Pannello di immunofluorescenza Multiplex automatizzato per gli studi di Immuno-oncologia su campioni di tessuto in formalina Carcinoma

Riepilogo

Un protocollo dettagliato per un pannello indicatore di sei multiplex immunofluorescenza è ottimizzato ed eseguito, utilizzando un coloratore automatico per risultati più coerenti e un tempo di procedura più breve. Questo approccio può essere adattato direttamente da qualsiasi laboratorio per studi di immuno-oncologia.

Abstract

Continui sviluppi in immuno-oncologia richiedono una maggiore comprensione dei meccanismi di immunologia del cancro. L'analisi di immunoprofiling dei campioni di tessuto da biopsie (FFPE) formalina-fisso e paraffina-incastonato è diventata uno strumento fondamentale per la comprensione della complessità dell'immunologia dei tumori e alla scoperta di nuovi biomarcatori predittivi per immunoterapia del cancro. Immunoprofiling analisi dei tessuti richiede la valutazione degli indicatori combinati, compreso sottopopolazioni delle cellule infiammatorie e immunitarie Checkpoint, nel microambiente tumorale. L'avvento dei metodi immunohistochemical multisala romanzo consente una più efficiente analisi multiparametrica delle sezioni del tessuto singolo rispetto a standard Levansucrasi immunohistochemistry (IHC). Una immunofluorescenza multiplex disponibile in commercio (se) metodo è basato sull'amplificazione del segnale di microarray e, combinato con l'analisi al microscopio multispettrale, consente una migliore separazione del segnale dei diversi marcatori nel tessuto. Questa metodologia è compatibile con l'uso di anticorpi primari non coniugati che sono state ottimizzate per standard IHC su campioni di tessuto FFPE. Qui descriviamo dettagliatamente un protocollo automatizzato che consente multiplex se etichettatura dei campioni di tessuto di carcinoma con un pannello di sei-marker della malattia multisala composta da PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 e i cytokeratins AE1/AE3 con 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole come una colorazione nucleare delle cellule. Il protocollo di pannello multiplex è ottimizzato in un coloratore automatico di IHC per un tempo di colorazione che è inferiore a quella del protocollo manuale e può essere direttamente applicato e adattato da qualsiasi ricercatore di laboratorio per gli studi di immuno-oncologia su campioni di tessuto umani FFPE. Sono anche descritti diversi controlli e strumenti, tra cui un metodo di controllo di goccia per controllo di qualità fine di un nuovo pannello se multiplex, che sono utili per l'ottimizzazione e convalida della tecnica.

Introduzione

Immunoprofiling analisi dei campioni di tessuto tumorale FFPE è diventata una componente essenziale degli studi di immuno-oncologia, in particolare per la scoperta e validazione di nuovi biomarcatori predittivi per immunoterapia del cancro nel contesto di studi clinici^{1 ,2}. Cromogenico IHC, utilizzando cromogeni chimici quali diaminobenzidina, rimane la tecnica standard in patologia diagnostica per il immunolabeling di biopsia del tessuto³. IHC standard può essere utilizzato anche per il cancro del tessuto immunoprofiling, compresa la quantificazione delle sottopopolazioni dei linfociti tumore-collegati e la valutazione dei livelli di espressione di checkpoint immuni come ligando di morte programmata delle cellule 1 (PD-L1)^{4 ,5}. IHC standard è limitata, tuttavia, in quanto solo un antigene possa essere etichettato per ogni sezione del tessuto. Perché gli studi immunoprofiling in genere richiedono l'analisi dell'espressione combinata di parecchi indicatori, l'uso di IHC standard richiederebbe la colorazione di sezioni di tessuto più, ciascuno macchiato con un singolo marker e, pertanto, sarebbe limitata sostanzialmente per l'analisi di piccoli campioni di tessuto quali le biopsie dell'ago di nucleo. Metodi standard di IHC sono anche limitati per la valutazione degli indicatori che sono coespressi di popolazioni di cellule diverse, come è comune con gli indicatori checkpoint immuni quali PD-L1, che è espresso da macrofagi associati al tumore e cellule tumorali. Questa limitazione è stata segnalata in, ad esempio, l'uso di standard Levansucrasi IHC dai patologi per l'analisi quantitativa di un marcatore IHC espresso dalla cella diversi tipi⁶. Lo sviluppo di tecniche IHC cromogenici multiplex che impiegano diversi cromogene colorate sulla stessa tessuto sezione rappresenta un avanzamento sopra il metodo standard di Levansucrasi IHC,⁷ anche se rimangono limitato dalla immunolabeling di pochi marcatori e presenti anche un'importante sfida tecnica per la corretta valutazione di marcatori espressi nei compartimenti subcellulari stessi delle stesse popolazioni cellulari.

Le suddette avvertenze relative alla disponibilità di tessuto da campioni clinici, così come le limitazioni delle multisala cromogenici tecniche IHC, hanno dato origine alla necessità di sviluppare metodi migliori multisala per studi di immuno-oncologia basati su Contrassegno fluorescente combinati con sistemi che possono efficacemente separare i segnali di fluorofori più dalla stessa diapositiva di imaging. Una tale tecnica è basata sull'amplificazione di segnale di microarray (TSA) combinato con formazione immagine di microscopia multispettrali per colore efficiente separazione⁸. Un kit disponibile in commercio basati su TSA impiega fluorofori ottimizzato per imaging multispettrale⁸ (Vedi Tabella materiali). Un vantaggio fondamentale di questo sistema è la sua compatibilità con gli anticorpi primari senza etichetta stessi che già sono stati convalidati e ottimizzato per standard cromogenico IHC^9,10,11. Questo consente non solo di ottimizzazione più veloce ma anche di flessibilità le modifiche al pannello e ottimizzazione che incorporano nuovi obiettivi. Inoltre, il metodo di immunofluorescenza multiplex (mIF) TSA può essere ottimizzato per commercialmente disponibili sistemi automatizzati di stainer IHC, consentendo per un semplice trasferimento da Levansucrasi cromogenico IHC MIF.

Qui presentiamo un protocollo per un pannello di mIF per studi di immuno-oncologia che si basa su mIF TSA colorazione automatizzata e utilizza uno scanner multispettrale per l'imaging. Questo protocollo può essere adattato e modificato da qualsiasi utente di laboratorio con accesso alla strumentazione descritta e reagenti. Il protocollo include un pannello di sei anticorpi primari per l'immunoprofiling dei carcinomi: PD-L1, PD-1, CD68 (come marcatore pan-macrofago), CD8 (cellule T citotossiche), Ki-67 e AE1/AE3 (vaschetta-cytokeratin, utilizzato come indicatore epiteliale per l'identificazione di cellule di carcinoma). Un recente studio descrive l'ottimizzazione di un protocollo di mIF TSA manuale utilizzando cromogenico IHC come uno standard di riferimento per convalidare il multiplex macchiatura¹². Il metodo aggiornato qui presentato è stato sviluppato utilizzando un kit TSA commercialmente disponibili, sette colori ottimizzato in un coloratore automatico, accorciando drasticamente il tempo di colorazione da 3 – 5 giorni alle 14h, migliorando anche la consistenza della colorazione. Oltre al protocollo principale dettagliato presentato qui, una sezione di Materiali supplementari include il metodo "goccia-control", un processo di ulteriore controllo di qualità per valutare un nuovo pannello di mIF, come pure le note tecniche per l'ottimizzazione, risoluzione dei problemi e lo sviluppo di nuovi pannelli multiplex per aiutare l'utente di laboratorio per configurare e ottimizzare il metodo TSA mIF per pannelli personalizzati mIF.

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Protocollo

Nota: Il protocollo presentato qui viene descritto come eseguire la immunoprofiling di un pannello di mIF utilizzando TSA per sei anticorpi (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 e AE1/AE3) su un coloratore automatico (Vedi Tabella materiali). Il protocollo descrive anche come eseguire i controlli di trascinamento per un controllo di qualità di un nuovo pannello di mIF (Vedi Materiali supplementari). In questo protocollo, la colorazione viene eseguita con FFPE otto vetrini dalla tonsilla umana (controllo positivo) e otto vetrini da adenocarcinoma del polmone umano. La prima diapositiva viene utilizzata per intero multiplex macchiatura con tutti i sei indicatori, la seconda diapositiva per il controllo di isotipo in cui non sono utilizzati anticorpi primari e le rimanenti sei diapositive per i controlli di goccia (Vedi Materiali supplementari). Un ulteriore controllo per tessuto autofluorescenza è altamente consigliato e dovrebbe sempre essere inclusi in un multiplex di studio (Vedi Materiali supplementari). Tuttavia, gli investigatori possono impiegare altri tipi di tumore e controlli secondo i propri obiettivi di progetto. Utenti di laboratorio senza precedente esperienza con il metodo TSA di mIF e tecniche dello scanner multispettrali dovrebbero leggere la Guida di sviluppo di IHC Multiplex (disponibile online su http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Sebbene questa guida descrive un protocollo manuale, ma fornisce anche una buona introduzione per il mIF metodo di colorazione. Tutte le sezioni di tessuto impiegate in questo protocollo sono stati resi anonimi e omologate secondo la dichiarazione di Helsinki.

1. campioni di tessuto

1. Selezionare un campione di tonsille umano FFPE contenente l'iperplasia linfoide da utilizzare come controllo positivo e un campione di adenocarcinoma del polmone umano FFPE notoriamente PD-L1 positivo. Esaminare i vetrini ematossilina ed eosina (H & E) i blocchi di cancro del polmone selezionato per confermare la presenza di un tumore. È importante evitare i tumori con abbondanti aree di necrosi, come questo può aumentare la colorazione di fondo non specifici.
   Nota: Per questa ottimizzazione, evitare l'utilizzo di blocchetti di paraffina che sono stati conservati per 10 anni o più e tessuto con un'apparenza secco nel blocco di paraffina (consultare un tecnico di istologia).
2. Con un microtomo, tagliare 10 sezioni seriali consecutive da ogni blocco, 4 µm di spessore. Montare le sezioni su un vetrino positivamente utilizzato per IHC, una sezione per ogni diapositiva.
   Nota: Sezioni devono essere montati perfettamente piatto, senza rughe, come le rughe possono generare artefatti di colorazione. Le diapositive delle sezioni seriali da 1 a 10 il numero.
3. Preparare una nuova diapositiva di H & E sulla prima sezione. Esaminare il vetrino H & E con l'aiuto di un patologo per confermare la presenza di tumore del polmone o del tessuto di tonsilla rimanente nel blocco.
   Nota: Questa diapositiva H & E può aiutare, più tardi, con la selezione delle regioni di interesse per l'analisi multispettrali e phenotyping.
4. Conservare le sezioni non macchiate in una scatola di plastica slide a 4 ° C fino a tre mesi.

2. creazione di un nuovo mIF programma di colorazione su un coloratore automatico: registrazione dei reagenti

Nota: I reagenti devono essere aggiunto all'elenco di reagente nel software coloratore automatico prima che siano disponibili per l'uso nei protocolli. Vedi la Tabella materiali per informazioni sul coloratore automatico modello e versione del software.

1. Fare clic sulla scheda reagenti all'interno del software coloratore automatico. Fare clic su Aggiungi per designare un nuovo reagente. Immettere il nome (ad es., "520 TSA reagente") e il nome abbreviato (ad es., "TSA 520"), notare che c'è un massimo di otto caratteri. Selezionare Accessori dal menu a discesa e impostare il fornitore. Non modificare Singola/doppia macchia da Single/sequenziale DS. Impostare il valore predefinito protocollo a F protocollodi colorazione. Impostare il protocollo HIER predefinito a ER1 20.
2. Salvare il nuovo reagente e ripetere il passaggio 2.1 per tutti i reagenti elencati nella tabella 1.

3. automatizzato Stainer: Registrazione dei contenitori

1. Scrivere il nome del reagente per essere utilizzato sul lato di ogni contenitore. Eseguire la scansione del codice a barre sul lato. Nella finestra a comparsa, selezionare il reagente corretto dall'elenco. Selezionare una data di scadenza e salvare.
2. Ripetere la procedura nel passaggio 3.1 per tutti i reagenti elencata nella tabella 1.
3. Registrare il Kit Open Research. Entrambi i codici a barre dal lato il kit di scansione e seguire le istruzioni visualizzate sullo schermo. Nome il kit "Multiplex ricerca Kit 1". Registrare il 1 x tris (idrossimetil) amminometano (Tris)-soluzione tampone come parte di questo kit (tabella 1).

4. automatizzato Stainer: Creazione di un protocollo programma mIF

1. Il protocollo base multisala è precaricato con il nome Opal 7 Multiplex con nuovi coloratori automatici (Vedi il modello e versione del software nella Tabella materiali). Individuare il protocollo filtrando per «tutti» invece di «preferito» sullo schermo di protocollo. Se il protocollo di base non è presente, quindi di aggiornare il software coloratore automatico con assistenza al produttore.
2. Tutte le modifiche devono essere effettuate sulle copie del protocollo originale. Prima di apportare modifiche, salvare l'originale e creare una copia facendo clic sulla scheda protocolli , quindi clic destro il protocollo Opal 7 Multiplex e selezionando copia.
3. Modificare il nome di protocollo 7 Multiplex 1 nella nuova finestra e selezionare la scheda connessa con il dispositivo corretto (modello da pavimento o da tavolo). Corrispondere il protocollo supplementare tabellaS1. Fare clic su Aggiungere Reagente per aggiungere un passaggio di inibizione di perossidasi di 10 min (non fa parte del protocollo standard) e selezionare l'inibitore perossidasi come il reagente.
4. Confermare che la procedura di blocco utilizza un tampone bloccante PKI. Assicurarsi che ogni anticorpo primario riferimento al reagente appropriato, che i passaggi di anticorpo secondario utilizzano un polimero HRP, e quello spettrale 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) fornito con il kit di automazione multispettrali è utilizzata. Confermare tutte le scelte controllando il reagente che è stato designato per ogni rispettivo passaggio nel menu a discesa sullo schermo di protocollo.

5. automatizzato Stainer: Aggiunta di controlli Drop e Isotype Control Protocol

1. Copiare il nome protocollo 7 Multiplex 1 e modificarlo in 7 protocollo Multiplex 1 CD68 DROP. Modificare il reagente anticorpo CD68 Mouse IgG e salvare il protocollo.
2. Creare più sei nuovi protocolli, uno per ogni controllo di goccia e uno per il controllo completo dell'isotipo (cambiando tutti gli anticorpi per l'appropriato isotipi) nello stesso modo.

6. Stainer automatizzato: Protocollo di preparazione Slide

1. Copiare il protocollo prestaining * cuocere e Sparaffinatura e rinominare questo protocollo cuocere multispettrali e Sparaffinatura 2 h.
2. Regolare il protocollo per abbinare i reagenti indicati nella tabella 2. Diapositive di cuocere per 2 ore a 60 ° C. Sparaffinatura per 30 s a 72 ° C.

7. automatizzato Stainer: Preparazione dei reagenti

1. Preparare un kit di rilevazione di ricerca. Un reagente deve essere permanentemente associato con questo kit, quindi riempire il contenitore aperto 30 mL contrassegnati per soluzione fisiologica tamponata 1x (TBS) con 1 x TBS e individuare questo in posizione 1 (più lontana la maniglia) nel kit rilevamento ricerca designato Multiplex ricerca Kit 1. questo reagente sarà permanentemente associato con questo kit di ricerca e non deve cambiare posizione per un utilizzo futuro.
2. Etichetta due contenitori aperti 30ml Blocco multispettrali e Multispettrali secondario. Riempire il contenitore di Blocco multispettrali con 30 mL di tampone/anticorpo blocco diluente dal kit di colorazione multispettrali. Riempire il contenitore Multispettrali secondario con 30 mL di polimero di anticorpo secondario anti-mouse/anti-coniugato dal kit di colorazione multispettrali.
3. Preparare dieci contenitori aperti di 7 mL. Il volume richiesto in microlitri è 600 + (150 x [numero di diapositive]). Ogni anticorpo si applicherà a 12 diapositive in questo caso (tonsilla sei e sei del polmone). L'etichettatura e i volumi per tutti i contenitori sono indicati nella tabella 3.
4. Per ogni provetta di anticorpo, aggiungere innanzitutto l'anticorpo diluente, seguito dall'anticorpo primario concentrato nei volumi indicati nella tabella 3. Mescolare pipettando delicato.
5. Preparare un contenitore aperto di 7 mL per DAPI, utilizzando quattro gocce di concentrato DAPI per millilitro di acqua bidistillata; un totale di 16 sarà colorato con DAPI (600 + [150 x 16] = 3.000 µ l). Aggiungere 3 mL di acqua bidistillata plus 12 gocce di DAPI spettrale nel contenitore. Preparare fresco DAPI per ogni esecuzione.
6. Preparare un contenitore aperto di 7 mL inibitore perossidasi. Tutte le 16 diapositive saranno trattate con inibitore perossidasi (600 + [150 x 16] = 3.000 µ l). Aggiungere 3 mL di blocco della perossidasi nel contenitore.
7. Prima di preparare le concentrazioni di lavoro di fluors, risospendere tutti fluors liofilizzato aggiungendo 75 µ l di solfossido dimetilico ad ogni tubo fluor fornito dal produttore. Mescolare pipettando. Questo è lo stock di fluor TSA. Conservare a 4 ° C.
8. Preparare sei contenitori di titolazione, uno per ogni fluor. Il volume richiesto in microlitri è 350 + (150 x [numero di diapositive]). Ogni fluor si applicherà a 16 vetrini in questo caso (tonsilla otto e otto del polmone). L'etichettatura e i volumi per tutti i contenitori sono indicati nella tabella 4.
9. Quando tutti i reagenti sono stati registrati e preparati, posizionare ogni contenitore in qualsiasi posizione su una cremagliera e caricare tutti i reagenti sul coloratore automatico. La sonda confermerà il volume di ogni reagente.

8. automatizzato Stainer: Campione Setup e macchiatura multispettrali

1. Nel software coloratore automatico, fare clic su installazione di diapositiva nella parte superiore dello schermo. Fare clic su Aggiungi studio. Compilare la finestra pop-up con la studio ID, nome studio e i commenti.
   1. Selezionare il nome del ricercatore conducendo la corsa colorazione dall'elenco a discesa. Lasciare il volume di distribuzione 150 µ l. Selezionare multispettrali Sparaffinatura per protocollo di preparazione. Fare clic su OK e Aggiungi slide. In Commento, digitare "Multiplex 1 polmone 123ABC." Completare i seguenti campi come indicato: Tessuto tipo = tessuto Test; Volume di distribuzione = 150 µ l; Modalità di colorazione = singolo, Routine; Indicatore = negativo; La macchiatura = Digitare "7 Multiplex protocollo n. 1"; Preparazione = multispettrali Bake, Sparaffinatura 2h; HIER = HIER 20 min con ER1.
2. Fare clic su Aggiungi slide e modificare i commenti e il protocollo per aggiungere i vetrini di controllo discesa e isotype vetrino di controllo. Quando tutte le diapositive sono state aggiunte allo studio, chiudere la finestra Aggiungi slide e stampare le etichette. Applicare le etichette per l'area di etichetta appropriata su ogni diapositiva.
3. Caricare i vetrini in rack, applicare piastrelle di copertura con l'orientamento corretto, inserire le cremagliere coloratore automatico e abbassare i vassoi. Il dispositivo esegue la scansione delle etichette di diapositiva.
4. Quando tutte le diapositive e i reagenti sono stati analizzati e misurati. Il pulsante di marcia (►) diventerà attivo. Se autostainer rileva eventuali errori, ad esempio il volume di Reagente insufficiente, apparirà un simbolo di attenzione giallo dal vassoio interessato. Se si verifica un errore, fare clic destro il simbolo di attenzione e rimediare l'errore.
5. Avviare immediatamente la macchiatura o programmare la partenza ritardata. Il protocollo è circa 14 h in durata. Nota: Garantire che il protocollo verrà completata in un momento quando le diapositive possono essere rimossi immediatamente quanto exess lavaggio potrebbe influire risultati della colorazione.

9. coprioggetto delle diapositive multispettrali

1. Rimuovere le diapositive dal coloratore automatico e memorizzarli in un rack sommerso in 1 x TBS.
2. Montare i campioni con vetrini coprioggetti n. 1,5 e 15 µ l del supporto di montaggio (Vedi Tabella materiali). Rimuovere eventuali bolle premendo delicatamente il vetrino coprioggetti con un puntale.
3. Lasciare i vetrini curare una notte a temperatura ambiente su banco di laboratorio. Non polimerizzati diapositive possono essere analizzati immediatamente con un'attenta gestione.

10. multispectral Scanner

1. Accendere lo scanner multispettrale e al suo computer (Vedi Tabella materiali per informazioni modello e software). Avviare il software di controllo del microscopio. Aprire lo sportello anteriore dello scanner multispettrali premendo il tasto sensibile al tocco sulla parte anteriore del dispositivo. Ogni vettore a molla nello scanner detiene quattro diapositive. Caricare tutte le diapositive in vettori e registrare l'ordine prima di caricare i supporti nel dispositivo.
2. Selezionare Edit protocollo e fare clic su nuovo...; quindi, creare il nome del protocollo 1 pannello Multiplex e controlli Drop. Creare il nome di Studio Multiplex pannello sviluppo, fare clic su Creare protocolloe digitare Panoramica scansione filtro DAPI; quindi, selezionare Intero Slide scansione e Risoluzione Pixel 0,50 µm (X 20). Tutti i filtri e bande dovrebbero essere rappresentati. In caso contrario, fare clic su Modifica filtri e gruppi, selezionare tutte le cinque filtri (DAPI, FITC, Texas Red, CY3 e CY5) e quindi fare clic su Modificare le esposizioni.
3. Caricare il vettore selezionando l'elemento portante con il multiplex completo dell'adenocarcinoma del polmone. Selezionare la diapositiva corretta utilizzando l'interfaccia grafica utente. Concentrare il tessuto manualmente o utilizzando la messa a fuoco automatica. Passate a qualsiasi area con la colorazione DAPI accettabile e fare clic su Auto-esporre per impostare l'esposizione in millisecondi (0 – 2.000 ms).
4. Ripetere la stessa procedura per tutti i cinque set di filtri nelle colonne scansione intero e regione di MSI. Essere sicuri di passare a un'area con la macchiatura accettabile e rimettere a fuoco il microscopio prima di impostare l'esposizione per ogni livello di ingrandimento e filtro. Auto-esporre per tutti e cinque i filtri in un 20 x scansione complessiva e 20 x multispectral imaging multispettrale regioni per (MSI). Selezionare una risoluzione di pixel di 0,50 µm (20x). Salvare il protocollo e fare clic su indietro per tornare alla schermata iniziale del software Vectra; quindi, fare clic su Scansione diapositive.
5. Aprire l'interfaccia per ogni diapositiva e impostare attività per eseguire la scansione. Impostata Studio Multiplex pannello sviluppo, impostare protocollo ai controlli Drop e Multiplex pannello 1e impostato ID di diapositiva Multiplex polmone ABC123, Multiplex CD68 Drop polmone ABC123, ecc . Quando tutte le diapositive sono state etichettate e vengono impostate le attività, fare clic su scansione. Lo scanner multispettrale automatizzato esegue scansioni full-diapositiva di tutte le diapositive utilizzando tutti i cinque filtri.

11. multispectral Scanner: Multispectral Imaging

1. Una volta completate le scansioni, aprire il software QPTIFF ("Phenochart") e fare clic su Diapositiva di carico in alto a sinistra. Questo aprirà un QPTIFF, che è una scansione di tutto-diapositive di cinque-filtro. Ogni livello contiene informazioni da più di un fluor, quindi l'utilità è limitata, ma la struttura dei tessuti e modelli ampia espressione sono evidenti e possono essere utilizzati per selezionare le regioni per MSI.
2. Individuare e aprire la diapositiva corretta nello studio utilizzando l'elenco a discesa albero sulla sinistra. Il login (alto a destra) con iniziali dell'utente.
3. Selezionare cinque regioni per MSI utilizzando lo strumento timbro nella parte superiore dello schermo. Consultare un patologo se disponibile. In selezionare per, selezionare acquisizione; in dimensione nei campi, selezionare 1 x 1; e sotto restrizione di campo, selezionare 0,5 µm (20x). Base il cytokeratin (CK) colorazione (principalmente in Cy5), selezionare diverse regioni con lo stroma (CK-) essere imaged dalla scansione complessiva sia di tumore (CK +). Ripetere questa procedura per ogni diapositiva.
4. Una volta selezionati tutti i file MSI, chiudere il software Phenochart e tornare al software di Vectra . Modificare l'attività da eseguire la scansione di MSI per ogni diapositiva e, quindi, fare clic su scansione per eseguire la raccolta di MSI.

12. spectral Unmixing

Nota: Il passo di unmixing spettrale è necessario per la separazione dei canali e l'analisi di immagini delle diapositive. Prima unmixing spettrale viene eseguita nel software inForm, la libreria spettrale deve essere costruita utilizzando diapositive dell'adenocarcinoma del polmone macchiati con ogni fluor da solo e con DAPI da solo. Questa procedura è descritta anche nella suddetta Multiplex IHC Assay Guida allo sviluppo.

1. Una volta completata l'acquisizione di MSI, è possibile utilizzare il software di ("informare") unmixing spettrale ad per aprire un file nella cartella MSI . Questi file terminano con l'estensione di file di tipo .im3.
2. In formato immagine, selezionare Multispectral; in formato campione, selezionare fluorescenza; e in origine libreria spettrale, selezionare InForm.
3. Per selezionare fluors, selezionare e caricare tutti i sei fluors e DAPI dalla biblioteca costruita con le diapositive di biblioteca dell'adenocarcinoma del polmone. Fare clic su Preparare tutti (basso a sinistra). Software unmixing spettrale si esibirà unmixing spettrale su tutte le immagini aperte, utilizzando i profili spettrali forniti.
4. Con un patologo, valutare il modello di macchiatura contro macchie cromogeniche singole dello stesso bersaglio in diapositive in sequenza dello stesso tessuto.

13. valutazione dell'intensità di fluorescenza e attenuazione del segnale

Nota: Lo strumento conta, che appare come una freccia con una piccola scatola marrone, è lo strumento più importante per l'ottimizzazione dei multiplex e dovrebbe essere usato frequentemente (Vedi Materiali supplementari). Utilizzando il tool di conteggi nel software unmixing spettrale, valutare il rapporto segnale-rumore, che come minimo dovrebbe superare 10:1 (Vedi Materiali supplementari per la risoluzione dei problemi e per la valutazione del multisala macchiatura con i controlli di goccia).

1. 13.1. con un'immagine aperta nel software unmixing spettrale, avviare lo strumento di conteggi e indagine immagini per valutare l'intensità di fluorescenza di ogni canale. L'intensità di destinazione nel tessuto polmonare è tra 10 e 20 conteggi normalizzati. Lo strumento di conteggi normalizzato è illustrato nella Figura 1.
2. Escludere diapositive con i conteggi di massima del segnale dei conteggi di area inferiore a 10 o normale segnale di meno di cinque per ogni marcatore affinché autofluorescenza e macchiatura fuori bersaglio non sono in concorrenza con il segnale autentico.
3. Escludi diapositive con massimo conta superiore a 30 per qualsiasi canale evitare emorragie spettrale o inefficiente unmixing spettrale.
4. Indirizzo alta o bassa normalizzato conteggi regolando la concentrazione di TSA.

14. multispettrali Image Analysis

1. Aprire uno o più MSI nel software unmixing spettrale e solo selezionare fluors per unmixing che sono rappresentati in almeno un immagine aperta. Fare clic su Preparare tutti per unmix tutte le immagini a colori attualmente aperto per produrre immagini spettralmente non miscelati.
2. Selezionare lo strumento di conteggi per conteggi di indagine attraverso ogni immagine passando sopra le aree di interesse.
3. Selezionare l'icona occhio per aprire l'editor di visualizzazione. Selezionare e regolare l'intensità di visualizzazione di ogni canale indipendente.
4. Selezionare Configura per aprire la segmentazione del tessuto, segmentazione delle cellule, phenotyping e moduli di punteggi. Questi strumenti sono necessari per la convalida oggettiva di multiplex colorazione contro le macchie singole cromogeniche e possono essere utilizzati per generare dati quantitativi phenoptic (Figura S1).
5. Utilizzare la scheda Esporta per salvare in scala di grigi, fluorescente, pathview-stile non compresso TIFF e file di dati dai moduli di analisi phenoptic per ulteriore analisi, archiviazione e presentazioni (Figura S1).

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Risultati

Il protocollo descritto qui fornirà risultati come quelli mostrati nella Figura 2. Iniziare con una valutazione della colorazione nel controllo della tonsilla, cominciando con l'epitelio di superficie delle cellule squamose. L'istologia del campione tonsilla possa essere esaminata con un patologo, utilizzando la diapositiva di H & E come riferimento. Se sezioni IHC cromogenici vengono eseguiti con gli stessi marcatori nello stesso isolato del tessuto, questi...

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Discussione

La rivoluzione di immunoterapia del cancro in corso è romanzo di apertura e promettente opzioni terapeutiche per i pazienti di cancro¹³. Progressi nel campo della immuno-oncologia richiederanno una maggiore conoscenza del microenvironment del tumore infiammatorio, non solo per capire la biologia dei meccanismi immunologici coinvolti nella carcinogenesi, ma anche per trovare biomarcatori predittivi per il nuovo trattamenti basati sull'immunoterapia^1,

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
"InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis	PerkinElmer	CLS151066	Called "spectral unmixing software" in text
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing	PerkinElmer	CLS151067	Called "QPTIFF software" in text
#1.5 Coverslips	Sigma Aldrich	2975246
200 Proof Ethanol	Koptec	V1001
20x Tris-Buffered Saline	VWR	J640-4L
Antibody Diluent	DAKO	S2203
Anti-CD68 Mouse Monoclonal	DAKO	M087601-2	Clone PG-M1
Anti-CD8 Rabbit Monoclonal	Ventana	M5392	Clone SP239
Anti-CK Mouse Monoclonal	DAKO	M351501-2	Clone AE1/AE3
Anti-ki67 Mouse Monoclonal	DAKO	M724001-2	Clone MIB-1
Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal	Cell Signaling	#86163	Clone D4W2J
Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal	Ventana	790-4905	Clone SP263
Bond Dewax Solution	Leica	AR9222	Called "dewax solution" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 1	Leica	AR9961	Called "ER1" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 2	Leica	AR9640	Called "ER2" in text
Bond Open Containers, 30 mL	Leica	OP309700	Called "30 mL open containers" in text
Bond Open Containers, 7 mL	Leica	OP79193	Called "7 mL open containers" in text
Bond Polymer Refine Detection	Leica	DS9800	Called "chromogenic detection kit" in text
Bond Research Detection Kit	Leica	DS9455	Called "research detection kit" in text
Bond Titration Kit	Leica	OPT9049	Called "titration kit" in text
Bond Universal Covertile Novocastra	Leica	S21.2001	Called "covertiles" in text
Bond Wash Solution 10X Concentrate	Leica	AR9590	Called "10x wash solution" in text
BondRX Autostainer	Leica		Called "automated stainer" in text
BondRX Software Version 5.2.1.204	Leica		Called "automated stainer software" in text
Opal 7-Color Automation IHC Kit	PerkinElmer	NEL801001KT	Called "multispectral staining kit" in text
Peroxidase Block	Leica	RE7101
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo	P36965	Called "slide mountant" in text
Starfrost Slides	Fisher	15-183-51
Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control	PerkinElmer	CLS143455	Called "microscope control software" in text