포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

요약

자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.

초록

종양 면역에서에서 지속적인된 개발 암 면역학의 메커니즘의 증가 이해를 필요합니다. 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 생 검에서 조직 샘플의 immunoprofiling 분석 종양 면역학의 복잡성을 이해 하 고 암 immunotherapy에 대 한 소설 예측 바이오 마커의 발견을 위한 주요 도구가 되고있다. Immunoprofiling 분석 조직 등 염증 성 세포 모집단 면역 검사, 종양 microenvironment에 결합 된 마커의 평가 필요 합니다. 소설 멀티플렉스 immunohistochemical 방법의 출현 보다 표준 수염 immunohistochemistry (IHC) 단일 조직 단면도의 더 효율적인 multiparametric 분석에 대 한 수 있습니다. 한 상용 멀티플렉스 면역 형광 (경우) 메서드는 tyramide 신호 증폭에 따라, multispectral 현미경 분석, 결합 조직에서 다양 한 마커의 더 나은 신호 분리에 대 한 수 있습니다. 이 방법론 표준 IHC FFPE 조직 샘플에 대 한 최적화 된 결합형된 기본 항 체의 사용과 호환 됩니다. 여기 우리가 자세하게에서 설명 멀티플렉스 수 있는 자동화 프로토콜 6-마커 다중 항 체 패널 구성 된 PD-L1, 암 조직 샘플의 라벨 경우 PD-1, CD68, CD8, 기-67, 및 4와 AE1/AE3 cytokeratins 6-diamidino-2-phenylindole 로 핵 셀 counterstain. 멀티플렉스 패널 프로토콜 착 시간을 수동 프로토콜의 보다 짧은 수 있습니다 직접 적용 고 인간의 FFPE 조직 샘플에 대 한 면역-종양학 연구에 대 한 모든 실험실 조사에 의해 적응에 대 한 자동된 IHC 염색기에 최적화 되어 있습니다. 또한 몇몇 컨트롤 및 도구, 새로운 다중 경우 패널의 좋은 품질 관리에 대 한 드롭-제어 방법을 포함 하 여 최적화 및 검증 기법에 대 한 유용한 있다.

서문

FFPE 종양 조직 샘플의 Immunoprofiling 분석 특히 발견 및 암 immunotherapy 임상 시험^{1의 맥락에 대 한 소설 예측 바이오 마커의 유효성 검사에 대 한 면역-종양학 연구의 필수 요소가 되고있다 ,2}. 발 IHC, diaminobenzidine, 등 화학 chromogens를 사용 하 여 진단 병리학 생 검 조직의³의 immunolabeling에 대 한 표준 기술에 남아 있다. 표준 IHC 암 조직 immunoprofiling, 종양 관련 된 림프 톨의 부분 모집단 그리고 프로그램 된 세포 죽음 ligand 1 등 면역 검사점의 식 수준 평가 (PD-L1)^{4의 정량 등도 사용할 수 있습니다. ,5}. 그러나 표준 IHC 제한 됩니다,, 그 하나의 항 원 조직 섹션 당 표시 될 수 있습니다. Immunoprofiling 연구는 일반적으로 여러 마커의 결합된 식의 분석 필요, 표준 IHC 사용 여러 조직 단면도의 얼룩이 지기 요구, 각 하나의 표식으로 물 될 것 이다, 실질적으로 중 핵 바늘 생 검 같은 작은 조직 샘플의 분석에 대 한 제한. 표준 IHC 방법 다양 한 세포 인구, PD L1, 종양 관련 된 대 식 세포와 암 세포에 의해 표현 된다와 같은 면역 검사점 마커로 일반적인 coexpressed 마커의 평가 대 한 제한도 있습니다. 이 제한에, 표준 수염 IHC의 사용 예를 들어, 다양 한 세포 유형⁶표현 IHC 마커의 정량 분석에 대 한 병리학 자에 의해 보고 되었습니다. 멀티플렉스 발 IHC 기술 채용 같은 조직 섹션 나타냅니다에 다양 한 컬러 chromogens 전진 표준 IHC 수염 방법,⁷ 에 그들은 남아 있지만 개발의 불과 immunolabeling에 의해 제한 마커 또한 동일한 세포 인구의 동일한 subcellular 구획에서 표현 하는 마커의 적절 한 평가 위한 중요 한 기술 과제를 제시.

멀티플렉스 발 IHC 기법의 제한 뿐만 아니라 임상 샘플에서 조직 여부에 관한 상기 주의 에겐 있다 면역-종양학 연구 기반 향상 된 다중 방법을 개발 하는 필요 형광 라벨 결합 이미징 시스템을 효과적으로 동일한 슬라이드에서 여러 fluorophores의 신호를 분리할 수 있습니다. 1 개의 그런 기술은 tyramide 신호 증폭 (TSA) 효율적인 색상 분리⁸multispectral 현미경 이미징 결합을 기반으로 합니다. TSA 기반 상용 키트 사용 fluorophores multispectral 이미징⁸ 최적화 ( 재료의 표참조). 이 시스템의 중요 한 이점은 이미 검증 되 고 표준 발 IHC^9,,1011에 최적화 된 동일한 레이블 없는 기본 항 체와의 호환성 이다. 이 새로운 목표를 통합 최적화 및 패널 수정에서 빠른 최적화 뿐만 아니라 유연성 수 있습니다. 또한, 다중 면역 형광 검사 (mIF) TSA 메서드 수염에서 간단한 전송에 대 한 수 있도록 자동화 된 상용 IHC 염색기 시스템, 최적화 될 수 있습니다 비 IHC mIF.

여기 선물이 프로토콜 기반 면역-종양학 연구 mIF 패널 mIF TSA 얼룩 자동 고 이미징 multispectral 스캐너를 사용 하 여. 이 프로토콜 적응 고 설명된 계측 및 시 약에 대 한 액세스 있는 실험실 사용자에 의해 수정 될 수 있습니다. Carcinomas의 immunoprofiling에 대 한 6 주 항 체의 패널을 포함 하는 프로토콜: PD-L1, PD-1, CD68 (마커로 팬-대 식 세포), CD8 (세포 독성 T 세포), 기-67, 및 AE1/AE3 (팬 cytokeratin, 신분의 상피 표식으로 사용 암 세포)입니다. 최근 연구는 멀티 플렉스¹²얼룩을 확인 하기 위해 표준 참조로 발 IHC를 사용 하 여 수동 TSA mIF 프로토콜의 최적화를 설명 합니다. 여기에 제시 된 업데이트 메서드는 자동된 염색기, 크게는 착 시간 단축 3-5 일에서 14 h, 또한은 얼룩의 일관성을 향상 시키는 동시에 최적화 된 상용, 일곱 색 TSA 키트를 사용 하 여 개발 되었습니다. 여기에 제시 된 세부 주요 프로토콜 뿐만 아니라 보충 자료 섹션 포함 하는 "드롭-제어" 방법, 새 mIF 패널 뿐만 아니라, 최적화에 대 한 기술 노트를 평가 하는 추가적인 품질 관리 프로세스 문제 해결, 그리고 설정 하 고 사용자 정의 mIF 패널의 mIF TSA 방법 최적화 실험실 사용자 있도록 새로운 다중 패널의 개발.

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프로토콜

참고: 여기에 제시 된 프로토콜 6 항 체에 대 한 TSA를 사용 하 여 mIF 패널의 immunoprofiling를 수행 하는 방법에 설명 합니다 (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8, 및 AE1/AE3) 자동된 염색기에 ( 재료의 표참조). 프로토콜에는 새 mIF 패널의 품질 관리에 대 한 드롭 컨트롤을 수행 하는 방법을 설명 합니다 ( 보충 자료참조). 이 프로토콜을 얼룩이 지 인간의 편도 선 (긍정적인 제어)에서 8 개의 흠 없는 FFPE 슬라이드와 8 개의 흠 없는 슬라이드 인간 폐 선 암에서 수행 됩니다. 첫 번째 슬라이드 전체 멀티플렉스 모든 6 개의 마커, isotype 컨트롤에 없는 기본 항 체는 활용 하 고, 두 번째 슬라이드와 드롭 컨트롤 ( 보충 자료참조)에 대 한 나머지 6 슬라이드 얼룩에 사용 됩니다. 조직 autofluorescence에 대 한 추가 제어 좋습니다 및 멀티플렉스에 항상 포함 되어야 연구 ( 보충 자료참조). 그러나, 조사는 다른 종양 유형 및 그들의 자신의 프로젝트의 목표에 따라 컨트롤을 고용 수 있습니다. MIF TSA 메서드와 multispectral 스캐너 기술 이전 경험 없이 실험실 사용자 다중 IHC 개발 가이드를 읽어야 한다 (사용 가능한 온라인 http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp에). 이 가이드에서는 수동 프로토콜에 설명 합니다, 하지만 그것은 또한 방법 얼룩 mIF에 대 한 좋은 소개를 제공 합니다. 이 프로토콜에서 고용 하는 모든 조직 단면도 익명 그리고 헬싱키 선언에 따라 승인.

1. 조직 샘플

1. 림프 증식 긍정적인 제어 및 PD L1 알려져 FFPE 인간 폐 선 암 샘플으로 사용을 포함 하는 FFPE 인간의 편도 선 샘플 선택 긍정적인. 종양의 존재를 확인 하기 위해 선택 된 폐 암 블록의 hematoxylin과 오신 (H & E) 슬라이드를 검토 합니다. 이 일반적인 배경 얼룩을 증가 수 있습니다 종양 괴 사의 풍부한 영역을 피하기 위해 중요 하다.
   참고: 이 최적화에 대 한 10 년 이상 저장 된 파라핀 블록을 사용 하지 마십시오와 조직을 파라핀 블록 (조직학 기술자와 상담)에 말린 모습.
2. 톰을 사용 하 여, 각 블록에서 10 연속 직렬 섹션, 4 µ m 두께 절단. IHC, 슬라이드 당 한 부분에 사용 되는 충전 된 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다.
   참고: 으로 주름 얼룩 아티팩트를 생성할 수 있습니다, 주름 없이 완벽 하 게 평평 섹션을 탑재 해야 합니다. 번호 1에서 10 직렬 부분의 슬라이드.
3. 첫 번째 섹션에 새로운 H & E 슬라이드를 준비 합니다. 블록에 남아 있는 편도 선 조직 또는 폐 종양의 존재를 확인 하는 병리학의 도움으로 H & E 슬라이드를 검토 합니다.
   참고: 이 H & E 슬라이드 multispectral 분석 및 형질에 대 한 관심 영역의 선택과 함께, 나중에, 도울 수 있다.
4. 최대 3 개월까지 4 ° C에서 플라스틱 슬라이드 상자에 흠 없는 섹션을 저장 합니다.

2. 자동 염색기에 얼룩 프로그램 새 mIF의 창조: 등록 된 시 약의

참고: 프로토콜에 사용 하기 위해 사용할 수 있습니다 전에 시 약 시 약 목록 자동된 염색기 소프트웨어에 추가 되어야 합니다. 자동된 염색기 모델 및 소프트웨어 버전에 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.

1. 자동된 염색기 소프트웨어 내의 시 약 탭을 클릭 하십시오. 새로운 시를 지정 하려면 추가 클릭 합니다. 이름 (예: "520 TSA 시 약") 및 최대 8 자는 주의 약식된 이름 (예: "520 TSA"), 입력 합니다. 보조 드롭-다운 메뉴에서 선택한 공급자를 설정 합니다. 변경 하지 마십시오 싱글/더블 얼룩 단일/순차 DS에서. 얼룩 프로토콜 프로토콜 F을 기본을 설정 합니다. ER120 기본 여기 프로토콜을 설정 합니다.
2. 새로운 시 약 및 표 1에 나열 된 모든 시 약에 대 한 반복 단계 2.1 저장 합니다.

3. 자동된 염색기: 컨테이너의 등록

1. 각 컨테이너의 측에 사용 될 시 약의 이름을 작성 합니다. 측면에 바코드를 스캔. 팝업 창에서 목록에서 올바른 시 약을 선택 합니다. 만료 날짜를 선택 하 고 저장 합니다.
2. 표 1에 나열 된 모든 시 약에 대 한 3.1 단계에서 절차를 반복 합니다.
3. 등록 오픈 연구 키트. 키트 측면 모두 바코드를 스캔 하 고 따라는 화면에 나타나는 메시지. 이름을 키트 "멀티플렉스 연구 키트 1." 1 x tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) 등록-이 키트 (표 1)의 일환으로 식 염 수를 버퍼.

4. 자동된 염색기: 창조는 mIF 프로토콜 프로그램의

1. 기본 다중 프로토콜은 새로운 자동화 된 stainers (참조 자료의 테이블에에서는 모델 및 소프트웨어 버전)에 오 팔 7 다중 이름으로 사전 로드 된다. 프로토콜 화면에 "선호" 대신 "모든"에 대 한 필터링을 통해 프로토콜을 찾습니다. 없으면 기본 프로토콜, 다음 제조 업체의 도움으로 자동된 염색기 소프트웨어를 업데이트 합니다.
2. 모든 수정 내용이 원래 프로토콜의 복사본에서 실시 한다. 를 변경 하기 전에 원래 저장 하 고 프로토콜 탭을 클릭, 다음 오 팔 7 다중 프로토콜을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 복사를 선택 하 여 복사본을 만듭니다.
3. 7 다중 프로토콜 1 새 창에서 이름을 변경 하 고 올바른 장치 (전시품 또는 벤치탑)와 관련 된 탭을 선택 합니다. 추가 테이블 s 1에서 프로토콜을 일치 합니다. 추가 시 약 10 분 과산화 효소 억제 단계 (표준 프로토콜의 일부가 아닌)을 추가 하 고 시 약으로 과산화 효소 억제제를 선택을 클릭 합니다.
4. 블로킹 단계 PKI 블로킹 버퍼 활용을 확인 합니다. 각 1 차 항 체는 것 적절 한 시 약, 이차 항 체 단계는 HRP 폴리머를 활용 하 고 그 스펙트럼 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) multispectral 자동화 키트와 함께 제공 되는 사용 확인 하십시오. 프로토콜 화면에 드롭 다운 메뉴에서 각 각 단계에 대 한 지정 된 시 약을 선택 하 여 모든 선택 항목을 확인 합니다.

5. 자동된 염색기: 추가 드롭 컨트롤과 Isotype 제어 프로토콜

1. 이름 7 다중 프로토콜 1 복사 하 고 1 CD68 드롭 7 다중 프로토콜변경 합니다. 마우스 IgG 를 시 약 CD68 항 체 를 변경 하 고 저장 프로토콜.
2. 같은 방식으로 6 개의 새로운 프로토콜, 각 드롭 컨트롤 및 완전 한 isotype 컨트롤 (적절 한 isotypes 모든 항 체 변경)을 만듭니다.

6. 자동된 염색기: 슬라이드 준비 프로토콜

1. Prestaining 프로토콜을 복사 * 빵과 Dewax Multispectral 구워 및 Dewax 2 h이이 프로토콜 이름을 바꿉니다.
2. 표 2에 표시 된 시 약에 맞게 프로토콜을 조정 합니다. 60 ° c.에 2 h에 대 한 슬라이드를 구워 30 dewax 72 ° c.에 s

7. 자동된 염색기: 준비는 시 약의

1. 한 연구 탐지 키트를 준비 합니다. 채우기 30 mL 오픈 컨테이너 1 x TBS 1 x Tris 버퍼 염 분 (TBS)에 대 한 표시 및 연구 탐지 키트 지정 다중 연구 키트 (핸들)에서 멀리 위치 1에서에서이 찾을 그래서 한 시 약이이 키트와 함께 영구적으로 연결 되어야 합니다. 1. 시이 약이 영구적으로이 연구 장비와 연결 되며 나중에 사용할 위치를 변경 하면 안.
2. 두 개의 30 mL 오픈 컨테이너 Multispectral 블록 및 Multispectral 보조라벨. 블로킹 버퍼/희석제 multispectral 얼룩 키트에서 항 체의 30 mL로 Multispectral 블록 컨테이너를 채우십시오. Multispectral 얼룩 키트에서 안티 mouse/안티 rabbit 이차 항 체 폴리머의 30 mL로 Multispectral 보조 용기를 채우십시오.
3. 10 7 mL 오픈 컨테이너를 준비 합니다. Microliters에 필요한 볼륨은 600 + (150 x [슬라이드 번호]). 각 항 체 (6 편도 선 및 6 폐)이이 경우에 12 슬라이드에 적용 됩니다. 라벨 및 모든 컨테이너에 대 한 볼륨은 표 3에 표시 됩니다.
4. 각 항 체 튜브에 대 한 항 체를 추가 먼저 희석제, 뒤에 볼륨에 집중된 1 차 항 체는 표 3에 표시 된. 부드러운 pipetting으로 혼합.
5. 7 mL 오픈 컨테이너 DAPI, DAPI 집중 이중 증 류 물;의 밀리 리터 당 4 개의 방울을 사용 하 여에 대 한 준비 16의 총 DAPI로 물 들일 것 이다 (600 + [150 x 16] = 3000 µ L). 컨테이너에 두 번 증 류 물의 3 mL 플러스 스펙트럼 DAPI 12 방울을 추가 합니다. 각 실행에 대 한 신선한 DAPI를 준비 합니다.
6. 과산화 효소 억제제에 대 한 7 mL 오픈 컨테이너를 준비 합니다. 모든 16 슬라이드 과산화 효소 억제 물으로 취급 됩니다 (600 + [150 x 16] = 3000 µ L). 컨테이너에 과산화 효소 블록의 3 mL를 추가 합니다.
7. Fluors의 작업 농도 준비 하기 전에 각 fluor 튜브 제조 업체에 의해 제공에 디 메 틸 sulfoxide의 75 µ L을 추가 하 여 동결 건조 된 모든 fluors를 resuspend. Pipetting으로 혼합. 이것은 TSA fluor 주식 이다. 4 ° c.에 게
8. 각 형 석 한 6 적정 용기를 준비 합니다. Microliters에 필요한 볼륨은 350 + (150 x [슬라이드 번호]). 각 형 석 16 슬라이드 (8 편도 선 및 8 개의 폐)이이 경우에 적용 됩니다. 라벨 및 모든 컨테이너에 대 한 볼륨은 표 4에 표시 됩니다.
9. 모든 시 약 등록 되어 있고 준비를 하는 경우 각 컨테이너 선반에 어떤 위치에 놓고 자동된 염색기에 모든 시 약을 로드 합니다. 프로브는 각 시의 볼륨을 확인 합니다.

8. 자동된 염색기: 샘플 설치 및 Multispectral 얼룩

1. 자동된 염색기 소프트웨어에서 화면 위쪽에 슬라이드 설치를 클릭 합니다. 추가 연구를 클릭 합니다. 연구 ID, 연구 이름 및 코멘트와 함께 팝업 창을 채웁니다.
   1. 드롭-다운 목록에서 얼룩 실행을 수행 하는 연구원의 이름을 선택 합니다. 150 µ L에서 디스 펜스 볼륨을 둡니다. 선택 Multispectral Dewax 준비 프로토콜에 대 한. 확인 및 추가 슬라이드를 클릭 합니다. 의견, 입력 "1 폐 123ABC 멀티플렉스할." 표시 된 대로 다음 필드를 입력: 조직 유형 = 테스트 조직; 디스 펜스 볼륨 = 150 µ L; 얼룩 모드 = 단일, 일상적인; 표식 = 네거티브; 얼룩이 = 입력 "7 다중 프로토콜 1"; 준비 Multispectral 빵 = 2 h; Dewax 여기 = 여기 ER1와 20 분.
2. 추가 슬라이드 를 클릭 하 고 의견 및 드롭 컨트롤 슬라이드와 isotype 제어 슬라이드를 추가 하려면 프로토콜 변경. 연구에 모든 슬라이드를 추가한 경우 추가 슬라이드 창을 닫고 레이블을 인쇄 합니다. 레이블을 적절 한 레이블 영역 각 슬라이드에 적용 됩니다.
3. 랙 슬라이드 로드, 올바른 방향에서 표지 타일을 적용 자동된 염색기에 선반을 삽입 하 고 트레이 낮은. 장치는 슬라이드 레이블 검색 합니다.
4. 때 모든 슬라이드와 시 약 검색 하 고 되었습니다 측정. (►) 실행된 버튼은 활성화 될 것입니다. autostainer 부족 시 볼륨, 같은 모든 오류를 감지 하는 경우 영향을 받는 트레이으로 노란색 주의 기호 표시 됩니다. 오류가 발생 하는 경우 주의 기호를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 하 고 오류 해결.
5. 얼룩 즉시 시작 하거나 일정 지연된 시작 합니다. 프로토콜 기간에 약 14 h입니다. 참고: 확인 프로토콜 때 슬라이드 제거할 수 있습니다 즉시 exess 세척 얼룩 결과 영향을 수 시간에 완료 됩니다.

9입니다. Multispectral 슬라이드 Coverslipping

1. 자동된 염색기에서 슬라이드를 제거 하 고 랙 1에 빠져들에 저장할 tbs. x
2. No. 1.5 coverslips와 ( 재료의 표참조)는 설치 미디어의 15 µ L 샘플을 탑재 합니다. 피 펫 팁 coverslip에 부드럽게 눌러 모든 거품을 제거 합니다.
3. 실험실 벤치에 실 온에서 하룻밤 치료를 슬라이드 수 있습니다. Uncured 슬라이드 주의 처리 즉시 검색할 수 있습니다.

10. multispectral 스캐너

1. Multispectral 스캐너와 컴퓨터에 전원 (모델 및 소프트웨어 정보에 대 한 재료의 표 참조). 현미경 제어 소프트웨어를 시작 합니다. 장치의 전면에 터치 버튼을 누르면 multispectral 스캐너의 앞 도어를 엽니다. 각 스프링 캐리어 스캐너에는 4 개의 슬라이드를 보유 하고있다. 캐리어로 모든 슬라이드를 로드 하 고 장치에 반송파를 로드 하기 전에 순서를 기록 합니다.
2. 편집 프로토콜 을 선택 하 고 뉴...; 그런 다음, 다중 패널 1과 드롭 컨트롤프로토콜 이름을 만듭니다. 멀티플렉스 패널 개발연구 이름 만들려면 프로토콜을 클릭 만들고 입력 개요 검색 필터 DAPI; 그런 다음 전체 슬라이드 스캔 및 픽셀 해상도 0.50 µ m (20 X)를선택 합니다. 모든 필터와 밴드를 대표 한다. 아니라면, 밴드 필터 편집을 클릭, 모든 5 개의 필터 (DAPI, FITC, CY3, 텍사스 레드와 CY5), 선택한 다음 노출 편집을 클릭 합니다.
3. 폐 선 암의 전체 멀티플렉스와 캐리어를 선택 하 여 캐리어를 로드 합니다. 그래픽 사용자 인터페이스를 사용 하 여 올바른 슬라이드를 선택 합니다. 수동으로 또는 자동 초점을 사용 하 여 조직 초점. 허용 DAPI 얼룩과 어떤 영역으로 이동 하 고 자동 노출 노출 밀리초 단위로 설정 하려면 클릭 합니다 (0-2000 ms).
4. 전체 검사와 MSI 지역 열에 모든 5 개의 필터 집합에 대해 동일한 절차를 반복 합니다. 수락 가능한 얼룩과 영역으로 이동 하 고 각 필터와 확대 수준에 대 한 노출을 설정 하기 전에 현미경을 촛점을 해야 합니다. 전체 스캔 x 20와 multispectral 이미징 (MSI) multispectral 지역 x 20에 모든 5 개의 필터에 대 한 자동 노출. 0.50 μ m (20 배)의 픽셀 해상도 선택 합니다. 프로토콜 저장 하 고 다시 Vectra 소프트웨어;의 홈 화면으로 돌아가려면 클릭 합니다 다음, 슬라이드 스캔을 클릭 합니다.
5. 각 슬라이드에 대 한 인터페이스를 열고 스캔 작업 을 설정 합니다. 멀티플렉스 패널 개발에 연구 를 설정합니다, 그리고 다중 패널 1 및 드롭 다운 컨트롤, 프로토콜 을 설정합니다 하 고 다중 폐 ABC123, 멀티플렉스 CD68 드롭 폐 ABC123, 등 슬라이드 ID 설정 . 모든 슬라이드 표시 된 작업은 설정 하는 경우 검색을 클릭 합니다. 자동된 multispectral 스캐너는 모든 5 개의 필터를 사용 하 여 모든 슬라이드의 전체 슬라이드 스캔을 수행 합니다.

11. multispectral 스캐너: Multispectral 이미징

1. 스캔 완료 되 면 QPTIFF 소프트웨어 ("Phenochart")을 왼쪽 상단에 로드 슬라이드 를 클릭 합니다. 이 5-필터 전체 슬라이드 스캔 QPTIFF, 열 것 이다. 각 레이어 정보가 둘 이상의 fluor에서 유틸리티는 제한 된, 하지만 조직 구조와 광범위 한 식 패턴 명백한 고 MSI에 대 한 영역을 선택 하는 데 사용 될 수 있습니다.
2. 이동 하 고 왼쪽에 드롭-다운 트리를 사용 하 여 연구에서 정확한 슬라이드를 엽니다. (오른쪽 위)에 사용자의 이니셜이 로그인.
3. 화면 상단에서 도장 도구 사용 하 여 MSI에 대 한 5 개 영역을 선택 합니다. 사용 가능한 경우는 병리학을 참조 하십시오. 선택, 선택 수집; 필드에는 크기, 선택 1 x 1; 그리고 필드 제한에서 0.5 µ m (20 x)를선택 합니다. Cytokeratin (CK) (주로 Cy5)에 착 색에 따라 달라 집니다, 여러 지역 종양 (CK +)와 기질 (CK-) 전반적인 검색에서 이미지를 선택 합니다. 각 슬라이드에 대해이 절차를 반복 합니다.
4. 일단 모든 Msi를 선택 Phenochart 소프트웨어 닫고 Vectra 소프트웨어를 반환 합니다. 각 슬라이드에 대 한 MSI 작업 스캔 에서 변경 그리고, 다음 MSI 컬렉션을 수행 하기 위해 다시 검사 를 클릭 합니다.

12. 스펙트럼 Unmixing

참고: 스펙트럼 unmixing 단계는 채널 분리 및 슬라이드의 이미지 분석에 대 한 필요 합니다. 정보 소프트웨어에서 스펙트럼 unmixing을 수행 하기 전에 스펙트럼 라이브러리로 얼룩진 각 fluor와 DAPI 혼자 혼자 폐 선 암 슬라이드를 사용 하 여 건설 한다. 이 절차는 상기 다중 IHC 분석 결과 개발 가이드에도 설명 되어 있습니다.

1. MSI 인수 완료 되 면 스펙트럼 unmixing (이 하 "정보") 소프트웨어를 사용 하 여 MSI 폴더에 있는 파일을 열려면. 이러한 파일은.im3 파일 형식 확장명에 끝.
2. 이미지 형식에서 선택 Multispectral; 샘플 서식에서 선택 형광; 스펙트럼 라이브러리 소스에서 정보를 선택 하 고.
3. Fluors를 선택 하려면 선택 하 고 내장 폐 선 암 도서관 슬라이드 라이브러리에서 모든 6 개의 fluors와 DAPI를 로드 합니다. 모든 준비 (왼쪽 아래)를 클릭 합니다. 스펙트럼 unmixing 소프트웨어 제공된 스펙트럼 프로필을 사용 하 여 모든 오픈 이미지에 스펙트럼 unmixing 수행 합니다.
4. 병리학 자와 같은 조직의 순차적 슬라이드에 동일한 대상의 비 단일 얼룩에 대 한 얼룩 패턴을 평가 합니다.

13. 형광 강도 및 신호 감쇄의 평가

참고: 으로 나타나는 작은 갈색 상자와 화살표, 카운트 도구 다중 최적화를 위한 가장 중요 한 도구 이며 자주 사용 한다 ( 보충 자료참조). 계산 도구를 사용 하 여 스펙트럼 unmixing 소프트웨어에, 평가 최소 10:1 (문제 해결 및 드롭 컨트롤과 얼룩 멀티플렉스의 평가 대 한 보충 자료 참조)를 초과 한다 신호 대 잡음 비율.

1. 13.1. 이미지 스펙트럼 unmixing 소프트웨어에 오픈, 카운트 도구 교전을 각 채널의 형광 강도 평가 하기 위해 이미지를 조사. 폐 조직에 대상 강도 10 및 20 정규화 된 수 사이입니다. 정규화 된 계산 도구는 그림 1에 표시 됩니다.
2. Autofluorescence 및 오프 대상 얼룩 정통 신호와 경쟁 하지 않습니다 있도록 최대 신호 카운트의 모든 표식에 대 한 미만 5 미만 10 또는 정상적인 신호 지역의 슬라이드를 제외 합니다.
3. 최대 제외 슬라이드 30 스펙트럼 출혈 또는 비효율적인 스펙트럼 unmixing 방지 하려면 어떤 채널에 대 한 보다 큰 계산 합니다.
4. TSA 농도 조정 하 여 높은 또는 낮은 정규화 된 카운트를 주소.

14. multispectral 이미지 분석

1. 하나 이상의 MSI를 스펙트럼 unmixing 소프트웨어 에서 열고 unmixing을 위한 유일한 선택 fluors 하나 이상의 오픈 이미지에 표시 됩니다. 모든 준비 unmix 괴기 하 게 순수한 이미지를 모든 현재 열린된 컬러 이미지를 클릭 합니다.
2. 관심의 영역 위로 이동 하 여 각 이미지에 걸쳐 건의 조사를 조사 도구를 선택 합니다.
3. 눈 아이콘 보기 편집기를 열려면 선택 합니다. 선택 하 고 각 채널의 디스플레이 강도 조정 합니다.
4. 구성 조직 세분화, 셀 분할, 형질, 및 득점 모듈을 열려면 선택 합니다. 이러한 도구 비 단일 얼룩에 얼룩이 멀티플렉스의 객관적인 유효성 검사에 필요한 고 양적 phenoptic 데이터 (그림 S1)를 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다.
5. 회색, 형광을 저장 하려면 내보내기 탭, pathview-스타일 비압축 TIFF 및 phenoptic 분석 모듈에서 데이터 파일을 사용 하 여 추가 분석, 보관 및 프레 젠 테이 션 (그림 S1)에 대 한.

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결과

여기에 설명 된 프로토콜은 그림 2에 표시 된 것과 같은 결과 제공할 것입니다. 편도 선 컨트롤, 표면 편평 세포 상피로 시작에 얼룩의 평가로 시작 합니다. 편도 선 샘플의 조직학 병리학 자, H & E 슬라이드를 참조 하 여 함께 검토할 수 있습니다. 비 IHC 섹션을 동일한 조직 블록에 동일한 표식으로 수행 하 고, 다음이 사용할 수 있습니다 밀도 및 mIF 슬...

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토론

지속적인 암 immunotherapy 혁명은 오프닝 소설과 유망 암 환자¹³에 대 한 치료 옵션. 면역-종양학 분야에서 발전 새로운 예측 생체를 찾을 뿐만 아니라 발암에 관여 하는 면역 메커니즘의 생물학을 이해 하는 것 뿐만 아니라 염증 성 종양 microenvironment의 증가 지식 필요 합니다. immunotherapy 기반 치료^1,2. 때문에 암 면역학의 복잡 한 생물학, ?...

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Name	Company	Catalog Number	Comments
"InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis	PerkinElmer	CLS151066	Called "spectral unmixing software" in text
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing	PerkinElmer	CLS151067	Called "QPTIFF software" in text
#1.5 Coverslips	Sigma Aldrich	2975246
200 Proof Ethanol	Koptec	V1001
20x Tris-Buffered Saline	VWR	J640-4L
Antibody Diluent	DAKO	S2203
Anti-CD68 Mouse Monoclonal	DAKO	M087601-2	Clone PG-M1
Anti-CD8 Rabbit Monoclonal	Ventana	M5392	Clone SP239
Anti-CK Mouse Monoclonal	DAKO	M351501-2	Clone AE1/AE3
Anti-ki67 Mouse Monoclonal	DAKO	M724001-2	Clone MIB-1
Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal	Cell Signaling	#86163	Clone D4W2J
Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal	Ventana	790-4905	Clone SP263
Bond Dewax Solution	Leica	AR9222	Called "dewax solution" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 1	Leica	AR9961	Called "ER1" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 2	Leica	AR9640	Called "ER2" in text
Bond Open Containers, 30 mL	Leica	OP309700	Called "30 mL open containers" in text
Bond Open Containers, 7 mL	Leica	OP79193	Called "7 mL open containers" in text
Bond Polymer Refine Detection	Leica	DS9800	Called "chromogenic detection kit" in text
Bond Research Detection Kit	Leica	DS9455	Called "research detection kit" in text
Bond Titration Kit	Leica	OPT9049	Called "titration kit" in text
Bond Universal Covertile Novocastra	Leica	S21.2001	Called "covertiles" in text
Bond Wash Solution 10X Concentrate	Leica	AR9590	Called "10x wash solution" in text
BondRX Autostainer	Leica		Called "automated stainer" in text
BondRX Software Version 5.2.1.204	Leica		Called "automated stainer software" in text
Opal 7-Color Automation IHC Kit	PerkinElmer	NEL801001KT	Called "multispectral staining kit" in text
Peroxidase Block	Leica	RE7101
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo	P36965	Called "slide mountant" in text
Starfrost Slides	Fisher	15-183-51
Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control	PerkinElmer	CLS143455	Called "microscope control software" in text