Visual condicionamento clássico em madeira formigas

Resumo

Apresentamos um protocolo para o condicionamento clássico de formigas aproveitados que permite aos pesquisadores estudar formação visual de aprendizagem e memória a um nível de análise não é possível com indivíduos movimentando-se livremente.

Resumo

Várias espécies de insetos tornaram-se sistemas de modelo para estudar a formação de aprendizagem e memória. Embora muitos estudos enfocam animais movimentando-se livremente, estudos para implementar os paradigmas de condicionamento clássico com insetos aproveitados foram importantes para investigar as pistas exatas que os indivíduos aprendem e os mecanismos neurais subjacentes a aprendizagem e formação de memória. Aqui nós apresentamos um protocolo para evocando visual aprendizagem associativa em madeira formigas através do condicionamento clássico. Neste paradigma, formigas são aproveitadas e apresentadas com uma indicação visual (um cartão azul), o estímulo condicional (CS), emparelhada com uma recompensa de açúcar repetido, o estímulo incondicional (EUA). As formigas executam um reflexo de extensão de maxila-Labium (MaLER), a resposta incondicional (UR), que pode ser usada como uma leitura para a aprendizagem. Treinamento é composto por 10 ensaios, separados por um intervalo de 5 minutos intertrial (ITI). As formigas também são testadas para retenção da memória 10 minutos ou 1 hora após o treino. Este protocolo tem o potencial para permitir que os investigadores a analisar, de forma precisa e controlada, os detalhes da formação de memória visual e a base neural da formação de aprendizagem e memória em madeira formigas.

Introdução

Insetos têm sido extensivamente utilizados como modelos para estudar a aprendizagem e a memória de formação¹. Uma veia particularmente bem sucedida de pesquisa envolve o uso de condicionamento clássico dos animais comedidos, que permite um controle preciso sobre as pistas sendo aprendido e permite que os pesquisadores a investigar os mecanismos neurais subjacentes a aprendizagem e memória. A maioria dos estudos têm incidido sobre o condicionamento clássico repetido dos trabalhadores da abelha Apis mellifera. Os trabalhadores de abelha são treinados para associar um CS uns E.U. que evoca a UR. Neste paradigma, originalmente desenvolvido pela Takeda² e Bitterman et al ³, a UR é o reflexo de extensão narigudo (PER), os EUA são o açúcar e o CS é um odor. As abelhas aprendem a associação entre o CS e os Estados Unidos e podem formar uma memória de longo prazo desta associação.

O paradigma original usando o por como a UR tem sido usado para desvendar os caminhos neurais subjacentes a aprendizagem olfactiva em abelhas⁴. Ele foi modificado de várias maneiras para testar a aprendizagem de diferentes estímulos sensoriais, incluindo estímulos visuais^5,6,7, para incorporar a aprendizagem contrário usando supressão do por⁸ ou a extensão de Sting Reflex (SER)⁹ como a UR e testar o aprendizado em outras espécies, tais como abelhas¹⁰ e as moscas de fruta¹¹. Embora a formação da memória, com várias modalidades tem sido estudada através do condicionamento clássico, visual de aprendizagem é ainda difícil de observar o uso dessa abordagem, mesmo em espécies que mostram um alto grau de capacidade de aprendizagem visual durante o forrageamento, tais como abelhas.

Estudos recentes têm aplicado uma abordagem semelhante aos insetos que não possuem uma tromba, como gafanhotos, que realizam a resposta ao toque de abertura (POR)¹²e as formigas, que realizam o reflexo de extensão na maxila-Labium (MaLER)¹³. Isto já revelou as habilidades de aprendizagem específicos da fase que coincidem com as estratégias de alimentação específicos da fase dos dois fenótipos diferentes gafanhoto no deserto, o gregário e as formas solitarious, reforçar a ideia de que a formação de memória precisa coincidir com necessidades ecológicas¹⁴. Além disso, estudos sobre aprendizagem olfactiva em formigas revelou semelhanças entre as formigas e as abelhas na formação da memória e de retenção, com retenção de memória a longo prazo, 72 horas após o treino, sendo dependente de síntese de proteína¹⁵.

Essas adaptações do paradigma original tem permitido a formação de aprendizagem e memória a ser estudado com diversas modalidades e em diversas espécies de modelo. Isto é essencial para a identificação de mecanismos de memória comum de formação para os insetos, mas também para identificar as diferenças que refletem a ecologia particular de aprendizagem e memória em diferentes espécies. O objetivo principal do protocolo que descrevemos aqui é fornecer uma maneira para realizar experimentos de condicionamento clássico, usando um estímulo visual condicional com uma espécie de formiga amplamente estudados, Formica rufa. É emitida do nosso estudo de aprendizagem visual em madeira formigas¹⁶, que também é uma adaptação dos paradigmas visuais condicionamento clássico.

Protocolo

1. manter colônias Formica rufa

Nota: As colônias de madeira formiga (Formica rufa, L.) usadas para este estudo foram coletadas de floresta Ashdown, Sussex, Reino Unido (N. o 51 E 4.680, 0 1.800). Dentro do Reino Unido, F. rufa colônias devem ser coletadas entre julho e agosto. Uma boa proporção do ninho deve ser removida, incluindo várias centenas de trabalhadores e das castas, para garantir a colônia é sustentada e ativo por períodos mais longos de tempo (até um ano). Autorização deve ser solicitada por parte das autoridades em causa antes da remoção do ninho.

1. As colônias de formigas de madeira em uma caixa grande de casa (por volta das 135 x 70 cm x 35 cm) com paredes cobertas com resina de politetrafluoretileno (PTFE) (por exemplo, Fluon) para evitar que as formigas do, a 21 ° C, sob uma luz: 12 12-h-h ciclo escuro.
   1. Fornece água e sacarose (333 g/L) para as formigas, usando de distribuidores de água. Para assegurar a que dieta das formigas é rica em proteína, alimente a colônia com grilos congelados 2 x por semana. Pulverize o ninho com água todos os dias para mantê-lo úmido.
   2. Para melhorar as condições sanitárias da colônia, adicionar resina de pinheiro, quando necessário; resina de pinheiro reduz parasitismo em colônias de formigas de madeira¹⁷. Coloque um recipiente pequeno (cerca de 15 cm de diâmetro e 5 cm de profundidade) dentro do ninho para que as formigas podem depositar quaisquer membros mortos da colônia nele.
2. Mantenha as formigas sob as condições acima mencionadas pelo menos 2 semanas após a coleta antes de tentar qualquer experimentos. Remova a sacarose do ninho de fome as formigas 2 d antes das experiências, melhorando assim a sua motivação.

2. seleção e aproveitamento de formigas

Nota: Para o aproveitamento de formigas, é necessário um suporte sob medido. Isto pode ser construído usando a argila de modelagem e um cartão com um corte de abertura fixado horizontalmente. A superfície superior do cartão deve ser parcialmente revestida com cera, permitindo que o insetos pinos a ser ligado durante a fixação. Manuseamento cuidadoso é necessário para cada etapa do presente protocolo (incluindo a manutenção, transporte e experiência), mas em especial ao aproveitamento de formigas, para evitar sujeitá-los a altos níveis de estresse antes do treinamento.

1. Para selecionar as formigas que estão motivadas para comer, colocar um slide com uma gota de sacarose (200 g/L) dentro de uma caixa pequena (por volta das 14 x 8 cm x 5 cm) com paredes cobertas com resina PTF para evitar a fuga. Não selecione formigas que estão carregando madeira ou mortas formigas do ninho. Em vez disso, tome as formigas que estão subindo as paredes do ninho, porque estes são mais prováveis ser campeiras tentando sair do ninho para procurar comida.
2. Coloque cada formiga na caixa e esperar para ver se alimenta-se a queda de sacarose. Se isso acontecer, transferi-lo imediatamente para outro caixa vazia para evitar a saciedade.
3. Transfira cada formiga para um tubo separado. Coloque cada tubo no freezer por 1-2 min, ou gelo picado para até 5 min, para imobilizar a formiga.
4. Coloque a formiga imobilizada no suporte, através do corte sobre o cartão, pela articulação entre a cabeça e o tórax. Certifique-se das que antenas permanecem no lado da cabeça, usando insetos pinos incorporados na camada de cera em cima do papelão.
5. Use um elemento de aquecimento feito por encerar a ponta de um alfinete inseto a cabeça da formiga, paralela para a cartolina. Durante este procedimento, que não toque as antenas com o elemento de aquecimento do fio para evitar incorrer em qualquer dano a eles.
6. Depois que a cera seca, remova os pinos insetos segurando as antenas e remova cuidadosamente a formiga do suporte.
7. Fixar o pino inseto segurando a formiga em uma argila de modelagem cilindro e fix um suporte de plástico sob medido abaixo dela, garantindo a formiga mantém uma postura típica de pé e que todo o corpo é livre para se mover, excepto a cabeça.
8. Mantenha as formigas aproveitadas na escuridão pelo menos 2 h antes do treinamento.

3. treinamento e teste

1. Set-up, estímulo condicionados e unconditioned estímulo
   1. Conduza os experimentos em um branco caixa de acrílico (50 x 50 x 50 cm), aberto na frente para permitir o acesso para o experimentador. Registre o comportamento da formiga com uma câmera.
      1. Coloque a câmera com uma lente macro diretamente acima da formiga, por um buraco na superfície superior da caixa.
      2. Para reduzir quaisquer indicações visuais estranhas, mantenha o quarto na escuridão, com exceção de uma fonte de luz apontando diretamente para o topo da caixa de acrílico (duas luzes 26-W).
   2. Usar como uma sugestão visual (CS), um retângulo azul brilhante (espectro na Figura S1) papelão grudado em seu centro uma agulha, conectada a uma seringa (2 mL) (60 x 45 mm) com o qual os Estados Unidos (sacarose 200 g/L) manualmente é entregue para a formiga (figura 1A e 1B ).
      Nota: A solução de sacarose pode ser feita com qualquer açúcar branco, desde que não tem cor e odor quando dissolvido na água.
   3. Realizar dois tipos de formação em paralelo, emparelhado e pareado (veja a explicação abaixo), em uma ordem aleatória.
      Nota: Neste estudo, nós não prestar atenção à natureza da indicação visual. Apenas a associação entre o taco e a recompensa foram tidos em conta. Cor e forma não foram testados, e é provável que um CS com outras características produziria resultados semelhantes. No entanto, a cor azul foi escolhida porque as formigas do mesmo gênero foram mostradas para ser sensível aos comprimentos de onda que cobrem a cor azul¹⁸.
2. Formação de par
   Nota: Em formação emparelhada, a CS e os EUA são apresentados em cada julgamento, associado com o outro (Figura 1).
   1. Começa a gravar as formigas 10 s antes de apresentar o CS para garantir que as formigas são não espontaneamente realizando MaLER antes da apresentação. Se as formigas executar MaLER durante este período, adie o julgamento por alguns segundos. Se qualquer formiga mostra esse comportamento continuamente, excluí-lo da análise.
   2. Mova a seringa + CS frente a formiga para ~ 10 s, com a ponta da agulha mantida entre o rosto da formiga e um máximo de 5 mm acima e para cada lado. Durante este tempo, mova a ponta da agulha tão próxima quanto possível a cabeça da formiga, mas sem tocar as antenas (figura 1B).
      Nota: Movimento foi incluído ao apresentar o CS porque mostrou a desempenhar um papel na aprendizagem associativa visual em abelhas⁶.
   3. Aplique pressão exalam uma única gota de sacarose da ponta da seringa e colocar a gota de sacarose ao lado da antena e aparelho bucal para permitir que a formiga detectar a sacarose. Permitir que a formiga se alimentar por cerca de 5 s.
      Nota: A quantidade de formigas de sacarose consumida em cada julgamento não era controlada nestas experiências. A gota de sacarose na quais formigas alimentos devem ser grande o suficiente para permitir-lhes livremente alimentar para cerca de 5 s.
   4. Repita este procedimento 10 x, com um ITI de 5 min.
      Nota: Nestas experiências, formigas foram sempre viradas para a direita, com seu olho direito perto do lado aberto da caixa de acrílico. Portanto, o CS sempre se aproximou as formigas do seu lado direito. Embora isto não invalida a aprendizagem, estas experiências podem ser conduzidas rodando metade das formigas para a esquerda e metade para a direita, para evitar qualquer efeito possível lateralização.
3. Formação da marcação sem paridade
   Nota: Este treinamento consiste em apresentar as formigas o CS ou os EUA separadamente, esses dois estímulos, sendo, assim, dissociado do outro ao longo do tempo (Figura 1).
   1. Começa a gravar as formigas 10 s antes de cada ensaio.
   2. Apresentar o CS da mesma maneira como em formação emparelhada, mas não entregam a sacarose para a formiga.
   3. Após 2,5 min, entrega os EUA diretamente para o aparelho bucal (também tocando as antenas) usando uma seringa sem o CS anexado.
   4. Comece com um julgamento de CS e repita este procedimento 10 x para cada tipo de julgamento, intercalante-los com um ITI de 2,5 min.
4. Teste
   Nota: Um teste deve ser realizado apenas 1 x, ou 10 min ou 1 h após o último julgamento de formação; um teste em que a formiga é apresentada com o CS, mas não com os Estados Unidos poderia causar a extinção da memória associativa formada anteriormente.
   1. Começa a gravar as formigas 10 s antes do teste.
   2. Apresentar o CS a formiga por cerca de 10 s.
   3. Certifique-se de que a formiga é ainda motivada para alimentar através da apresentação de sacarose após o teste.

4. análise e coleta de dados

1. Registrar o comportamento da formiga, acima, 10 s antes de cada ensaio e durante as apresentações de CS e Estados Unidos. Certifique-se de que todos os ensaios e testes são gravadas para análise posterior.
2. Usando as gravações feitas durante o treinamento e os testes, marcar respostas das formigas durante os 10 s de apresentação do CS.
3. Separar as respostas das formigas durante a apresentação do CS em três tipos de comportamento, dependendo da extensão e da circulação do aparelho bucal: extensão completa com movimento (FEM) como se alimentar, extensão completa sem movimento (FE) ou parcial de extensão (PE) do palpos maxila-labium ou maxilar (Fig. 2A - 2D). Para análise, o grupo todos os tipos de MaLER como única resposta (Figura 2E).
4. Exclua qualquer formiga que fez não alimentar em cada julgamento e teste.
   Nota: Para análise, é recomendável um teste estatístico que tem formigas individuais em conta, assim, contabilização de variabilidade dentro de indivíduos. Quando a classificação das respostas das formigas durante o treinamento de uma forma binária (1 para respostas positivas e 0 para nenhuma resposta), regressão logística com efeitos mistos é aconselhável^16,19. Para comparar a proporção de formigas respondendo em cada teste, um Gou julgamento de treinamento-teste ou teste exato de Fisher é recomendado, dependendo do número de formigas foram analisados^16,20.

Resultados

Durante experimentos de condicionamento clássico, o CS não deve induzir uma resposta espontânea nos animais. Nos experimentos conduzidos, apenas 3% - 4% das formigas realizada MaLER em resposta para a indicação visual no primeiro julgamento, antes do treinamento. Formigas que estavam em uma formação emparelhada realizada MaLER cada vez mais em resposta ao CS (Figura 3A; regressão logística, N = 51, graus de liberdade (df) = 507, z = 5.949, p < 0,01). A porcentagem de formigas emparelhadas que respondem ao CS se estabilizou ao redor 50%, do terceiro julgamento em diante. Pelo contrário, formigas não pareadas mostrou não significativas aumentam MaLER durante o treinamento (Figura 3B; regressão logística, N = 29, df = 287, z = 0.758, p = 0,45). A ocorrência de MaLER, em resposta à sugestão visual foi significativamente maior durante emparelhado do treinamento da marcação sem paridade (regressão logística, N = 80, df = 796, z =-5.306, p < 0,01), que era verdade para cada julgamento, exceto a primeira (tabela 1).

Pela análise de sua curta e uma memória de médio prazo¹⁵, testaram-se as formigas ou 10 min ou 1 h após o último julgamento de treinamento. Para ambos os testes, a proporção de formigas realizando MaLER em resposta ao CS foi significativamente maior quando tinha sido objecto de formação emparelhada ao invés da marcação sem paridade (Figura 3 e 3D; A tabela 1).

Durante a formação, individuais formigas mostraram uma variação substancial no número e tipo de MaLER que exibidas (Figura 4A e 4B). Apenas 14% das formigas emparelhadas respondeu em cada julgamento do segundo ou terceiro ensaio para a frente, enquanto a maioria das formigas alternavam entre ensaios em que responderam e em que não o fizeram. Sobre os estudos de formação em que as formigas responderam, o grau em que eles estendido e moveu suas peças bucais variadas. Portanto, dividimos MaLER em três tipos diferentes: FEM, FE ou PE. Normalmente, as formigas realizada FEM ou PE mais frequentemente do que FE. No entanto, apenas algumas formigas realizadas consistentemente o mesmo tipo de resposta; na maioria dos casos, as formigas mostraram pouca consistência no tipo de MaLER executaram (Figura 4).

Figura 1 : Montagem experimental e regime de treinamento. Fix (A) a formiga com cera para um inseto pino anexada a modelagem de uma cilindro de argila (laranja) e coloque um suporte sob medido no fundo para permitir uma postura naturalista. Coloque-o dentro de uma caixa de acrílico branca iluminada por duas fontes de luz, diretamente debaixo de uma câmera. Use como o estímulo condicionado (CS) um papelão (quadrado azul) anexado à seringa que proporciona o estímulo unconditioned (nós), uma recompensa de açúcar. O baixo-relevo mostra uma close-up vista de uma formiga no suporte. (B), a ponta da seringa agulha é movida mais perto possível a cabeça da formiga, mas sem tocar as antenas conforme este esquema. Formigas de trem através de qualquer um (C) emparelhados ou pareado (D) formação. Esta figura foi modificada de Fernandes et al . ¹⁶. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : O maxilar-Labium extensão resposta de formigas madeira. Quadros individuais de gravações de vídeo mostram movimentos da parte das formigas boca durante o treinamento. (A), este painel não mostra nenhuma resposta. (B) este painel mostra uma extensão completa (FE) do maxilar-labium que finaliza a glossa. (C), este painel mostra uma extensão parcial (PE) com apenas o maxilar palpus visível. (D), este painel mostra uma extensão parcial (PE) das estruturas na maxila-labium. (E) formigas em formação emparelhada (N = 51) executar uma extensão completa com movimento (FEM; marrom escuro), FE (castanho médio) ou um PE (marrom claro). Esta figura foi modificada de Fernandes et al . ¹⁶. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Forma de formigas memórias associativas de uma sugestão visual emparelhadas com uma recompensa de açúcar de madeira. (A), o percentual de formigas emparelhados (N = 51) realizar MaLER em resposta à apresentação CS significativamente aumentada durante o treinamento. (B) a percentagem de formigas realizando MaLER não aumentou significativamente durante todo o treino da marcação sem paridade (N = 29). Formigas foram testados (C) 10 minutos (emparelhados: N = 15; desirmanada: N = 15) ou (D) 1 hora (emparelhados: N = 15; desirmanada: N = 14) após o último julgamento de treinamento. A porcentagem de formigas respondendo ao CS, durante e depois do treino emparelhado ou da marcação sem paridade são representados em marrom ou cinza, respectivamente. Os três tipos de MaLER são representados no escuro (FEM), médio (FE) e tons de luz (PE). Esta figura foi modificada de Fernandes et al . ¹⁶. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Desempenho individual de formigas durante o treinamento. Estes painéis mostram os desempenhos individuais do (A) formigas emparelhadas e (B) não pareadom formigas. Os três tipos de MaLER são representados no escuro (FEM), médio (FE) e marrom claro (PE) ou cinza. Esta figura foi modificada de Fernandes et al . ¹⁶. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Julgamento	N	DF	G (ajustado)	P
1	80	at	at	> 0.1
2	80	1	3.86	< 0.05
3	80	1	8.41	< 0,01
4	80	1	6.63	< 0,01
5	80	1	8.41	< 0,01
6	80	1	7.5	< 0,01
7	80	1	10.69	< 0,01
8	80	1	11.76	< 0,01
9	80	1	17,13	< 0,01
10	80	1	17,13	< 0,01
10 min	59	1	5.5	< 0.05
1 h	59	1	4.42	< 0.05

Tabela 1: comparação das respostas de MaLER ao CS entre formigas que tinham sofrido emparelhado e desirmanada treinamento, para cada julgamento e teste O número de formigas (N), graus de liberdade (df), G-teste de independência (G) e p-valor são mostrados. O primeiro julgamento foi analisado com o teste exato de Fisher, um. Esta tabela foi modificada de Fernandes et al . ¹⁶.

Discussão

Condicionamento clássico é um dos paradigmas mais bem estabelecidos para estudar aprendizagem e memória. O protocolo que aqui apresentamos é uma adaptação do paradigma concebido para mel abelha trabalhadores^2,3 e subsequentemente usado com várias outras espécies, como abelhas, moscas de fruta, que também utilizam PER como uma leitura para o aprendizado de^{10 ,11}e gafanhotos e formigas, que uso POR e MaLER, respectivamente de^12,13. Usando este protocolo, é possível treinar formigas de madeira aproveitadas para aprender a associação entre uma indicação visual e uma recompensa de açúcar e analisar a retenção desta curta - (10 min) e o meio-termo (1 hora) de memória¹⁶.

Em qualquer experimento comportamental, é necessário ter em conta as etapas críticas que podem minimizar a variabilidade nas respostas dos animais. No protocolo apresentado aqui, várias medidas são tomadas para minimizar a variabilidade antes e durante o treinamento. Antes do início dos experimentos, a colônia precisa estar faminto pelo menos dois dias e formigas devem ser seleccionadas com base na sua vontade de comer de uma gota de açúcar em caixa de exploração. Selecionar as formigas desta forma destina-se a maximizar as chances de formigas de formação que estão motivados para alimentar. Cuidado de manipulação também é uma consideração importante porque pode ajudar a reduzir os níveis de estresse, que interrompe a aprendizagem se for muito intenso,²¹. Para este fim, formigas devem ser anestesiadas com frio de permanecer imóvel enquanto sendo aproveitada, porque qualquer movimento (para escape) durante este procedimento poderia ser uma fonte de stress. Além disso, o contato entre a formiga e a cera deve ser mínimo, evitando o contato entre as antenas e a cera quente ou arame, que pode causar danos. Embora estas observações não foram analisadas formalmente, as antenas parecem mover-se com um padrão específico durante a aprendizagem.

Durante experimentos, cuidadosa entrega do açúcar também é importante para manter as formigas motivado. Novamente, enquanto isto não tem sido analisado formalmente, entrega de comida abrupta parecia causar estresse adicional para a formiga, que por sua vez, levou a uma falta de motivação e aprendizagem. Além disso, a sacarose entregada durante o treinamento deve ser de uma concentração reduzida (200 g/L) para evitar a saciedade antes do final do treinamento e teste. Isso permite que MaLER ser uma resposta incondicional do bom candidato porque, juntamente com um baixo desempenho espontâneo desta resposta para a indicação visual, também não saturar durante os ensaios. Por último, ao contrário da maioria dos condicionamento clássico estudos^{2,3,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13}, treinamos uma formiga na época até o final do experimento, deixando-o em lugar entre ensaios, ao invés de removê-lo para testar outra formiga. Formação várias formigas juntos parece produzir resultados mais variáveis, que podem ser devido a um aumento do estresse e/ou conflito entre informação visual causada pela completa mudança do cenário. Para reduzir a duração de cada experimento, usamos um ITI de 5 minutos em vez do ITI de 10 minutos, usado na maioria dos estudos de condicionamento clássico¹⁶. Apesar de todas estas considerações devem ajudar a garantir que as formigas são motivadas para alimentar e aprender durante o treinamento, alguns variabilidade não pode ser evitada. Recomendamos usar formigas que parecem ter comportamento social, repetido e locomoção normal e excluindo as formigas da análise no momento em que eles não conseguem se alimentar de um julgamento de treinamento ou um teste.

A natureza do CS não foi testada neste estudo. Embora nós usamos um estímulo visual azul porque formigas do mesmo gênero são sensíveis a estes comprimentos de onda de¹⁸, outras cores também podem ser aprendidas em associação com uma recompensa. Experimentos mais seria necessário para caracterizar totalmente as cores sendo visto e aprendido neste set-up. Isto também é verdadeiro para diferentes formas e tamanhos da indicação visual. Nós não testamos se a resolução espacial das formigas seria suficiente para distinguir o estímulo visual apresentado aqui na distância dos olhos das formigas, foi apresentada no. Embora olhos compostos de madeira das formigas têm sido descritos em termos de tamanho e número de facetas²², nosso conhecimento, sua resolução espacial não foi totalmente descrita ainda. No entanto, este foi calculado para Melophorus magoti²³. Uma caracterização semelhante de madeira das formigas, ou os olhos dos outros insetos testados contribuiria para uma investigação clara das características da indicação visual está sendo observado e aprendido pelos animais. Além disso, incluímos o movimento ao apresentar o estímulo visual para a formiga, porque mostrou a desempenhar um papel na aprendizagem associativa de abelhas durante o condicionamento clássico⁶. No entanto, isto foi também não testado neste estudo e, devido à natureza de movimento diferente dos insetos comparados a andar de insetos voadores, diferenças entre abelhas e formigas condicionamento clássico visual poderiam ser observadas.

Em uma nota final, nos foi possível examinar a retenção da memória a longo prazo porque as formigas não sobreviveu sendo aproveitada por períodos tão longos após o treino. No entanto, em séries subsequentes de experimentos, mantivemos as formigas vivo e motivado a comer e aprender quando aproveitado e deixou-os durante a noite em um ambiente escuro e úmido (colocação de uma caixa por cima deles). Portanto, este paradigma poderia ser usada para desvendar a retenção da memória a longo prazo das formigas de madeira, além de memória de curto e médio prazo.

Com este procedimento simples, adaptado de paradigmas gerais condicionamento clássico, é possível estudar a aquisição e retenção de memórias visuais no aproveitado formigas de madeira, que têm sido estudadas amplamente em paradigmas usando animais em movimento livre. Este paradigma tem potencial para ser usado para analisar a base neural da aprendizagem visual em um modelo muito bem estabelecida para a navegação de insetos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluon	Blades Biological Ltd, Edenbridge, UK	ACS 109; ACS 112; ACS 114	For preventing insects from scaping
Crickets	Blades Biological Ltd, Edenbridge, UK	LZJ 217	Given to the ant colonies as protein source
Natural Pine Rosin/Resin	Minerals-water Ltd, Rainham, UK	500g	Given to the ant colonies for sanitation
Austerlitz Insect Pin	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	26000-40	For harnessing ants
High speed camera	Edmund Optics Inc., Barrington, USA	eo-13122M	MaLER recordings during training and testing
Macrolens	Cannon, Surrey, UK	EF 100 mm f/2.8 L Macro IS USM	MaLER recordings during training and testing
Software	IDS Imaging Development Systems GmbH	uEye64	MaLER recordings during training and testing
Blue Cardboard	john smith's at Union Store, University of Sussex	JACK-PJM41358	Constitutes de conditional stimulus
Syringe	Fisher Scientific LTD, Loughborough, UK	BD Plastipak 300185case; Product Code.12369289	US and CS (attached) presentation
Needle (0.5 x 16 mm)	Fisher Scientific LTD, Loughborough, UK	BD Microlance 300600; Product Code:10442204	US and CS (attached) presentation