Flash nanoprecipitazione per l'incapsulamento di composti idrofobi e idrofili in nanoparticelle polimeriche

Riepilogo

Flash nanoprecipitazione (FNP) è un approccio scalabile per produrre nanoparticelle core-shell polimeriche. Formulazioni su scala di laboratorio per l'incapsulamento di terapeutica idrofila o idrofoba sono descritti.

Abstract

La formulazione di un composto terapeutico in nanoparticelle (NPs) in grado di conferire proprietà uniche. Per farmaci scarsamente solubili in acqua, NP formulazioni possono migliorare la biodisponibilità e modificare la distribuzione del farmaco all'interno del corpo. Per farmaci idrofili come peptidi o proteine, incapsulamento all'interno dei criteri di rete può anche fornire protezione da meccanismi di clearance naturale. Ci sono alcune tecniche per la produzione di NPs polimerici che sono scalabili. Flash nanoprecipitazione (FNP) è un processo che utilizza ingegnerizzato miscelazione geometrie per produrre NPs con distribuzioni di dimensione stretta e sintonizzabile dimensioni comprese tra 30 e 400 nm. Questo protocollo fornisce istruzioni sulla produzione di nanoparticelle polimeriche core-shell di una dimensione di destinazione utilizzando FNP su scala di laboratorio. Il protocollo può essere implementato per incapsulare sia idrofiliche o idrofobiche composti con solo lievi modifiche. La tecnica può essere facilmente impiegata in laboratorio a scala di milligrammo per formulazioni di schermo. Piombo hits possono direttamente essere scalato per grammo e chilogrammo scala. Come un processo continuo, scalabilità coinvolge più miscelazione processo eseguita tempo anziché traduzione alle navi nuove di processo. NPs prodotto da FNP è altamente caricati con terapeutico, sono dotate di una fitta boscaglia di polimero stabilizzante e hanno una riproducibilità di misura di ± 6%.

Introduzione

Dalla fine del 1990, c'è stato un aumento costante del numero di studi clinici che impiegano nanomateriali^1,2. Il crescente interesse riflette la promessa dei nanomateriali per migliorare la biodisponibilità di farmaci idrofobici e consentire una destinazione preferenziale all'interno del corpo³. Nanoparticelle polimeriche (denominate nanoparticelle o NPs qui) rappresentano una quota crescente di questa classe di materiali². NPs hanno raccolto interesse perché essi hanno proprietà altamente sintonizzabile come dimensione, composizione e funzionalizzazione superficiale⁴. Quando applicato per la somministrazione di farmaci poco solubili, NPs hanno frequentemente una struttura core-shell dove il terapeutico è incapsulato nel nucleo idrofobo e il guscio è costituito da un pennello di polimeri idrofili. Un modo semplice per generare questa struttura impiega un anfifilici diblock Copolimero (BCP) costituito da un blocco idrofobico degradabile, che fa parte del nucleo delle particelle, e bloccare un poly(ethylene glycol) idrofile (PEG), che costituisce il pennello di polimero e comunica la stabilizzazione sterica^4,5.

Nanoprecipitazione è una comune tecnica di montaggio per nanoparticelle polimeriche perché è semplice e non energia intensivo⁶. Nella sua forma più semplice, nanoprecipitazione comporta aggiunta mediante pipetta di componenti NP in un solvente organico come acetone a un volume in eccesso di acqua agitata. Il cambiamento in solvente e una soluzione acquosa diluita provoca la precipitazione della componente core insolubile. Lo stabilizzatore assembla su questa superficie di particella crescente, regia di adsorbimento del blocco idrofobico compresso^7,8,9,10. Una distribuzione uniforme delle particelle si ottiene quando il solvente e acqua mescolare velocemente per formare una soluzione omogenea. Miscelazione che è più lenta rispetto la nucleazione e assemblaggio dei risultati componenti in una più grande, più polidispersi particella abitanti. Anche se facilmente accessibile per un semplice test, l'approccio di batch agitata si traduce in ampia variabilità a causa di un'incoerenza di miscelazione e non è suscettibile di scalabilità^6,11. Microfluidica è emersi come un altro viale di produzione NP che possa essere eseguiti continuamente. Questo mezzo di produzione è stato recentemente rivisto da Ding et al. ¹¹ . Un approccio comune utilizza flusso laminare, messa a fuoco per ridurre la scala di lunghezza solvente a valori inferiori al micron. Miscelazione dell'antisolvente si verifica per diffusione, così piccolo flusso dimensioni sono cruciali per garantire particelle uniformi^11,12. Parallelizzazione di multiple microfluidici alloggiamenti per scale-up è problematico per grossi volumi di produzione.

Le condizioni di miscelazione rapide che favoriscono la nanoprecipitazione uniforme in microfluidica, alternativamente, possono essere prodotto in ristretti, flussi turbolenti. Flash nanoprecipitazione (FNP) impiega speciali geometrie di miscelazione per ottenere queste condizioni sotto la portata volumetrica maggiore rispetto a possibili con microfluidica. Flussi di ingresso immettere una camera di miscelazione in condizioni turbolente che portano alla generazione dei vortici, in modo che il solvente/anti-solvent lamelle formano la scala di lunghezza di diffusione^11,13. Così, si ottiene la miscelazione uniforme su una scala di tempo più breve di nucleazione e crescita di terapeutico. La geometria ristretto del mixer non consentono flusso bypassando della regione dove si verifica la dispersione di energia turbolenta e l'intero sistema sperimenta la stessa storia di processo¹³. Nucleazione si verifica in modo uniforme nella camera di miscelazione e crescita delle particelle procede fino al fermato dall'Assemblea del BCP sulla superficie^9,14. Il flusso misto contenente particelle stabili quindi può essere diluito con ulteriori antisolvente per sopprimere Ostwald maturazione delle particelle^15,16,17.

Un miscelatore del getto (CIJ) incidente confinati è il più semplice mixer design per FNP e consente la miscelazione dei due flussi in modo scalabile e continuo, come indicato in Figura 1A¹³. Un multi-ingresso Vortex (MIVM) è stato sviluppato per attivare fino a quattro ingressi di flusso diverso mentre ancora realizzando la rapida micromixing necessaria per la formazione di particelle uniformi, come mostrato nella Figura 1B¹⁸. FNP consente lo screening di formulazione semplice che può essere facilmente tradotto alla produzione su scala commerciale. Grazie alla natura continua del processo, batch di dimensioni maggiori non richiedono nuove navi ma piuttosto più tempi di esecuzione, traduzione semplice abilitazione alla produzione di chilogrammo-scala nello stesso treno attrezzature.

Idrofili composti quali peptidi e proteine ('biologici') possono anche essere incapsulati in una processo chiamato inversa Flash nanoprecipitazione (iFNP). La tecnica richiede un anfifilici BCP dove un isolato è idrofobo e l'altro è un Poliacido¹⁹. Il passo iniziale prevede la miscelazione rapida di un flusso di dimetil solfossido (DMSO) contenente il biologico e il BCP contro un solvente lipofilico come diclorometano o cloroformio. Questo provoca la formazione di particelle stabilizzato con il pennello di blocco idrofobico. Qui, una tale architettura, sono definita un NP 'invertita'. Il nucleo contiene Poliacido, che è poi ionicamente reticolati utilizzando un cationi polivalente. Questo stabilizza le particelle per la trasformazione in un ambiente acquoso sotto forma di microparticelle o nanoparticelle rivestite con PEG di tecniche che sono state segnalate nella letteratura^19,20,21.

Questo protocollo può essere impiegato per la produzione su scala di laboratorio di nanoparticelle core-shell polimeriche incapsulando composti idrofiliche o idrofobiche. Le sottosezioni del protocollo forniscono istruzioni sull'uso di entrambe le classi miscelatore - CIJ e il MIVM. Il lettore dovrebbe essere in grado di adattare il protocollo per i componenti principali del romanzo e riproducibile generare nanoparticelle di una dimensione desiderata utilizzando il mixer appropriato per gli ingressi di flusso. Tre formulazioni di esempio utilizzando FNP e iFNP sono presentate di seguito. Due impiegano il mixer CIJ e uno richiede il MIVM^15,22. La prima formulazione dimostra incapsulamento di un modello idrofobi composto da FNP. La seconda formulazione dimostra incapsulamento di un modello idrofila composto da iFNP in un mixer CIJ. La formulazione finale viene fornito un esempio di incapsulamento di proteina di iFNP utilizzando un MIVM. Il protocollo per questa terza formulazione descrive l'uso di una piccola scala, palmare MIVM chiamato 'μMIVM'. Il mixer design è più piccolo per consentire per lo screening di formulazione semplificata, ma il comportamento di ridimensionamento è ben compreso e il mixer non è un dispositivo di microfluidica²². La sezione finale del protocollo include alcune note su scale-up di formulazioni di piombo identificati nello screening. Queste formulazioni sono destinate a fornire punti di accesso per il processo di apprendimento e di conseguenza utilizzare non degradabili poli (stirolo)-basato su polimeri. Stabilizzatori alternativi sono stati descritti nella letteratura, con un numero di opzioni commerciali biocompatibile disponibili^14,23,24.

Protocollo

1. incapsulamento di composti idrofobici in NPs polimerici utilizzando un Mixer CIJ

1. Preparare e pulire l'attrezzatura.
   1. Procurarsi e convalidare un mixer CIJ.
      Nota: Vedere Informazioni aggiuntive sezione 1 per l'orientamento di costruzione. I file CAD sono disponibili come Informazioni supplementari pure.
   2. Prima di ogni utilizzo, verificare che tutti i raccordi sul mixer CIJ sono aderente e il tubo di uscita non sia piegato o schiacciato.
   3. In una cappa aspirante, collegare una siringa da 5 mL luer lock contenente 2-3 mL di solvente per ogni scheda di ingresso. Selezionare un solvente (ad es., acetone) che pulirà eventuali composti utilizzati di recente nel mixer.
      Nota: Le selezioni tipiche sono acetone o tetraidrofurano (THF). Solo uso di siringhe in polipropilene per evitare problemi di compatibilità solvente quali lisciviazione. Non utilizzare siringhe con stantuffi di guarnizione o-ring in gomma.
   4. Impostare l'assembly CIJ sopra un contenitore per rifiuti.
      Nota: Un pallone con un'apertura più piccola rispetto al corpo CIJ funziona bene come questo sostiene il mixer e permette il funzionamento facile delle siringhe.
   5. Costantemente di deprimere il stantuffo della siringa per svuotare il contenuto attraverso la camera di miscelazione nel corso di pochi secondi. Togliere le siringhe.
      Nota: Siringhe possono essere conservati e riutilizzati per più cicli di pulizia tra le esecuzioni FNP.
   6. Asciugare il internals di miscelatore CIJ utilizzando un flusso di₂ N. Un adattatore luer maschio sull'estremità di una linea di₂ N è efficace.
      Nota: Se il solvente di pulizia non è volatile (ad es., DMSO), ripetere i passaggi 1.1.3-1.1.5 con acetone o THF prima di procedere al passo 1.1.6. È fondamentale per rimuovere il solvente residuo per consistenza run-to-run.
2. Preparare i flussi di solvente e antisolvente alle composizioni di destinazione.
   1. Sciogliere il composto idrofobo (cioè, vitamina E) in THF non stabilizzata a 10 mg/mL in quantità sufficiente per completare il numero desiderato di FNP corre. Preparare un po' più del necessario per eseguire.
      Nota: Altri solventi possono essere utilizzati in questa procedura, soggetti ai vincoli nella sezione discussione. Se impiegando THF, solvente privo di stabilizzatore è consigliato perché idrossitoluene butilato ha bassa solubilità in acqua. Usare cautela per evitare l'accumulo di perossido (inclusi test perossido) ed essere consapevoli che i bassi livelli di perossidi possono interferire con alcune applicazioni di NP (ad es., sbianca dei coloranti).
   2. Miscelare la soluzione di vitamina E su un Vortex fino a completa dissoluzione.
      Nota: Per alcuni composti, sonicazione bagno per 1-2 min può aiutare nella generazione di una soluzione disciolta. È importante che tutti i componenti di NP molecolarmente sono dissolti.
   3. Sciogliere lo stabilizzatore di copolimero del blocco (cioè, poly(styrene) -b- poly(ethylene glycol), PS_{1,6 k}-b-PEG_5K) in THF a 10 mg/mL a circa lo stesso volume come descritto al punto 1.2.1 per formare la soluzione di polimero.
      Nota: Altri solventi possono essere utilizzati, soggetto ai vincoli di cui alla sezione di discussione.
   4. Miscelare la soluzione di polimero con un miscelatore vortex fino a completa dissoluzione. Se necessario, porre la soluzione in un bagno di sonicazione per 1-2 min facilitare la dissoluzione di solidi.
      Nota: Il polimero non può essere in forma micellare. Diffusione dinamica della luce (DLS) può essere uno strumento utile per determinare se una nuova composizione di flusso soddisfa questo criterio.
   5. Creare il flusso di input solvente contenente 5 mg/mL di vitamina E e lo stabilizzatore (50% vitamina E caricamento) di primo pipettaggio 0,25 mL di soluzione di vitamina E in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Quindi pipettare 0,25 mL di soluzione polimerica nella provetta stessa.
      Nota: Volumi superiori a 0,5 mL per corsa sono realizzabili con dimensioni differenti siringa. Sopra il volume di ingresso di 10 mL, è pratico da usare una pompa a siringa.
   6. Mescolare bene su un miscelatore vortex per 5-10 s. Facoltativamente, centrifugare la provetta a 1000 x g per 5-10 s recuperare qualsiasi liquido attaccato al tappo, che migliora la riproducibilità tra le esecuzioni CIJ.
   7. Pipettare 0,525 mL di acqua deionizzata in una provetta da centrifuga da 1,5 mL seconda come il flusso antisolvente.
      Nota: È meglio avere antisolvente in eccesso, che assicura che il flusso di solvente non entra mai nella camera di miscelazione senza antisolvente presenti. In alcuni casi dove sale solubilità nella miscela solvente/antisolvente non è limitante, sistemi a base acquosa tampone possono essere utilizzati.
   8. Dispensare 4 mL di acqua deionizzata in un flaconcino di scintillazione 20ml o altro contenitore adatto come un bagno di tempra. Posto una piccola ancoretta magnetica nel flaconcino.
      Nota: Il bagno di tempra riduce la maturazione abbassando il contenuto di solvente finale al 10% da volume^15,17di Ostwald. Questo volume può essere regolato ai vincoli del processo di indirizzo e possa essere direttamente scalato con volume di flusso di input.
3. Produrre NPs di FNP utilizzando il mixer CIJ.
   1. Posizionare la fiala di vasca aperta tempra sotto il mixer CIJ pulito su una piastra di mescolare in una cappa aspirante. Una pratica configurazione utilizza un blocco di cremagliera di provetta 50 mL per supportare il mixer CIJ con il flaconcino di sotto e il tubo di uscita diretto nel flaconcino. Vedere Figura 1A per l'orientamento.
   2. Begin mescolando la tempra vasca tramite l'ancoretta magnetica intorno al 75% di velocità max.
   3. Utilizzando una siringa da 1 mL in polipropilene con ago smussato-punta, disegnare il volume completo dal tubo antisolvente.
      Nota: Non utilizzare siringhe contenenti una guarnizione o-ring di gomma per evitare problemi di compatibilità. Per grandi volumi di aspirazione, utilizzare una siringa di dimensioni appropriate luer lock. L'uscita della siringa deve essere centrato sull'asse siringa o sarà instabile durante la depressione.
   4. Con attenzione rimuovere tutte le bolle d'aria dalla siringa e rimuovere l'ago punta smussata, riporli in un contenitore di sharps.
   5. Prime lo stantuffo in modo che il flusso è disponibile solo per l'apertura della siringa. Collegare la siringa a una delle bocchette di CIJ.
   6. Ripetere i passaggi 1.3.3-1.3.5 per la soluzione di solvente.
   7. Rapidamente, senza intoppi e in modo uniforme deprimere le siringhe allo stesso tempo mettendo la palla di mano, il palmo della mano o un pollice ogni sulle cime dei tuffatori a seconda delle preferenze personali. Raccogliere l'effluente nel flaconcino di vasca di tempra.
      Nota: Un mL 0,5 ingresso dovrebbe essere depresso in meno di 0,5 s.
   8. Mettere da parte la CIJ miscelatore con le siringhe ancora attaccate. Rimuovere la barra per l'agitazione e tappo del flaconcino, che ora contiene la dispersione di NP con una struttura core-shell particella (Figura 1).
   9. Tenere il mixer sopra un contenitore di soluzione rifiuti e togliere le siringhe. Il volume di rapina (circa 0,25 mL) verrà poi defluire. Smaltire le siringhe usate e ripetere la fase di pulizia 1.1 prima il FNP prossima prova.
      Nota: Non consentono il volume di rapina a vuoto nel flaconcino contenente la NPs come questo influirà negativamente uniformità del campione.
4. Eseguire analisi e post-elaborazione di dispersione NP.
   1. Per caratterizzare le dimensioni di NP utilizzando DLS, aggiungere 100 μL della dispersione NP in una cuvetta di plastica e aggiungere 900 μL del solvente di vasca di tempra (ad es., acqua).
      Nota: Volumi più piccoli possono essere utilizzati per cuvette di basso volume. Una diluizione di 10 volte è generalmente sufficiente.
   2. Mescolare bene pipettando su e giù o di lieve agitazione. Seguire le istruzioni di uno strumento specifico per analizzare il campione.
      Nota: Tecniche di caratterizzazione alternativi come analisi del potenziale zeta o microscopia elettronica può essere effettuata come richiesto. La dispersione di NP può essere elaborata ulteriormente come dettato dall'applicazione e recensione nella sezione discussione.

2. incapsulamento dei composti idrofili in invertito dei criteri di rete utilizzando un Mixer CIJ

1. Preparare il solvente, antisolvente e dissetare soluzioni in cappa.
   1. Completare le procedure di pulizia e preparazione descritte al punto 1.1, facendo uso di DMSO come un solvente per la pulizia e aderendo alla nota al punto 1.1.6 per completare un secondo risciacquo con THF.
   2. Sciogliere il composto idrofilo (cioè, maltodestrina (MD) con destrosio equivalente (DE) di peso molecolare medio di 4-7, = 3.275 g/mol, "3 k MD") in DMSO a 10 mg/mL in volume sufficiente a completare il numero desiderato di FNP viene eseguito.
      Nota: Altri solventi possono essere utilizzati, soggetto ai vincoli descritti nella sezione discussione.
   3. Miscelare la soluzione di maltodestrina con un miscelatore vortex fino a completa dissoluzione. Se necessario, porre la soluzione in un bagno di sonicazione per 1-2 min facilitare la dissoluzione di solidi.
   4. Creare uno stabilizzatore di copolimero del blocco (cioè, poly(styrene) -b- poli (acido acrilico), PS_{5 k}-b- PAA_{4,8 k}) soluzione in THF a 11,1 mg/mL a circa lo stesso volume come descritto al punto 2.1.2 per formare la soluzione di polimero .
      Nota: Altri solventi e concentrazioni di stabilizzatore possono essere utilizzate. DMSO può essere prontamente utilizzato come solvente in sostituzione di THF.
   5. Miscelare la soluzione di polimero con un miscelatore vortex fino a completa dissoluzione. Se necessario, porre la soluzione in un bagno di sonicazione per 1-2 min facilitare la dissoluzione di solidi.
      Nota: L'ingresso di polimero non può essere in forma micellare. DLS può essere utilizzato per determinare se una nuova composizione di flusso soddisfa questo criterio.
   6. Preparare l'input del flusso di solvente (0,5 mL) unendo i seguenti, in ordine, in una provetta da centrifuga da 1,5 mL: 0,250 mL della soluzione di 3 k MD, 0,225 mL della soluzione di polimero e 0,025 mL di acqua deionizzata.
      Nota: Il contenuto di acqua di questo flusso ha un forte impatto sulla dimensione del NP e polidispersità. Generalmente si consiglia di operare a 2,5-10 vol % gamma²⁰. I valori per la fascia alta della gamma possono aiutare incapsulamento di composti di peso molecolare più grande.
   7. Mescolare bene su un miscelatore vortex per 5-10 s.
   8. Facoltativamente, centrifugare la provetta a 1000 x g per 5-10 s recuperare qualsiasi liquido attaccato al tappo, che migliora la riproducibilità tra le esecuzioni CIJ.
   9. Preparare una soluzione di reticolante di cloruro di calcio (CaCl₂) diidrato in metanolo a 25,0 mg/mL.
      Nota: Il reticolante si aggiungeranno in un rapporto di 1:1 carica per i gruppi acidi nel blocco PAA. Regolare di conseguenza la concentrazione se viene utilizzato un diverso reticolante o se un PAA blocco dimensione o polimero concentrazione differente è usato^20,21.
   10. Preparare il flusso antisolvente di pipettaggio 0,5 mL di cloroformio e 0,05 mL della soluzione di reticolante (0,55 mL totale) in un tubo del microcentrifuge.
       Nota: Altri antisolvents accettabile sono dettate dalla scelta di copolimero di blocco e in genere includono diclorometano o acetone. Il reticolante invece può essere aggiunti alla vasca di tempra, con ulteriore invecchiamento della dispersione NP per consentire crosslink formazione²⁰.
   11. Mescolare bene su un miscelatore vortex per 5-10 s.
   12. Facoltativamente, centrifugare la provetta a 1000 x g per 5-10 s recuperare qualsiasi liquido attaccato al tappo, che migliora la riproducibilità tra le esecuzioni CIJ.
   13. Aggiungere 4 mL di antisolvente (cioè, cloroformio) una fiala di scintillazione 20ml per formare il bagno di tempra. Posto una piccola ancoretta magnetica nel flaconcino.
       Nota: Questo volume può essere regolato ai vincoli del processo di indirizzo.
2. Completare il protocollo per formazione NP come descritto al punto 1.3.
3. Eseguire analisi e post-elaborazione di dispersione NP.
   1. Per caratterizzare le dimensioni di NP utilizzando DLS, aggiungere 100 μL della dispersione NP in una cuvetta di vetro e aggiungere 900 μL del solvente usato per il bagno di tempra.
   2. Mescolare bene pipettando su e giù o da luce agitazione della provetta. Seguire le istruzioni del software per analizzare il campione.
      Nota: Reticolazione del NPs può essere valutata qualitativamente da liste di distribuzione utilizzando un buon solvente come DMSO o dimetilformammide (DMF) come diluente DLS²⁰. Particelle che sono stabilmente reticolato esporrà una funzione di autocorrelazione nel solvente con un minimo cambiamento della dimensione delle particelle. Scarsamente reticolate particelle si gonfiano e mostrano una funzione di autocorrelazione debole e dispersione resistenza²¹.
   3. Facoltativamente, aggiungere una base, come l'ammoniaca, di guidare ionico complessazione e rafforzare la reticolazione nel nucleo della particella.
      1. Facoltativamente, preparare una soluzione di 3,48 mg/mL di ammoniaca in metanolo gravimetricamente con soluzione di idrossido di ammonio (in genere 30 wt % dell'ammoniaca). Aggiungere 50 μL (cioè, 0,6 equivalenti per quanto riguarda i gruppi acidi il polimero) goccia a goccia con agitazione.
         Nota: Gli equivalenti possono essere regolati se desiderato variando sia la concentrazione o il volume aggiunto²⁵.
      2. Facoltativamente, età non meno di 30 min con lieve agitazione per reticolazione a verificarsi.
   4. Processo la dispersione di NP per produrre microparticelle o patinate dei criteri di rete come descritto in letteratura^19,20,21.

3. incapsulamento di ovoalbumina in NPs invertito usando un μMIVM

1. Preparare soluzioni solvente e antisolvente.
   1. Preparare una soluzione di 50 mg/mL di ovoalbumina in acqua deionizzata ("OVA").
   2. Preparare 0,75 mL di soluzione A in una provetta da centrifuga da 1,5 mL di diluizione 75 μL della soluzione OVA 0,675 ml di DMSO per generare una soluzione di 5 mg/mL di ovuli in DMSO contenenti acqua al 10% in volume. Mescolare bene e centrifugare come descritto in precedenza.
      Nota: Vedere il punto 2.1.6 per quanto riguarda gli effetti dell'acqua. Come nelle precedenti sezioni, i volumi di soluzione possono essere scalati verso l'alto o verso il basso per fit bisogni materiali.
   3. Preparare soluzione B sciogliendo lo stabilizzatore di copolimero del blocco (cioè, poly(styrene) -b- poli (acido acrilico), PS_{5 k}-b- PAA_{4,8 k}) in DMSO a 6 mg/mL. Mescolare bene e Sonicare per sciogliere se necessario. Pipettare 0,75 mL in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
   4. Pipettare 0,75 mL di THF (soluzione C) in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
   5. Pipettare 1,85 mL di cloroformio (soluzione D) in una fialetta di scintillazione.
   6. Preparare un 60,0 mg/mL di cloruro di calcio diidrato crosslinker soluzione in metanolo. Mescolare usando un miscelatore vortex.
   7. Preparare un 4,17 mg/mL soluzione di ammoniaca in metanolo come descritto al punto 2.3.4.
   8. Aggiungere 5,25 mL di cloroformio in una provetta per centrifuga 15 mL come il bagno di tempra.
2. Preparare il montaggio miscelatore e stand.
   1. Raccogliere il ricevitore inferiore, miscelazione geometria disco, il disco superiore, la chiave di chiave e un o-ring. Vedere la Figura 2 per schematica dei componenti e terminologia stand mixer.
      Nota: Dettagli sulla costruzione della MIVM possono essere trovati nelle Informazioni aggiuntive (sezione 1) e nella letteratura²². I file CAD sono disponibili come Informazioni supplementari pure.
   2. Posizionare l'o-ring nella scanalatura, assicurando che si adatta bene e che non esistono segni di usura o danneggiamento.
      Nota: Funzionamento normale porterà a solvente-gonfio o usurate O-ring. Se l'o-ring appare allungato o deforme, lasciare all'aria a secco durante la notte prima dell'uso. Se la forma non recupera durante la notte, smaltire l'o-ring. Tenere un grande magazzino, come questo è una parte di consumo.
   3. Attentamente allineare i fori dei dischi miscelazione con i pioli sul disco superiore e spingere insieme. Assicurarsi che l'o-ring non diventare sfollato controllando che i due pezzi sedersi a filo.
   4. Invertire i due pezzi e montarli manualmente con il ricevitore di fondo. Assicurarsi che il raccordo del tubo di uscita ha stato ampliato in modo che non interferisca con serraggio completo del disco.
      Nota: Se le catture threading durante il montaggio, smontaggio e applicare un grado alimentare o farmaceutico antigrippaggio per la filettatura per evitare il grippaggio.
   5. Dopo il serraggio manuale, inserire la chiave di chiave per i pioli di disco superiore e serrare saldamente l'assembly. Quindi serrare il raccordo di tubi presa affinché si siede saldamente contro la faccia inferiore della geometria miscelazione. Assicurarsi che i raccordi di siringa sul disco superiore siano aderente.
   6. Posizionare il miscelatore montato sul supporto mixer in modo che il tubo di uscita si estende sotto la piastra di supporto. Sostenere la piastra mobile in modo che essa è sospesa fuori del modo lo spazio di lavoro.
   7. Facoltativamente, per controllare l'allineamento di arresto meccanico, prima attaccare le siringhe di vetro vuota per le insenature di miscelatore.
      Nota: La portata volumetrica è vari utilizzando siringhe di canna differenti diametri, poiché le siringhe sono depresso simultaneamente alla stessa velocità lineare. Le altezze verticali iniziale e finale devono essere lo stesso per tutte le siringhe e possono essere regolate utilizzando viti sfruttate il pistone albero²². I fermi meccanici assicurano che danni eccessivi per le siringhe di vetro non si verificano.
      1. Facoltativamente, abbassare la piastra mobile Ecco si ferma degli arresti meccanici. Assicurarsi che questi siano allineati in modo che la piastra venga anche riposare immediatamente prima di contattare le siringhe vuote (come si vede nella Figura 2).
      2. Facoltativamente, allentare i fermi meccanici e riposizionare, se necessario. Rimuovere le siringhe di vetro e reimpostare la piastra mobile fuori del modo.
         Nota: Per il funzionamento con siringhe di plastica, i fermi meccanici non sono necessari.
   8. Posizionare il bagno di tempra aperta sotto il tubo di uscita per la raccolta dell'effluente.
   9. Attirare la soluzione A in una siringa da 1 mL a tenuta di gas utilizzando un ago a punta smussata. Rimuovere tutte le bolle d'aria e smaltire l'ago. Ottima la soluzione alla fine del raccordo luer siringa. Ripetere questo processo per soluzioni B e C.
   10. Disegnare D soluzione in una siringa a tenuta di gas 2,5 mL utilizzando un ago a punta smussata. Rimuovere tutte le bolle d'aria e smaltire l'ago. Ottima la soluzione alla fine del raccordo luer siringa.
       Nota: Questi volumi sono stati selezionati in modo che le altezze di stantuffo della siringa iniziale sono le stesse. Se i volumi sono stati modificati, ancora devono soddisfare questo requisito di altezza.
   11. Assemblare le quattro siringhe sul mixer in senso orario in ordine alfabetico. Vedere Figura 1B per aspetto finale e siringa orientamento schematico.
       Nota: Verificare che nessuna altezza siringa è significativamente diversa dagli altri e risolvere i problemi come necessario.
3. Eseguire operazione di miscelatore e pulizia.
   1. Presa del cuscinetto su entrambi i lati della piastra mobile. Non mettere le dita sulla faccia inferiore dell'alloggiamento, perché questo è un pericolo pizzico contro i fermi meccanici. Abbassare lentamente la piastra mobile in modo che appoggi in modo uniforme ma appena toccano le siringhe.
   2. Costantemente e senza intoppi deprimere la piastra, con l'obiettivo di completare l'operazione in circa 0,5-1 s per questi flusso volumi²².
      1. Rimuovere e tappo il tubo del bagno di tempra che ora contiene la dispersione di NP.
   3. Prendere il mixer con le siringhe ancora attaccate e tenere sopra un contenitore per rifiuti. Togliere le siringhe, permettendo al volume di hold-up di scarico nel contenitore. Tenere il gruppo miscelatore rialzo e smontare il mixer utilizzando la chiave di chiave.
   4. Utilizzando un flacone spray, sciacquare il tubo di uscita con diversi millilitri di solvente (ad es., acetone) e asciugare con aria o azoto.
   5. Sciacquare la miscelazione geometria con un buon solvente (ad es., deionizzata acqua o DMSO) e poi risciacquare con acetone utilizzando diversi millilitri da un flacone spray. Asciugare con un flusso di aria o azoto.
   6. Sciacquare l'o-ring in un flusso di acqua deionizzata e asciugare tamponando.
   7. Sciacquare il disco superiore accuratamente con diversi millilitri di acetone utilizzando una solvente bottiglia fino a quando visivamente pulita. Asciugare con un flusso di aria o azoto sia la superficie che i raccordi di siringa.
   8. Sciacquare ogni siringa con diversi millilitri di un buon solvente (ad es., deionizzata acqua o acetone) da una bottiglia di solvente. Applicare un risciacquo finale di diversi millilitri di acetone e asciugare prima dell'uso successivo.
4. Eseguire post-elaborazione e analisi.
   1. Aggiungere 50 µ l della soluzione del cloruro di calcio diidrato crosslinker goccia a goccia mescolando a circa 75% velocità massima.
   2. Aggiungere 50 μL di soluzione di ammoniaca goccia a goccia mescolando al 75% della velocità massima. Età per almeno 30 min.
   3. Caratterizzano la dimensione NP come descritto ai punti 2.3.1 e 2.3.2.
   4. Processo la dispersione di NP per produrre microparticelle o patinate dei criteri di rete come descritto in letteratura^19,20,21.

4. le modifiche per formulazione Scale-up

1. Preparare le soluzioni solvente e antisolvente come descritto nei passaggi 1, 2 o 3 alla composizione desiderata e a un volume sufficiente per la dimensione necessaria formulazione.
2. Facoltativamente, se necessario, pulire e sterilizzare il mixer in luogo utilizzando un protocollo adatto prima formazione NP.
   Nota: Risciacqui sequenziali di CIP 100, acqua (a pH neutro), CIP 200, acqua (a pH neutro) e un solvente adatto sono stati impiegati in passato. Inoltre, filtri sterili possono essere collegati agli ingressi del mixer in casi dove la granulometria finale preclude sterilizzazione per filtrazione.
3. Caricare le soluzioni in siringhe a tenuta di gas di volume adeguato e collegare il tubo del politetrafluoroetilene (PTFE) con un adattatore luer montato sull'estremità. Adescare manualmente le soluzioni alla fine del tubo.
   1. Caricare le siringhe in una pompa a siringa e collegare le siringhe alle insenature miscelatore su CIJ o MIVM, come richiesto.
      Nota: In alternativa, controllori di flusso possono essere utilizzati in laboratorio o su scala pilota per fornire funzionalità di volume più grande rispetto a una pompa a siringa. Operazione riuscita richiede flusso costante e sufficiente caduta di pressione, che significa che i serbatoi con misure di portata in uscita sono la scelta più appropriata per la produzione su larga scala.
4. Collocare un recipiente di raccolta contenente una vasca di tempra di volume sufficiente, se richiesto, di sotto il tubo di uscita.
5. Impostare i tassi di flusso volumetrico corrispondano a quelli raggiunti manualmente (ad es., circa 30-60 mL/min per flusso).
   Nota: Se utilizzando la CIJ, i tassi di flusso della pompa devono essere identici. Se si utilizza il MIVM, insenature diverse possono avere diverse portate.
6. Contemporaneamente cominciano le pompe. Raccogliere circa 5-10 mL di effluente come rifiuti in una piccola fiala (questo è un "volume di Start-up") e poi iniziare a raccogliere nel bagno di tempra.
7. Caratterizzano e processo come descritto nella sezione corrispondente formulazione precedente.

Risultati

Screening delle formulazioni di NP con FNP è rapido e richiede piccole quantità di materiale (nell'ordine di 1-10 mg). Il protocollo FNP per incapsulare composti idrofobici, quale la vitamina E (passaggio 1) provoca una dispersione di NP stabile, limpida o leggermente opalescente. Diffusione dinamica della luce (DLS) fornisce un mezzo robusto per caratterizzare la dimensione delle particelle. Come mostrato nella Figura 3, il processo produce NPs con un basso polidispersità in modo riproducibile. L'indice di polidispersione tipico (PDI) è inferiore a 0,20, che indica un relativamente monodisperse popolazione. Il PDI viene ottenuto dalla funzione di autocorrelazione ed è spesso implementato in software dello strumento. È un rapporto del secondo al primo istante, dove i valori di 0.1 sono generalmente ottenuti di particelle monodisperse²⁶. Per le quattro vitamina E/p-b-PEG formulazione replicati segnalati, il valore era 0.12 ± 0.02 e il diametro medio era 107 ± 7 nm. Un tipico "cilecca" a causa di una depressione irregolare delle siringhe o più lenta velocità di depressione è anche segnalato nella Figura 3. La polidispersità era inalterata, ma la dimensione era leggermente più grande (135 nm). Inclusi in questo esempio, le nuove metriche per dimensione delle particelle sono 113 ± 14 nm. Un tiro mancato si traduce in periodi di tempo dove la camera contiene un solo tipo di flusso singolo. È importante che l'intero flusso sperimenta la stessa storia di processo e volumi relativi dei flussi organici e acquosi all'interno del mixer. Senza uno stabilizzatore, viene prodotta una soluzione opaca con aggregati visibili. La funzione di autocorrelazione DLS per questo esempio è non monotone e non decade senza intoppi, come si vede nella Figura 3 rientranza.

Controllo delle dimensioni delle particelle di FNP è dimostrato nella Figura 4, dove variando la quantità relativa del materiale di nucleo – poly(styrene)_{1,8 k} in questo caso – e PS -b-PEG stabilizzatore è provocato da dimensioni di particelle che hanno variato da 49-152 nm. Queste dimensioni delle particelle sono state generate con flussi THF contenente una concentrazione di massa totale del nucleo e stabilizzatore di 20 mg/mL, dove il 25%, 50% o 75% della massa è stato il materiale del centro di poly(styrene). La polidispersità delle nanoparticelle era sempre meno di 0.15. Ampia discussione degli effetti di parametro sulla dimensione delle particelle prodotte da FNP può essere trovata nella letteratura¹⁰. Il caricamento può essere ottimizzato tenendo costante il volume di solvente e variando i relativi volumi delle soluzioni stock core e stabilizzatore. Allo stesso modo, la concentrazione di massa totale può essere variata attraverso la preparazione di soluzioni di riserva a valori diversi da 10 mg/mL. In determinate condizioni, è possibile osservare una popolazione micella vuota da DLS²⁷. Questo non ha alcun effetto dannoso diverso da quello di ampliare la distribuzione granulometrica misurato. Quando le dimensioni sono simili, questo può manifestarsi come un vasto picco singolo piuttosto che due picchi separati.

Il mixer CIJ stesso utilizzabile anche per incapsulare idrofili composti di iFNP, come esemplificato nel passaggio 2 del protocollo. Le particelle prodotte nella formulazione segnalata sono circa 65 nm con un basso polidispersità 0,08. La distribuzione delle dimensioni può essere visto in Figura 5A (linee tratteggiate). L'effetto di reticolazione i residui di acido carbossilico PAA sulla stabilità delle particelle è dimostrata dall'analisi DLS in un solvente forte come il DMSO, come mostrato in figura 5B. La funzione di autocorrelazione per pozzo-reticolato particelle dovrebbe iniziare nei pressi di un valore di 1 e goccia acutamente a 0 in un momento caratteristico che è correlato alla dimensione delle particelle (linea continua). Particelle che si gonfiano estesamente o sciogliere non sono reticolate e mostrano il segnale minimo autocorrelazione (linea tratteggiata). Per iFNP, non riuscite prove si manifestano in modi simili come descritto per FNP sopra. Aggregati visibili possono essere visto o forma di funzione di autocorrelazione DLS scadente può essere osservato. Il MIVM può essere utilizzato per FNP o iFNP quando più di due flussi di ingresso sono necessari a causa di vincoli di sistema quali solubilità o incompatibilità chimica. Una versione su piccola scala di MIVM (il μMIVM) con il suo stand mixer è illustrata nella Figura 2. Come con la CIJ, questo mixer può essere utilizzato per incapsulare composti idrofobo o idrofilo²². Nel passaggio 3, è stato descritto un protocollo per l'incapsulamento di una proteina idrofila, OVA, da iFNP. La distribuzione granulometrica è mostrata in Figura 5A (linea continua). La dimensione è di circa 125 nm con un PDI di 0,16. Un protocollo generale per funzionamento con pompa siringa alle scale più grandi è fornito nel passaggio 4.

Figura 1: montaggio miscelatore e flusso interno modello schemi. Miscelatore di getti (CIJ) (A) i confinati che interferisce con siringhe allegate è posizionato sopra il bagno di tempra. Nella foto non sono un ancoretta nel flaconcino di vasca di tempra e un piatto di mescolare. La geometria di miscelazione è raffigurata nella vista espansa mostrando le insenature di due stream che incidono nel centro della camera. (B) un vortice di multi-ingresso mixer (il μMIVM) è mostrato con siringhe in vetro e posizionato nello stand sopra una vasca di tempra. La piastra mobile e gli arresti meccanici sono stati tagliati dalla foto. La vista espansa mostra schematicamente la camera di vortice e i canali di ingresso. (C), A rappresentazione schematica di NPs di core-shell prodotto da FNP. Sfere rosse rappresentano la terapeutica che, combinato con il blocco di polimero compresso blu, costituiscono il nucleo di NP. Il blocco di polimero giallo costituisce lo strato di pennello impartendo stabilizzazione sterica per NPs. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: μMIVM terminologia e componenti per l'assemblaggio. Il μMIVM richiede uno stand mixer per abilitare uniforme depressione delle quattro siringhe. In questo caso, le altezze di stantuffo della siringa devono essere uniformi per garantire la miscelazione coerente. In alternativa può essere gestito utilizzando pompe a siringa. Lo stand mixer con componenti con etichettate è mostrato a sinistra della figura. Sulla destra è il mixer smontato con l'o-ring al posto del disco di geometria miscelazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Particella dimensioni distribuzione delle nanoparticelle polimeriche contenenti un nucleo di vitamina E e stabilizzato da PS -b-PEG. Diffusione dinamica della luce (DLS) fornisce distribuzioni di dimensione ponderati per intensità che indicano la distribuzione del diametro di NP. Le curve sono la media delle analisi triplice copia per ogni prova e hanno state riscalate per produrre altezze dei picchi massimi identici. La replica di quattro (linee continue) indica l'alta riproducibilità del metodo (deviazione standard = 7 nm). È incluso anche un rappresentante misfire (linea tratteggiata), ad esempio velocità di siringa più lenta o irregolare depressione delle due siringhe, che si traduce in un più grande diametro della particella. La deviazione standard delle dimensioni NP tra cui la mancata accensione era 14 nm. (Inserto) Senza il PS -b-PEG stabilizzatore, si formano grandi aggregati di micron-scala (o goccioline, nel caso di un olio come vitamina E). La funzione di autocorrelazione di liste di distribuzione di una corsa senza lo stabilizzatore (linea tratteggiata) è mostrata insieme con un rappresentante autocorrelazione da una replica di nanoparticelle (linea continua). La funzione di autocorrelazione indica un numero di tempi caratteristici per il campione di controllo, che indica una popolazione polidispersi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: controllo di dimensione delle particelle di FNP attraverso variando i rapporti relativi del nucleo materiale per stabilizzatore. Le distribuzioni di dimensioni ponderati per intensità di tre formulazioni con un nucleo di poly(styrene) stabilizzato di PS -b-PEG sono raffigurati. La concentrazione di massa totale in THF è stata di 20 mg/mL e l'antisolvente era acqua. Le formulazioni sono state preparate in un mixer CIJ. La frazione della massa composta del materiale del nucleo è elencata nella legenda. Ad esempio, il campione di 25% nucleo contenuto 5 mg/mL poly(styrene) e 15 mg/mL PS -b-PEG. Le dimensioni medie per il 25% (linea continua), 50% (linea tratteggiata) e carichi di nucleo del 75% (misto dash linea) erano 49 nm, 96 nm e 152 nm, rispettivamente. Tutti i PDI valori erano meno di 0.15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: caratterizzazione di NPs invertito in un miscelatore CIJ o μMIVM. (A), DLS curve è la media delle analisi triplice copia per ogni formulazione. La linea tratteggiata indica la distribuzione di dimensione delle particelle di MD k 3 fatto nel mixer CIJ, mentre la linea continua è la granulometria delle particelle OVA fatte nella μMIVM. (B) la forza di reticolazione può essere valutata da DLS facendo uso di DMSO come il diluente. La funzione di autocorrelazione DLS indica la forza di reticolazione attraverso il valore iniziale di autocorrelazione e l'osservazione di una transizione pulita su un valore pari a zero. La linea tratteggiata rappresenta la funzione di autocorrelazione per una particella con nessun crosslinker mostrando un debole segnale iniziale e un tempo di decadimento ampia. La linea continua rappresenta l'autocorrelazione dopo l'aggiunta di un reticolante forte (in questo caso, tetraetilenpentammina), che mostra un forte segnale iniziale e una scala cronologica definita decadimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: soprasaturazione, S, in funzione dei relativi rapporti di miscelazione di solvente organico all'acqua. (A) confronto di sovrasaturazione massima raggiungibile per (○) boscalid, un pesticida e (■) peptide B, un peptide di sette-residuo modello. Il flusso organico contiene boscalid ad una concentrazione di 230 mg/mL e peptide B a 200 mg/mL, le loro concentrazioni di saturazione. C'è una sovrasaturazione massima che dipende da ogni ingrediente farmaceutico attivo (API) / solvente sistema. (B) quando la concentrazione di boscalid nel flusso organico è diminuito di 20 volte, le condizioni in cui vengono raggiunti soprasaturazione e nanoprecipitazione diventano limitate. Questa figura è ristampata con il permesso da Elsevier⁹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

L'incapsulamento di composti idrofobici, quale la vitamina E, come al punto 1 del protocollo, è stato ampiamente descritto^9,14,28. Relativamente monodisperse particelle sono prodotte perché la scala di tempo di miscelazione è più breve rispetto alla scala di tempo per l'aggregazione e la crescita delle particelle. In particolare, la soluzione di solvente/antisolvente mista rapidamente diventa omogenea, che consente di nucleazione si verifichi in modo uniforme. Assembly del copolimero a blocchi alla superficie della particella quindi fornisce stabilizzazione sterica che ferma la crescita delle particelle⁵. Poiché il tempo di miscelazione in aula (turbolenza) è una funzione delle portate di aspirazione a CIJ o il MIVM, c'è un tasso di ingresso, che si verifica dopo la transizione a miscelazione turbolenta, dove la dimensione delle particelle è essenzialmente costante¹³. Questo fornisce ulteriore robustezza al processo come alcuni lotto a variazione di portata di aspirazione (cioè, siringa depressione velocità) può essere tollerata senza alcun impatto significativo per la dimensione finale di NP, come si vede dalla Figura 3. Velocità di aspirazione più lento o irregolare può causare le particelle più grandi o più polidispersi distribuzioni, come si è visto per esempio la mancata accensione. FNP è stata estesa anche per incapsulare idrofili composti in nanoparticelle di inverso nanoprecipitazione Flash. Questi invertito le nanoparticelle possono quindi essere utilizzati per creare microparticelle o rivestire con PEG per creare nanoparticelle dispersibile in acqua²⁵. I principi di montaggio rimangono gli stessi, anche se c'è la complessità aggiunta di reticolazione il nucleo di particelle. Ciò è necessario per la stabilizzazione della particella in un ambiente acquoso. In generale, un rapporto di 1:1 carica rispetto al blocco Poliacido è sufficiente, anche se le interazioni ioniche possono essere promosso da regolazione del pH mediante l'aggiunta di una base¹⁹. In questo protocollo, è stato descritto solo il primo passo del processo di forma invertita NPs.

Oltre a miscelazione veloce, formulazione di successo di FNP o iFNP è circoscritta ai casi in cui diverse condizioni possono essere incontrato^9,14. Primo, tutti flusso ingressi deve essere miscibile. Mentre emulsioni sono stati utilizzati per produrre NPs, FNP richiede una fase di soluzione uniforme nel mixer. In secondo luogo, il componente di nucleo deve essere quasi insolubile alle condizioni di solvente nel mixer (per la CIJ, una miscela 50/50 in volume) di guidare veloce nucleazione. In caso contrario, una parte significativa rimarrà unencapsulated o precipiterà dopo ulteriore diluizione con antisolvente. Il MIVM può abilitare antisolvente maggiore contenuto nella camera di miscelazione per limitazioni di solubilità del materiale di nucleo indirizzi. Spesso è utile generare le curve soprasaturazione dai dati di solubilità in funzione della composizione solvente per guidare la progettazione di processo⁹. Figura 6 Mostra le curve rappresentative per i due composti. Bassa soprasaturazione presso i meriti di condizioni camera miscelazione operanti a diverse composizioni, in genere utilizzando il MIVM. Superiore soprasaturazione privilegia la nucleazione del componente core rispetto alla crescita delle particelle ma una mancata corrispondenza in tempo di assemblaggio del materiale del nucleo e lo stabilizzatore può provocare grandi aggregati di terapeutico. D'Addio e Prud'homme hanno esaminato l'applicazione di tali curve di sovrasaturazione nel dettaglio⁹. Infine, il BCP deve essere sciolto molecolarmente nel flusso del solvente e il flusso di antisolvente deve essere selettivo per un isolato. Il BCP deve essere sufficientemente anfifilici per fornire sia una solvophobic forza dal blocco compresso per ancorare lo stabilizzatore sulla superficie della particella e per il blocco di solvatato conferire stabilità sterica della particella motrice. Solventi diversi da quelli descritti nel protocollo possono essere utilizzati fino a quando si incontrano questi vincoli.

Pratica con funzionamento manuale siringa può migliorare il tasso di successo durante la selezione. Come notato sopra, operazione sopra il passaggio a condizioni di miscelazione omogenee, turbolente significa che piccole variazioni di portata sono tollerate nel processo²⁸. Scala-fino a risultati flussi pompa-driven, controllati dal computer in guadagni anche maggiore di coerenza a causa dei tassi di flusso di ingresso riproducibile. In qualsiasi momento durante la post-elaborazione delle particelle, ispezione visiva o analisi DLS possono indicare la presenza di grandi aggregati che può essere a causa di instabilità incidentali di polvere o particelle. Quando necessario, il flusso può essere filtrato con un diametro dei pori filtro appropriato. In assenza di aggregati, che abbiamo trovato meno di 5% della massa è in genere persi quando si filtrano le nanoparticelle rivestite con PEG se la dimensione del filtro nominale è maggiore la distribuzione granulometrica. Quando si filtrano gli aggregati, determinazione sperimentale della massa persa durante il processo è necessario. Quantificazione della perdita di massa può avvenire in due modi. La massa di solidi totali in un dato volume può essere determinata dall'analisi termogravimetrica prima e dopo filtrazione per identificare la portata del cambiamento (Vedi Informazioni supplementari sezione 2). In alternativa, le particelle possono essere recuperati (ad esempio, mediante liofilizzazione) e disciolto in un buon solvente. La concentrazione del materiale del nucleo può quindi essere misurata direttamente mediante una tecnica appropriata come spettrofotometria ultravioletto-visibile o cromatografia.

Per FNP, il residuo 10 vol % solvente organico (ad es., THF) deve essere rimosso dalla dispersione acquosa. Questo può essere fatto da distillazione evaporativo^14,29, dialisi³⁰o flusso tangenziale filtrazione^31,32. Considerazioni pratiche per ogni fase di lavorazione sono descritti nelle citazioni fornite. Per dialisi, tipiche membrane sono kDa 3,5 o 6-8 kDa cut-off, anche se sono disponibili più opzioni. Questa frequenza di taglio del peso molecolare è sufficiente per la rimozione del solvente quando dializzato per 24 h utilizzando diverse modifiche di vasca. L'uso di filtrazione a flusso tangenziale comporta qualche sviluppo di processo come cura deve essere presa per evitare di indurre aggregazione a causa della polarizzazione di concentrazione sulla superficie di membrana. Abbiamo trovato che ridurre la composizione organica solvente sotto un valore dipendente dal sistema, di solito 2-10% in volume, Elimina l'aggregazione alla superficie della membrana. Dopo l'elaborazione, la concentrazione delle nanoparticelle è prontamente determinata da analisi termogravimetrica (Vedi Informazioni supplementari sezione 2). È spesso desiderabile per trasportare o conservare particelle in una forma altamente stabile. Dispersioni acquose possono semplicemente essere congelati rapidamente utilizzando una miscela di ghiaccio secco/acetone e quindi conservati a-80 ° C. In alternativa, polveri secche possono essere ottenute da liofilizzazione^33,34 o spruzzare asciugatura²⁴. Frequentemente, un crioprotettore deve essere aggiunto per ridurre l'aggregazione delle nanoparticelle durante il congelamento o essiccazione. Zuccheri (saccarosio, trealosio, ecc.), poly(ethylene glycol) o ciclodestrine possono essere schermate per efficacia sopra una gamma di concentrazioni di monitoraggio dimensione di DLS^{35,36,37, 38}. Comuni problemi di stabilità di NP durante l'elaborazione sono spesso legate alla separazione di fase o solubilità nel nucleo con conseguente riorganizzazione verso uno stato di energia inferiore in condizioni dove la mobilità è aumentato. Uso di materiali co-nucleo, stabilizzatori alternativi o soluzione esterna modificata composizione può contribuire a migliorare la stabilità^{14,16,17,39,40, 41}.

Come notato sopra, il MIVM consente maggiore antisolvente contenuto nella camera di miscelazione quando è necessario raggiungere alta soprasaturazione. Può anche permettere per la segregazione fisica di specie in due o più flussi quando vincoli reattività o solubilità lo richiedono. Un esempio è la formazione di nanoparticelle di proteina-stabilizzato zein del clofazimine antibiotico²⁴. La clofazimina idrofobo è stato introdotto in un flusso di acetone; Zein è stato introdotto in un flusso acquoso etanolico 60%; caseina, quali complessi con zein, è portato dentro con un flusso di tampone acquoso, e il flusso di quarto è buffer aggiuntivo per aumentare il rapporto di acqua per acetone ed etanolo. Due flussi di solvente sono necessari in quanto clofazimine e zein non sono solubili in un solvente comune. Questo processo non potrebbe essere compiuto in un mixer CIJ due getti. Questa formulazione stabilizzata proteina dimostra inoltre che FNP non è limitato a stabilizzatori BCP. Particelle di Janus sono state prodotte senza stabilizzatore⁴² e una gamma di stabilizzatori di basso costo sono stati dimostrati per applicazioni orale²⁴. In particolare, copolimeri ad esempio idrossipropilmetilcellulosa possono essere utilizzati al posto di blocco copolimeri²⁴. Materiali di nucleo possono essere fatti più idrofobiche da un certo numero di tecniche. Ione idrofobo abbinamento è stato applicato per incapsulare una vasta gamma di composti che hanno solubilità intermedia^43,44,45. Profarmaci estremamente idrofobe sono stati generati e quindi incapsulato⁴⁶. Gli acidi nucleici sono stati incapsulati tramite complessazione con lipidi cationici⁴⁷. D'importanza, questi studi hanno dimostrato che FNP può produrre una gamma di composizioni chimiche di superficie delle particelle. Sono stati utilizzati stabilizzatori più ulteriormente, misti contenente una frazione di BCP è stato modificato con un ligando targeting all'estremità della catena. Questo consente un controllo preciso contenuto di legante sulla superficie poiché la composizione delle particelle riflette il flusso di input composizione^23,48. Allo stesso modo, è possibile incorporare più componenti principali, tra cui coloranti e nanoparticelle inorganiche^3,8.

Nanoprecipitazione Flash è un approccio scalabile a nanoparticelle polimeriche comprende o un idrofobo o un core idrofilo. Se i criteri sopra elencati, generalmente oltre 95% del materiale del nucleo è incapsulato a alta frazione di massa della particella. I tre esempi qui presentati sono stati effettuati a bilancia da banco, che richiedono pochi milligrammi di materiale e di circa 0,5 mL in ogni flusso di aspirazione. Questo consente per screening rapido delle condizioni di particelle per l'ottimizzazione della formulazione. Scale-up di formulazioni di piombo per batch di dimensioni maggiori è una questione di esecuzione del processo più a lungo, che può essere compiuto facilmente attraverso l'uso di pompe a siringa o controllori di flusso. Al contrario, le scale-up di massa aggiunta nanoprecipitazione sfide ben documentato nel mantenimento sufficiente micromixing sul punto di aggiunta e contabilità per l'effetto di cambiare nave geometria⁴⁹. Si tratta di un ostacolo, poiché è essenziale per la produzione di particelle in modo coerente per soddisfare FDA requisiti⁵⁰. Tecniche di microfluidica possono anche produrre nanoparticelle uniforme, riproducibile, ma consentono solo la produzione nel range milligrammi. Ad esempio, Karnik et al ha segnalato tassi di produzione di 0,25 mg/min per un rilascio di farmaci studiano⁵¹. Ulteriore scalabilità implica, generalmente, parallelizzazione al capitale elevato costo¹². Con FNP, è semplice per produrre 1 grammo di nanoparticelle a 600 mg/min con una pompa a siringa e alcune rifiniture per collegare agli ingressi mixer. Di conseguenza, FNP rappresenta sia uno strumento di screening accessibile su scala di laboratorio, nonché un approccio scalabile alla produzione di NP per lavoro traslazionale.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confined Impinging Jets Mixer	NA	NA	See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Luer fitting	Idex Health & Science	P-604	Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads
Plug fitting	Idex Health & Science	P-309	Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Outlet fitting - CIJ	Idex Health & Science	P-205	Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet ferrule - CIJ	Idex Health & Science	P-200	Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet tubing - CIJ	Idex Health & Science	1517	Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrodue into mixing chamber
Tetrahydrofuran (THF)	Fisher Scientific	T425-4	Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.
Norm-ject syringe (3 ml)	VWR	53548-017
Vitamin E (α-tocopherol)	Sigma-Aldrich	90669-50G-F	Store cold
poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k	Polymer Source	P13141-SEO	Other block sizes acceptable depending on application
poly(styrene)1.8k	Polymer Source	P2275-S	Example hydrophobic core material
Scintillation vial	DWK Lifesciences	74504-20
Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk)	National	S7510-1
Maltodextrin DE 4-7	Sigma-Aldrich	419672-100G
poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k	Polymer Source	P5917-SAA	Other block sizes acceptable depending on application
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D159-4
Calcium chloride dihdyrate	Sigma-Aldrich	223506-25G	Hygroscopic.
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Ammonium Hydroxide	Fisher Scientific	AC423300250
Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA)	Sigma-Aldrich	A5503-1G
Multi-Inlet Vortex Mixer	NA	NA	See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Outlet fitting - MIVM	Idex Health & Science	P-942	Combination with ferrule
Outlet tubing - MIVM	NA	NA	Fit to ferrule ID.
O-ring (MIVM)	C.E. Conover	MM1.5 35.50 V75	Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Mixer stand	NA	NA	See Markwalter & Prud'homme for design.17