questo vale anche per diverse forme e dimensioni del segnale visivo. Non abbiamo testato se è sufficiente per distinguere lo stimolo visivo presentato qui alla distanza dagli occhi delle formiche è stato presentato alla risoluzione spaziale delle formiche. Anche se gli occhi composti di legno formiche sono state descritte in termini di dimensioni e numero di sfaccettature²², a nostra conoscenza, loro risoluzione spaziale non è stata completamente descritta ancora. Tuttavia, questo è stato calcolato per Melophorus Mattarella²³. Una simile caratterizzazione delle formiche del legna o gli occhi degli altri insetti testata contribuirebbe ad un'indagine chiara delle caratteristiche del segnale visivo essere osservato e imparato dagli animali. Inoltre, abbiamo incluso movimento quando presentando lo stimolo visivo alla formica, perché ha dimostrato di svolgere un ruolo nell'apprendimento associativo dell'ape mellifica durante il condizionamento classico⁶. Tuttavia, questo inoltre non è stato testato in questo studio e, a causa della natura di movimento differente di insetti rispetto alla camminata di insetti volanti, differenze tra ape e formica condizionamento classico visual potrebbero essere osservate.

Una nota finale, siamo stati in grado di esaminare la conservazione della memoria a lungo termine perché le formiche non sono sopravvissuto essendo sfruttato per periodi così lunghi dopo l'allenamento. Tuttavia, nella successive serie di esperimenti, abbiamo mantenuto le formiche vivo e motivati a mangiare e imparare quando imbrigliato e lasciato durante la notte in un ambiente buio e umido (posizionando una casella su di loro). Pertanto, questo paradigma potrebbe essere utilizzato per svelare la conservazione della memoria a lungo termine di formiche legna, oltre alla memoria a breve e medio termine.

Con questa semplice procedura adattata da paradigmi generali condizionamento classico, è possibile studiare l'acquisizione e la fidelizzazione di memorie visive nelle formiche legna bardate, che sono stati ampiamente studiate nei paradigmi utilizzando animali liberi di muoversi. Questo paradigma ha il potenziale per essere utilizzato per analizzare le basi neurali di apprendimento visivo in un modello molto ben consolidato per la navigazione dell'insetto.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluon	Blades Biological Ltd, Edenbridge, UK	ACS 109; ACS 112; ACS 114	For preventing insects from scaping
Crickets	Blades Biological Ltd, Edenbridge, UK	LZJ 217	Given to the ant colonies as protein source
Natural Pine Rosin/Resin	Minerals-water Ltd, Rainham, UK	500g	Given to the ant colonies for sanitation
Austerlitz Insect Pin	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	26000-40	For harnessing ants
High speed camera	Edmund Optics Inc., Barrington, USA	eo-13122M	MaLER recordings during training and testing
Macrolens	Cannon, Surrey, UK	EF 100 mm f/2.8 L Macro IS USM	MaLER recordings during training and testing
Software	IDS Imaging Development Systems GmbH	uEye64	MaLER recordings during training and testing
Blue Cardboard	john smith's at Union Store, University of Sussex	JACK-PJM41358	Constitutes de conditional stimulus
Syringe	Fisher Scientific LTD, Loughborough, UK	BD Plastipak 300185case; Product Code.12369289	US and CS (attached) presentation
Needle (0.5 x 16 mm)	Fisher Scientific LTD, Loughborough, UK	BD Microlance 300600; Product Code:10442204	US and CS (attached) presentation