Determinazione del rischio di patogenicità variante usando l'analisi di segnale-rumore dell'amminoacido-livello di variazione genetica

Riepilogo

Analisi di segnale-rumore dell'amminoacido-livello determina la prevalenza della variabilità genetica in una posizione determinata dell'amminoacido normalizzata alla variazione genetica di sfondo di una determinata popolazione. Questo consente per l'identificazione della variante "hotspot" all'interno di una sequenza della proteina (segnale) che si erge sopra la frequenza delle varianti rare trovate in una popolazione (rumore).

Abstract

Gli avanzamenti del costo e velocità di sequenziamento genetico di nuova generazione hanno generato un'esplosione di clinica dell'esoma intero e test intero genoma. Mentre questo ha portato una maggiore identificazione di mutazioni patogene probabile associato a sindromi genetiche, anche notevolmente ha aumentato il numero di fortuito trovato varianti genetiche di importanza sconosciuta (VUS). Determinare il significato clinico di queste varianti è una grande sfida per gli scienziati e i medici. Un approccio per aiutare a determinare la probabilità di patogenicità è analisi di segnale-rumore al livello di sequenza della proteina. Questo protocollo descrive un metodo per l'analisi di segnale-rumore dell'amminoacido-livello che sfrutta la variante frequenza in ogni posizione dell'amminoacido della proteina con topologia di proteina nota per identificare le aree della sequenza primaria con elevata probabilità di variazione patologica (relativo alla variazione di popolazione "background"). Questo metodo può identificare la posizione di residui dell'amminoacido "hotspot" di alto segnale patologico, che possa essere utilizzate per perfezionare il peso diagnostico di VUSs come quelli identificati dai test genetici di prossima generazione.

Introduzione

Il rapido miglioramento nelle piattaforme di sequenziamento genetico ha rivoluzionato l'accessibilità e il ruolo della genetica nella medicina. Una volta limitata a un singolo gene, o una manciata di geni, la riduzione dei costi e aumento della velocità di ultima generazione sequenziamento genetico ha portato sequenziamento sistematico della totalità del genoma di sequenza di codificazione (il sequenziamento dell'esoma intero, WES) e l'intero genoma ( sequenziamento del genoma intero, WGS) nella regolazione clinica. WES e WGS sono stati utilizzati frequentemente nella cornice di neonati criticamente malati e bambini con preoccupazione per sindrome genetica dove è uno strumento diagnostico collaudato che può cambiare la gestione clinica^1,2. Mentre questo ha portato una maggiore identificazione di mutazioni patogene probabile associato a sindromi genetiche, anche notevolmente ha aumentato il numero di varianti genetiche fortuito trovati, o risultati imprevisti positivi, di diagnostica sconosciuto significato (VUS). Mentre alcune di queste varianti sono ignorate e non segnalati, varianti localizzazione di geni associati a malattie potenzialmente mortali o estremamente patologica sono spesso riportati. Attuali linee guida raccomandano di segnalazione delle eventuali varianti nei geni specifici che possono essere di beneficio medico al paziente, compreso i geni connessi con lo sviluppo di malattie predisponenti di morte cardiache improvvise come cardiomiopatie e canalopatie³. Anche se questa raccomandazione è stato progettato per catturare gli individui a rischio di una malattia predisponente SCD, la sensibilità di rilevazione variante supera di gran lunga specificità. Questo si riflette in un numero crescente di VUSs e incidentalmente identificato varianti con utilità di diagnostica poco chiaro che superano di gran lunga la frequenza delle rispettive malattie in una data popolazione⁴. Una tale malattia, sindrome del QT lungo (LQTS), è una canonica Canalopatia cardiaca causata da mutazioni in geni che codificano i canali ionici cardiaci eseguendo la localizzazione, o canale di interazione di proteine, con conseguente ritardo della ripolarizzazione cardiaca⁵. Questa ripolarizzazione in ritardo, vista da un prolungato intervallo QT all'elettrocardiogramma, a riposo si traduce in una predisposizione elettrica per potenzialmente fatali aritmie ventricolari quali torsioni di punta. Mentre un numero di geni sono stati collegati allo sviluppo di questa malattia, le mutazioni in KCNQ1-codificato in_Ks potassio canale (KCNQ1, Kv7.1) è la causa di LQTS tipo 1 e viene utilizzato come esempio inferiore a⁶. Che illustrano la complessità nell'interpretazione variante, la presenza di rare varianti nei geni di LQTS associata, così chiamati "sfondo variazione genetica" è stato descritto in precedenza^7,8.

Oltre ai database di grande compendio di varianti conosciute di patogeni, diverse strategie esistono per predire che le varianti differenti di effetto produrrà. Alcuni sono basati su algoritmi, quali SIFT e Polyphen 2, che può filtrare un numero elevato di nuove varianti non-sinonimo di prevedere deleteriousness^9,10. Nonostante l'ampio uso di questi strumenti, specificità bassa limita la loro applicabilità quando si tratta di "chiamata" clinica VUSs¹¹. Analisi di "Signal-to-noise" sono uno strumento che identifica la probabilità di una variante essendo associata a malattia basata sulla frequenza di variazione patologica noto ai loci in questione normalizzata contro variazione genetica rara da una popolazione. Varianti di localizzazione di loci genetici dove c'è un'alta prevalenza di mutazioni associate a malattia rispetto alla variazione basati sulla popolazione, un alto segnale-rumore, hanno maggiori probabilità di essere associati a malattia se stessi. Varianti più ulteriormente, rari trovati incidentalmente localizzazione di un gene con un'alta frequenza di varianti di rara popolazione rispetto alla frequenza di malattia-collegati, un basso segnale-rumore, può essere meno probabilità di essere associati a malattia. L'utilità di diagnostica di analisi di segnale-rumore è stato illustrato nelle ultime linee guida per test genetici per malattie del miocardio e canalopatie; Tuttavia, è stato impiegato solo a livello di intero gene o dominio specifico livello¹². Recentemente, data la maggiore disponibilità di varianti patologiche (database di malattia, studi di coorte nella letteratura) e di varianti di controllo basato sulla popolazione (Consorzio di aggregazione dell'esoma, ExAC e l'aggregazione di dati del genoma, GnomAD¹³), Questo è stato applicato alle posizioni individuali dell'amminoacido all'interno della sequenza primaria di una proteina. Analisi di segnale-rumore dell'amminoacido-livello si sono dimostrato utile nel categorizzare incidentalmente identificati varianti nei geni associati con LQTS come probabile variazione genetica "sfondo", piuttosto che malattia-collegati. Tra i tre principali geni associati con LQTS, tra cui KCNQ1, queste varianti incidentalmente identificate mancavano un rapporti segnale-rumore significativo, suggerendo che la frequenza di queste varianti alle posizioni di singoli aminoacidi riflettono rara variazione di popolazione piuttosto che mutazioni associate a malattia. Inoltre, quando la topologia di dominio specifico della proteina era overlaid contro le zone di alto segnale-rumore, patologica mutazione "hotspot" localizzato in chiave domini funzionali delle proteine¹⁴. Questa metodologia tiene la promessa nella determinazione che 1) la probabilità che una variante è associata di malattia o di popolazione e 2) identificare nuovi critici domini funzionali di una proteina connessa con la malattia umana.

Protocollo

1. identificare il Gene e Splice specifica isoforma di interesse

Nota: Qui, noi dimostrare l'uso di Ensembl¹⁵ per identificare la sequenza di consenso per il gene di interesse che è associato con la patogenesi della malattia di interesse (cioè KCNQ1 mutazioni sono associate con LQTS). Alternative di Ensembl includono RefSeq tramite il National Center for Biotechnology Information (NCBI)¹⁶ e la University of California, Santa Cruz (UCSC) Human Genome Browser¹⁷ (Vedi Tabella materiali).

1. Nella homepage del Ensembl, selezionano la specie (cioè umano) nel menu a discesa e immettere il gene dell'acronimo di interesse nel campo (cioè KCNQ1). Clicca su "Vai"
2. Selezionare il link corrispondente al gene di interesse (cioè "KCNQ1 (Gene umano)"
3. Selezionare il link corrispondente alla trascrizione dell'ID di interesse di interesse dalla tabella"trascrizione" (vale a dire TranscriptID ENST00000155840.10, NM_000218 [trascrizione del RNA], NP_000209 [prodotto della proteina della trascrizione del RNA]).
   Nota: Revisione della letteratura pertinente è necessario assicurare che la sequenza di consenso di trascrizione corretta è selezionata.
4. Nota i numeri di identificazione specifico trascrizione NM e NP per riferimento futuro che trovata nella colonna "RefSeq" della tabella"trascrizione".
5. Selezionare il link associato al numero identificativo NP per aprire una nuova pagina Web dal database NCBI proteina.
6. Scorri fino alla sezione di "Origine" per ottenere la sequenza della proteina (primario) per la trascrizione del gene di interesse.
7. Scorrere fino alla sezione "Caratteristiche" per ottenere un elenco delle caratteristiche della proteina (domini funzionali, domini, siti di modificazione post-traduzionale).
   Nota: Queste informazioni possono essere ottenute anche tramite la banca dati NCBI proteina o da fonti primarie nella letteratura. Questo sarà discusso ulteriormente nel passaggio 5.

2. creare il Database variante genetico sperimentale (il "segnale")

Nota: Qui, noi dimostrare come creare un database di malattia-collegati di varianti del gene di interesse con la frequenza delle varianti malattia-collegata fra gli individui con la malattia di interesse. Questo database può assumere molte forme e rappresenta il "segnale" (fenotipo-positiva variazione genetica) che sarà normalizzato nel database di variante di controllo. Questo può includere varianti 1) malattia-collegati per il confronto contro VUSs per identificare nuovi domini funzionali della proteina e/o 2) VUSs, tra cui incidentalmente identificati VUSs, da confrontare con varianti di malattia-collegati per determinare la probabilità di patogenicità. Varianti di malattia-collegati in KCNQ1 saranno presentati per illustrazione; Tuttavia, il metodo è lo stesso per l'analisi di VUSs fortuito identificato o qualsiasi altro insieme di varianti sperimentali.

1. Identificare cohort(s) di casi di indice/probands indipendenti con la malattia di interesse per i quali il gene di interesse era completamente genotipizzato per tutti i probands (cioè uno studio identifica 24 probands indipendenti hosting varianti in KCNQ1 su 200 individui con LQTS che sono stati sottoposti a interrogatori genetica KCNQ1).
   Nota: Queste coorti possono essere identificati dalla letteratura, da analisi genetica sperimentale, o una combinazione di entrambi.
   1. Escludere gli studi che non sono basati su coorte (vale a dire un rapporto di caso descrive un singolo individuo di mutazione-positivi), non forniscono il numero totale di individui genotipizzati per il gene di interesse, o non completamente geneticamente analizzare il gene ( vale a dire un "mirati" screening genetico di solo KCNQ1 esoni 2-4) questi esclude il calcolo della frequenza di una variante.
   2. Includono gli individui che sono probands indipendenti ed escludono gli individui correlati come questo può sovrastimare la variante frequenze (cioè uno studio identifica 4 individui indipendenti con le mutazioni KCNQ1 in un gruppo di 20 pazienti con LQTS. Uno di questi probands è parte di una famiglia con 5 altri parenti di mutazione-positivi. Escludere tutti i membri della famiglia e includere solo le 4 probands indipendenti).
2. Compilare tutte le varianti genetiche sperimentali trovate in cohort(s) identificati
   1. Assegnare la nomenclatura che contiene l'aminoacido di selvaggio-tipo, posizione dell'amminoacido e variante dell'amminoacido (cioè alanina a aminoacido numero 212 cambiato a valina, Ala212Val o A212V). Un tale tipo di nomenclatura è illustrata nella Figura 1.
   2. Confermare che nomenclatura variante di tutte le varianti genetiche sperimentali si basa sulla stessa trascrizione del gene di riferimento come indicato al punto 1.4. Se varianti genetiche sperimentali non sono annotati sulla trascrizione del gene di riferimento stesso, quindi reannotate variant posizione a una trascrizione di riferimento utilizzando trascrizione allineamento (Vedi punto 1.2)
3. Escludere le varianti che non sono applicabili in base alla domanda in fase di esplorazione.
   1. Varianti di escludere localizzazione a regioni non codificanti del genoma o varianti che non alterano la proteina di sequenza come sinonimi, intronic varianti, 5' o 3' regione non tradotta [UTR] e regione intergenica varianti (cioè un segnalato patologica variante in KCNQ1 che localizza al 5' UTR della regione di codificazione sarebbero esclusi come non si prevede di modificare la sequenza di proteine).
   2. Escludere le varianti che non soddisfano i criteri di inclusione per lo studio. Per le varianti di malattia-collegati, questo include varianti che non sono ritenuti patologici.
      1. Confermare che ogni variante è attualmente ritenuta probabile patogeno, patogeni, o almeno non benigne, incrociando varianti con il database di ClinVar (Vedi Tabella materiali).
      2. Inserire il gene e la variante di interesse nel campo di ricerca di ClinVar (cioè KCNQ1-Y111C), selezionare "Cerca"
      3. Identificare la variante di interesse sotto la colonna "Variazione/posizione".
      4. Si noti l'interpretazione di consenso di patogenicità nella colonna "Significato clinico" (cioè KCNQ1-Y111C viene interpretato come "patogeni").
      5. Includere le varianti che sono "probabili patogeni" o "patogeno".
      6. Includere le varianti con le denominazioni di "interpretazioni contraddittorie di patogenicità," "significato incerto", o quando nessun record è disponibile ("non previsto") se giustificate dallo studio.
      7. Escludere le varianti designati come "probabilmente benigna" (cioè KCNQ1-A62T).
4. Calcolare la frequenza dell'allele minore (MAF) di ogni posizione variante sperimentale.
   1. Calcolare come qualsiasi alleli erano positivi per ogni rispettiva variante (vale a dire se una mutazione eterozigote è trovata in 2 individui indipendenti, il numero degli alleli di variante-positiva KCNQ1-Y111C è 2).
   2. Calcolare il numero totale di alleli in sequenza all'interno della coorte
      1. Prendere nota del numero totale di individui sequenziati in ogni studio di coorte (punto 2.1)
      2. Moltiplicare il numero totale di individui per 2, per determinare il numero totale di alleli.
         Nota: Questo presuppone genomi diploidi per cui ogni singoli host 2 di ciascun allele.
   3. Calcolare il numero totale di individui di variante-positivi per ogni posizione dell'amminoacido (alleli in 2.4.1/alleles passo a passo 2.4.2). Ad esempio, se non collegati 2 individui ogni ospitano mutazioni eterozigotiche KCNQ1-Y111C in coorti di individui afflitti da LQTS 100 e 200, rispettivamente, allora la frequenza delle varianti sperimentali alla posizione dell'amminoacido 111 è 2 varianti/((100+200 individuals ) * 2 alleli/individuo) (cioè combinato MAF 0,0033).
   4. Calcolare questo valore per ciascuna variante come la MAF rispettiva di ciascuna variante sperimentale. Per ulteriori dettagli vedere il punto 4.2.

3. creare il Database variante genetica di controllo (il "rumore")

Nota: Qui, noi dimostrare come creare un database di varianti di controllo del gene di interesse con una frequenza associata in una popolazione di controllo. Questo database rappresenta il "rumore" (fenotipo negativo, basato sulla popolazione variazione genetica) che è lo sfondo contro cui il database variante sperimentale sarà normalizzato. Questa è detta variazione di "controllo".

1. Identificare un cohort(s) dei probands sani, indipendenti o utilizzare grandi studi basati sulla popolazione per identificare varianti rare tra una determinata popolazione.
   Nota: Fonti per questo database sono diversi e comprendono: 1) individui in buona salute e/o altrimenti fenotipo negativo individui sottoposti a Sanger sequenziamento o database pubblicamente tenuti degli individui basati sulla popolazione per la quale la malattia in questione è rara in frequenza ad esempio 2) 1000 Genome Project (N = 1.094 soggetti)¹⁸, 3) National Heart, Lung e progetto di sequenziamento dell'esoma sangue Istituto GO (ESP, N = 5.379 soggetti)¹⁹, 4) dell'esoma aggregazione Consortium (ExAC, N = 60.706 soggetti)¹³ , e/o 5) aggregazione di dati del genoma (GnomAD, N = 138.632 individui)¹³ (Vedi Tabella materiali). Il database di GnomAD sarà utilizzato come esempio illustrativo.
   1. Inserire il gene di interesse nella casella di ricerca nella homepage di GnomAD (cioè KCNQ1).
   2. Verificare che il browser selezionato il gene corretto e trascrizione di interesse (punto 1.4).
   3. Verificare che vi sia una copertura adeguata del sequenziamento del locus esaminando "media copertura" e "copertura trama."
   4. Selezionare per variazione di sequenza genetica di codifica selezionando "Missenso + LoF."
   5. Selezionare "Esporta tabella in formato CSV," che genererà un file di TextEdit denominata "Sconosciuto".
   6. Rietichettare il file e includono una nuova estensione "CSV" (cioè "KCNQ1 controllo Variation.csv").
   7. Aprire il file utilizzando un programma di software appropriato per l'analisi di file CSV (Vedi Tabella materiali).
2. Identificare la proteina cambiando variazione genetica nella colonna denominata "Proteina conseguenza."
3. Applicare criteri di esclusione stessa per queste varianti genetiche di controllo come le varianti genetiche sperimentali (punto 2.3.1).
4. Identificare la MAF di ogni variante di controllo.
   1. Individuare la colonna "Allele totali", che denota il numero di alleli trovato per harbor la variante.
   2. Individuare la colonna "Numero di Allele", che denota il numero totale di alleli sequenziato in questa data la posizione di acido amminico.
      Nota: Il numero totale di alleli sequenziato variano a seconda della copertura in quella posizione. Aree di copertura alta si avvicineranno 2 * numero totale degli individui all'interno di GnomAD (cioè per 138.632 individui, copertura completa comprende 277.264 totali alleli genotipizzati).  Al contrario, aree di copertura inferiore avrà un numero di allele totale ridotta
   3. Individuare la variante MAF che è pre-calcolati nella colonna "Frequenza dell'Allele" e rappresenta "Allele conteggio" diviso "Allele numero."
      Nota: Genomi umani hanno due di ogni allele (cioè 1 oggetto trovato per avere una variante eterozigote in 10 persone ha una MAF di 1/20)
   4. Si noti la MAF per ciascuna variante come la MAF rispettiva di ciascuna variante di controllo.
      Nota: Variante MAF specifici per ogni gruppo razziale/etnica comprendente GnomAD può essere visto nelle colonne a destra della "Frequenza allelica."
5. Applicare una soglia MAF per varianti rare sopra il quale controllo varianti sono esclusi come "comune".
   1. Impostare la soglia MAF al valore massimo a cui tutti veramente malattia-collegati varianti (vedi passo 2) osservate anche nel database di controllo sono inclusi sotto la soglia (vale a dire, tra tutte le varianti di KCNQ1 malattia-collegati anche trovato in GnomAD la variante comune più alto MAF è 0,009, allora devono essere escluse tutte le varianti di GnomAD sopra una soglia di 0,01).
6. Garantire che nomenclatura variante sperimentale è identica al controllo (Vedi punto 2.2).
7. Salvare il file. In alcuni casi, questo potrebbe essere necessario modificare il tipo di estensione.

4. mappatura e calcolo del segnale-rumore livello aminoacido

1. Calcolare una MAF per ogni posizione dell'amminoacido con una variante di controllo (vedere Figura 1 contenenti varianti KCNQ1 GnomAD esempio).
   1. In un foglio di calcolo in grado di rappresentare graficamente, è possibile creare una colonna delle posizioni di tutte le varianti sperimentali.
   2. Rimuovere il testo variante per lasciare solo la variante posizione.
      Nota: Varie funzioni/formule possono essere utilizzate per eliminare automaticamente questi elementi di testo all'interno delle cellule (Figura 1, colonna C; Vedi Tabella materiali).
   3. Ordinare le varianti in valore ascendente per identificare quali posizioni hanno più di 1 variante associata con essa (Figura 1, colonna E; posizione di amminoacido 10 cioè è elencato due volte nella colonna E che denota 2 varianti uniche nella posizione).
   4. Combinare la MAF per ogni variante connessa con una determinata posizione prendendo la somma di tutti i MAFs per una data posizione (Figura 1, colonna G e H).
2. Calcolare una MAF per ogni posizione dell'amminoacido con una variante sperimentale (Vedi Figura 2 contenente finto KCNQ1 varianti patologiche).
   1. In modo simile al punto 4.1.1, creare una colonna di posizioni dell'aminoacido che hanno varianti sperimentali (Figura 2, colonna B).
   2. Per ogni posizione di variante, calcolare la MAF di tutte le varianti associate a tale posizione dal passaggio 2.4 (Figura 2, colonna C-G).
3. Creare un rotolamento medio di MAF per entrambi sperimentale e varianti di controllo.
   1. Espandere le colonne create in 4.1 e 4.2 per includere le cellule per le posizioni dell'aminoacido che non hanno nessuna variante come una MAF = 0. (Figura 3).
      1. Creare una colonna contenente tutte le posizioni dell'amminoacido del gene di interesse (cioè 1 676 per KCNQ1, Figura 3, colonna C e io).
      2. Aggiungere una MAF 0 per tutte le posizioni che non hanno varianti per controllo e set di dati sperimentali.
         Nota: Questo può essere fatto automaticamente utilizzando la funzione "Cerca" in un programma di software comunemente utilizzati (Figura 3, colonna D e J, Vedi Tabella materiali).
   2. Creare un rotolamento medio per ogni sperimentale e colonna di prevalenza del controllo.
      Nota: Questo consente l'inferenza di patogenicità di posizione adiacente e può essere modificato o addirittura esclusi, per soddisfare le esigenze dello studio.
      1. Creare una colonna che rappresenta una media della MAF per entrambi il per controllo e set di dati sperimentali (Figura 3, colonna E e K).
      2. Nella colonna media rotolamento, posizionare la media dei rispettivi MAF per le 5 posizioni variante variante N-terminale e 5 posizioni C-terminale nella posizione specificata.
         Nota: Questa crea un rotolamento medio di + /-5. Per le posizioni con meno di 5 residui dell'amminoacido precedente, o in seguito, una posizione media rotolamento (cioè N - o C-terminale), la media mobile prenderà in considerazione solo quei residui che sono presenti (cioè il rotolamento media presso posizione dell'amminoacido 3 sarà una media della MAF alle posizioni dell'amminoacido 1 anche se 8, calcolato come la somma di questi MAFs diviso 8).
4. Calcolare la frequenza di controllo del minimo dividendo la MAF più basso rotolamento per 2.
   1. Modificare una cella con un controllo MAF 0 la frequenza minima per evitare la divisione per 0 quando si calcola un rapporto segnale-rumore.
5. Calcolare il rapporto di segnale-rumore del livello dell'aminoacido (Figura 4).
   1. Dividere ogni posizione dell'amminoacido sperimentale rotolamento medio dal rispettivo controllo medio di rotolamento.
   2. Posizione di questo rapporto (asse y) vs dell'amminoacido (asse x) del grafico.

5. proteina dominio topologia Overlay

1. Identificare le posizioni di consenso dell'amminoacido di domini/caratteristiche funzionali, o aree di modificazione post-traduzionale, della proteina di interesse (punto 1.7).
   Nota: Un numero di risorse possa essere utilizzato per identificare questi domini. Queste risorse, nonché risorse per identificare putativi domini in nuove proteine, sono state esaminate bene nella letteratura²⁰. Questo protocollo descriverà il database di proteina disponibile attraverso NCBI, che è ampiamente utilizzato e robusto (Vedi Tabella materiali).
2. Identificare posizioni dell'amminoacido associate a proteine domini/funzionalità.
   1. Aprire la pagina Web NCBI.
   2. Immettere la NP della proteina di interesse nel campo di ricerca.
   3. Identificare i domini proteici noti e caratteristiche sono cataloghi sotto "Funzionalità".
   4. Identificare e annotare le posizioni dell'aminoacido e tipo di nome di dominio.
   5. Selezionare il link corrispondente alla funzione di visualizzare la regione sulla proteina della sequenza primaria di interesse.
3. Creare una colonna contenente i confini dei domini/caratteristiche.
   1. Creare una colonna accanto alla colonna di segnale: rumore in modo che la colonna di posizione dell'amminoacido può essere fatto riferimento (Figura 5A, colonna C).
   2. Identificare le cellule corrispondente alla funzione N-terminale o C-terminale di ogni funzionalità di dominio e inserire un 1 in ogni cella (cioè se il dominio N-terminale del dominio transmembrana S1 di KCNQ1 è posizione dell'amminoacido 122, e il dominio C-terminale è posizione 142, poi un 1 è posizionato nella riga per posizione dell'amminoacido 122 e 142).
   3. Per domini/caratteristiche di sovrapposizione, visualizzare più domini modificando il 1 su altri valori (cioè 1.5, 2, 2.5); Questo può aiutare a distinguere domini.
4. Creare un grafico con questi confini come posizione asse y e dell'aminoacido sull'asse x (Figura 5B).
5. Overlay grafico con il grafico del segnale-rumore creato nel passaggio 4.4.
6. Identificare le correlazioni fra proteina nota domini/caratteristiche e l'analisi di segnale-rumore.

6. variant posizione Overlay

1. Mappa di singole posizioni variante per la sovrapposizione di grafici prodotti nei passaggi 4.4 e 5.4.
   1. Creare una colonna accanto alla colonna di funzionalità di dominio in cui righe nella colonna corrisponderà all'aminoacido posizioni (Figura 5A, colonna D).
   2. Collocare un 1 in ogni cella della riga aggiunta corrispondente a una posizione contenente una rispettiva variante.
   3. Creare un grafico con questa colonna come posizione asse y e dell'aminoacido sull'asse x (Figura 5C).
2. Overlay grafico con il grafico di segnale-rumore creato nel passaggio 4.4 e dominio creato nel passaggio 5.4.

Risultati

Un risultato rappresentativo dell'amminoacido-livello segnale per analisi del rumore per KCNQ1 è raffigurato in Figura 6. In questo esempio, varianti rare identificati nel gruppo GnomAD (gruppo di controllo), incidentalmente identificato WES varianti (coorte sperimentale #1) e varianti LQTS associata a caso ritenuto probabile malattia-collegati (sperimentale coorte #2) è raffigurati. Ulteriormente, l'analisi di segnale-rumore confrontando la frequenza varia...

Discussione

Test genetici di alto-rendimento ha avanzato notevolmente nella sua applicazione e la disponibilità nell'ultimo decennio. Tuttavia, in molte malattie con basi genetiche ben consolidate, come cardiomiopatie, test espanso ha fallito migliorare il rendimento diagnostico²¹. Inoltre, c'è notevole incertezza per quanto riguarda l'utilità di diagnostica di molte varianti identificate. Ciò è parzialmente dovuto un numero crescente di varianti rare identificati incidentalmente scoperto su WES e WGS, c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 Genome Project	N/A	www.internationalgenome.org
ClinVar	N/A	www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar
Ensembl Genome Browser	N/A	uswest.ensembl.org/index.html
Excel	Microsoft	office.microsoft.com/excel/	Used for all example formulas and functions
Exome Aggregation Consortium	N/A	www.exac.broadinstitute.org
Genome Aggregation Database	N/A	www.gnomad.broadinstitute.org
National Center for Biotechnology Information Domain and Structure Database	N/A	www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/domains-structures/
National Center for Biotechnology Information Gene Database	N/A	www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/
National Center for Biotechnology Information Protein Database	N/A	www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/
National Heart, Lung, and Blood Institute GO Exome Sequencing Project	N/A	www.evs.gs.washington.edu/EVS/
SnapGene	GSL Biotech LCC	www.snapgene.com
University of California, Santa Cruz Human Genome Browser	N/A	www.genome.ucsc.edu