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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Protocolli dettagliati per entrambi in vitro e nelle celle selettivo 2'-idrossile acilazione analizzati dagli esperimenti di estensione (forma) di primer per determinare la struttura secondaria delle sequenze di pre-mRNA di interesse in presenza di una piccola molecola di RNA-targeting sono presentato in questo articolo.

Abstract

Nel processo di sviluppo di farmaci di RNA-targeting piccole molecole, delucidando i cambiamenti strutturali sulle loro interazioni con sequenze di RNA di destinazione desiderata. Forniamo qui una dettagliata in vitro e nelle celle selettivo 2'-idrossile acilazione analizzati di estensione dell'iniettore protocollo (forma) per studiare il cambiamento strutturale di RNA in presenza di un farmaco sperimentale per l'atrofia muscolare spinale (SMA), sopravvivenza di del neurone di motore (SMN)-C2 e in essone 7 del pre-mRNA del gene SMN2. In forma in vitro, una sequenza di RNA di 140 nucleotidi contenenti SMN2 essone 7 è trascritto da T7 RNA polimerasi, piegata in presenza di SMN-C2 e successivamente modificata da un reagente di acilazione mite 2'-OH, 2-methylnicotinic acido imidazolide (NAI). Questo complesso di 2'-OH-NAI è ulteriormente sondato da un 32estensione P-con l'etichetta dell'iniettore e risolto mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide (pagina). Al contrario, 2'-OH acilazione in forma nelle celle si svolge in situ con SMN-C2 associato RNA cellulare in cellule viventi. La sequenza di pre-mRNA dell'esone 7 del gene SMN2, insieme a forma-indotto mutazioni nell'estensione del primer, poi è stata amplificata dalla PCR e soggette a sequenziamento di nuova generazione. Confrontando le due metodologie, forma in vitro è un metodo più redditizio e non richiede potenza di calcolo per visualizzare i risultati. Tuttavia, il modello in vitro di RNA derivati da SHAPE a volte si discosta dalla struttura secondaria in un contesto cellulare, probabilmente a causa della perdita di tutte le interazioni con le proteine RNA-leganti. Nelle celle forma non ha bisogno di un posto di lavoro materiale radioattivo e produce una struttura secondaria di RNA più precisa nel contesto cellulare. Inoltre, nelle celle forma è solitamente applicabile per un più grandi sequenze di gamma di RNA (~ 1.000 nucleotidi) utilizzando il sequenziamento di nuova generazione, rispetto a in vitro forma (~ 200 nucleotidi) che di solito si basa sull'analisi della pagina. Nel caso dell'esone 7 in SMN2 pre-mRNA, la forma in vitro e nelle celle derivate RNA modelli sono simili tra loro.

Introduzione

Acilazione di selettivo 2'-idrossile analizzati di estensione dell'iniettore (forma) è un metodo di misurazione la cinetica di ogni nucleotide in una sequenza di RNA di interesse e la struttura secondaria a singolo nucleotide risoluzione1. Metodologie di forma, sia in condizioni in vitro2,3,4 (RNA purificato in un sistema tampone definito) e in vivo le cellule di mammiferi5,6, sono stati sviluppati per indagare il secondario struttura delle sequenze di RNA di media lunghezza (in genere < 1.000 nucleotidi per forma nelle celle e < 200 nucleotidi per la forma in vitro). È particolarmente utile per valutare i cambiamenti strutturali nel recettore RNA legandosi al RNA-interacting piccola molecola metaboliti2,4,7,8 e a studiare azioni meccanicistiche di molecole di RNA-targeting durante droga sviluppo9,10.

RNA-targeting scoperta della droga ha recentemente attirato l'attenzione in laboratori accademici e l'industria farmaceutica11,12 tramite diversi approcci e strategie13,14,15 ,16. Esempi recenti di RNA-targeting di piccole molecole per uso clinico due farmaci sperimentali strutturalmente distinti, LMI-07017 e18,RG-791619, per atrofia muscolare spinale (SMA), che ha mostrato promettente Risultati in fase di test clinici II20. Entrambe le molecole sono state dimostrate per la sopravvivenza di destinazione del neurone di motore (SMN) 2 pre-mRNA e regolano il processo di splicing del SMN2 gene6,17,21. Precedentemente abbiamo dimostrato l'applicazione di in vitro e nelle celle forma un esame dei cambiamenti strutturali in presenza di un analogo di RG-7916 conosciuto come SMN-C26destinazione RNA.

In linea di principio, forma misura il tasso di acilazione di 2'-OH di ogni nucleotide di una sequenza di RNA in presenza di una quantità eccessiva di un reagente di acilazione auto-estinguente in modo imparziale. Il reagente di acilazione non è stabile in acqua, con una breve emivita di (ad esempio, T1/2 = 17 s per anidride acetica 1-metil-7-nitroisatoic; o 1 M 7, ~ 20 min per imidazolide acido 2-methylnicotinic, o NAI)22 e insensibilità all'identità del le basi23. In questo modo un più favorevole acilazione dei gruppi 2'-OH di basi flessibile, che possono essere trasformati in un'accurata valutazione delle dinamiche di ogni nucleotide. In particolare, un nucleotide in un base-accoppiamenti è solitamente meno reattivo rispetto ad uno spaiato di un reagente modificazione di 2'-OH, come NAI e 1 M 7.

Guardando l'origine del modello RNA e dove si svolge la 2'-OH acilazione, forma possa essere classificato generalmente in forma in vitro e nelle celle. In vitro forma utilizza purificata T7 trascritti di RNA e manca un contesto cellulare in disegni sperimentali. A forma di nelle celle, 2'-OH acilazione sia la trascrizione del RNA modello si verificano nelle cellule viventi; di conseguenza, i risultati possono ricapitolare il modello strutturale di RNA in un contesto cellulare. FORMA nella cella è stato indicato come in vivo forma per la forma riportata in cellule viventi nella letteratura24. Dal momento che questo esperimento non viene eseguito in un animale, abbiamo chiamato questo esperimento come forma nella cella per precisione.

Le strategie per la fase di estensione del primer di forma in vitro e nelle celle sono anche differenti. A forma di in vitro, trascrizione d'inversione si ferma nella posizione di acilazione di 2'-OH in presenza di Mg2 +. Un'estensione dell'iniettore 32P-labled appare quindi come una band in elettroforesi su gel di poliacrilamide (pagina) e l'intensità della banda è proporzionale al tasso acilazione1. A forma di nelle celle, trascrizione inversa genera mutazioni casuali presso la 2'-OH del complesso posizione in presenza di Mn2 +. Il tasso mutazionale di ogni nucleotide può essere catturato nel sequenziamento di nuova generazione di profondità, e la reattività di forma a singolo nucleotide risoluzione può quindi essere calcolata.

Un potenziale problema per la forma nella cella è il rapporto segnale-rumore basso (cioè, una maggioranza dei gruppi 2'-OH è invariata, mentre le sequenze non modificate occupano la maggior parte delle leggi nel sequenziamento di nuova generazione). Recentemente, un metodo per arricchire la 2'-OH per volta RNA, indicato come in vivo, fare clic su forma (icSHAPE), è stato sviluppato dai Chang laboratorio25. Questo metodo di arricchimento può essere vantaggioso nello studio debole piccole molecole quali interazioni RNA, soprattutto in un interrogatorio del trascrittoma-wide.

Protocollo

1. in Vitro forma

Nota: Il protocollo viene modificato dal protocollo pubblicato1.

  1. Preparare il modello di RNA
    Nota: Il modello per la trascrizione di T7 è stato ordinato come un sintetico double-stranded del DNA (dsDNA) e amplificato da entrambi inserimento in un vettore di e. coli che trasporta un unico paio di EcoRI/BamHI endonuclease di limitazione, ad esempio pET28a, o mediante PCR. Il protocollo per l'amplificazione di PCR è illustrato di seguito.
    1. Mescolare il materiale seguente: mescolare 50 μL di master di PCR (Vedi Tabella materiali), 2 μL per ciascun primer a 10 μM (Vedi tabella 1 per le sequenze), 200 ng di dsDNA modello 2 μL μL 3 di solfossido dimetilico (DMSO) e 41 μL di H2O. aliquota in due PCR tubi (ogni tubo contiene 50 μL di miscela di reazione).
    2. Impostare il termociclatore come segue: fase 1) 95 ° C per 30 s; fase 2) 95 ° C per 20 s; fase 3) 56 ° C per 20 s; fase 4) 72 ° C per 20 s; ciclo di fase 5) torna alla fase 2 per 30 cicli; fase 6) 72 ° C per 3 min; e fase 7) infinito che tiene a 4 ° C fino al passaggio seguente.
    3. Purificare l'amplicone PCR mediante estrazione di fette del gel (Vedi Tabella materiali e utilizzare il protocollo del produttore). Eluire il DNA del prodotto con 35 μL di tampone Tris-EDTA (TE), contenente 10 mM Tris (pH 8.0) e 1 mM EDTA, per produrre un 0,1 – 0,5 μg/μL modello. Normalizzare il modello di DNA purificato in 0.10 μg/μL.
      Nota: Facoltativamente, la qualità del modello può essere analizzata su un'elettroforesi su gel di agarosio 1,8% con 0.10 μg di DNA. Una singola banda di DNA modello desiderato è previsto sul gel.
    4. Impostare la reazione di trascrizione T7 (volume totale 40 μL) aggiungendo i seguenti materiali in una provetta PCR: 4 μL di tampone di reazione, 4 μL di ATP, 4 μL di CTP, 4 μL di GTP, 4 μL di UTP, 4 μL di enzima T7: 10x (Vedi Tabella materiali) , 4 μL di un amplicone PCR purificato dal punto 1.1.3 (0,4 μg) e 12 μL di pirocarbonato dietilico (DEPC)-acqua trattata. Mescolare pipettando su e giù x 4. Incubare a 37 ° C per 4 – 16 h in un termociclatore o in un incubatore a 37 ° C.
      Nota: Iniziare a impostare passo 1.1.6 mentre la reazione al punto 1.1.4 è in corso.
    5. Aggiungere 2 μL di DNasi, Miscelare pipettando su e giù per 4x e incubare a 37 ° C per 15 min. Mix con un volume uguale di 2 x Tris-Borato-EDTA (TBE)-tampone di urea (Vedi Tabella materiali). Scaldare a 70 ° C per 3 min inattivare.
    6. In un flacone di RNAsi-libera, mescolare 75 mL di soluzione al 40% acrilammide/bisacrylamide (29: 1, Vedi Tabella materiali), 180,2 g di urea e 50 mL di tampone di x TBE 10 (RNasi-free, vedere Tabella materiali). Mettere la bottiglia su un agitatore orbitale (250 giri/min) fino a quando tutti i cristalli di urea sono dissolti (può richiedere fino a 2 h). Regolare il volume a 500 mL con acqua trattata con DEPC. Filtrare la soluzione con una membrana di 0,2 μm (Vedi Tabella materiali).
      Nota: In questo processo, evitare utilizzando speculare e ancoretta per prevenire la contaminazione RNasi. La soluzione può essere conservata a 4 ° C fino a 1 anno.
    7. Pulire due lastre di vetro di elettroforesi di dimensioni adeguate (16,5 x 24 cm) con acqua deionizzata e 70% EtOH utilizzando un pezzo di carta di pulizia. Allineare le piastre con un paio di anelli distanziali da 2,0 mm (la piastra con una superficie siliconata è rivolto verso l'interno) e sigillate il bordo delle piastre con del nastro adesivo. Doppia-nastro all'angolo della piastra per prevenire le infiltrazioni.
    8. In un becher da mescolare 200 mL di soluzione di acrilammide da passo 1.1.6, 2,0 mL di soluzione di persolfato d'ammonio 10% e 100 μL di tetrametiletilendiammina (TEMED) con una punta di pipetta RNAsi-libera agitando rapidamente per 30 s. Tilt le piastre su un pezzo di copertura benchtop e versare la soluzione dal divario delle piastre. Toccare la piastra per sollevare eventuali bolle e appoggiare la piastra sul coperchio benchtop. Immediatamente inserire il pettine e lasciare che il gel polimerizzare per almeno 1 h.
      Nota: Se il gel deve essere utilizzato entro il giorno successivo, è possibile coprire la parte superiore del gel con un pezzo di tovagliolo di carta bagnato e wrap up con un pezzo più grande di involucro di plastica. Posizionarlo sdraiato piatto a 4 ° C.
    9. Rimuovere il nastro e la piastra di serraggio in uno stand di elettroforesi. Togliere il pettine e aggiungere adeguata 1 tampone di x TBE nella parte superiore e inferiore del serbatoio. Pre-corsa il gel per 30 min a 20 w.
      Nota: Facoltativamente, se il contenuto del RNA desiderato è ~ 90% o più, un mini-gel può essere utilizzato in sostituzione di un gel preparativo.
    10. Lavare ogni i pozzetti di caricamento pipettando su e giù due volte con il liquido nel serbatoio. Aggiungere RNA grezzo dal punto 1.1.5 nei pozzetti. Esegua il gel a 20 W fino a quando la tintura di xilene cianolo FF (blu chiaro) passa circa due-terzi della lunghezza del gel (~ 60 min).
      Nota: Assicurarsi di non più di un terzo dell'altezza del pozzo di carico (se necessario, utilizzare pozzi multipli).
    11. Immergere il gel in 1 x TBE tampone con diluizione di 1: 10.000 della cassaforte tingere (Vedi Tabella materiali) in un contenitore abbastanza grande per il gel. Mettere il contenitore in un agitatore orbitale per 5 min a 80 giri/min.
    12. Sotto la luce UV, identificare la banda di RNA desiderata e tagliare rapidamente una fascia sottile di gel utilizzando una lama di rasoio pulita. Posto 1 – 2 fette del gel in un tubo di 1,7 mL.
    13. Recuperare il RNA dal gel slice di eluizione passiva. Aggiungere il mix adeguato di eluizione/precipitazioni (~0.3 mL per fetta) ad ogni provetta: 0,3 M NaOAc (pH 5.2), 2,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% sodio dodecil solfato (SDS) in acqua trattata con DEPC. Ruotare il tubo che contiene il gel di splice(s) a 4 ° C per 16 h.
      Nota: Un tasso di recupero tipico è ~ 75% in questo passaggio. Per aumentare il rendimento, rimuovere e raccogliere l'eluente e aggiungere lo stesso volume di tampone di eluizione, quindi ripetere questo passaggio.
    14. Combinare l'eluente in un nuovo tubo di 1,7 mL. Aggiungere 2,5 x ghiacciata EtOH, invertire i tubi sei volte per mescolare il liquido e posizionare le provette a-80 ° C per almeno 1 h.
    15. Centrifugare per 10 min 10.000 x g e a 4 ° C. Rimuovere con cautela il supernatante di pipettaggio. Lavare la pallina del RNA aggiungendo 80% EtOH (1 mL per tubo), vortex per 15 s e centrifugare per 10 min 10.000 x g e a 4 ° C.
    16. Rimuovere il supernatante e asciugare il pellet di RNA per 5 min. aggiungere 50 μL di acqua RNAsi-libera e mescolare pipettando su e giù per 10 volte. Normalizzare la concentrazione di RNA a 0.10 μg/μL. Conservare il RNA purificato-80 ° C.
      Nota: Non asciugare troppo la pallina del RNA.
    17. Facoltativamente, per analizzare la qualità del RNA, diluire 1 μL (100 ng) di RNA da passo 1.1.16 in 5 μL di acqua e mescolare con 5 μL di tampone del campione 2 x TBE-urea. Quindi, calore a 70 ° C per 3 min e carico su un mini-gel di TBE-urea 6%.
      1. Esegua il gel a 180 V per 1 h. eseguire la colorazione come fatto nel passaggio 1.1.11. Visualizzare il gel UV in un sistema di imaging. Una singola banda è previsto alla lunghezza desiderata.
  2. Preparando il 32P-labeled primer
    1. Impostare la reazione mescolando i seguenti materiali: 10 μL di γ -32P-ATP (~1.5 mCi, ~ 25 μM, Vedi Tabella materiali), 2 µ l di primer trascrizione inversa (RT) (100 μM, per vedere sequenza tabella 1), 2 μL della chinasi di polinucleotide 10 x T4 (PNK) tampone di reazione, 1 μL di T4 PNK (Vedi Tabella materiali) e 5 μL di acqua RNAsi-libera. Incubare a 37 ° C per 1 h.
      Attenzione: Un'adeguata protezione è necessità di passaggi 1.2-1.5 in un ambiente di lavoro autorizzato per materiali radioattivi.
    2. Inattivare a caldo per 20 minuti a 65 ° C. Aggiungere i campioni su una colonna dissalazione e centrifugare a 1.000 x g per 1 min. mescolare l'eluente con 25 μL di tampone del campione 2 x TBE-urea. .
      Nota: Conservare il prodotto grezzo con etichettato a-20 ° C se non deve immediatamente essere purificato.
    3. Eseguire un gel di acrilammide 10% a 20 W per 1 h.
      Attenzione: Caricare il 32P-labeled primer dal punto 1.2.1 sul gel ed evitare sanguinamenti la radioattività nel serbatoio superiore. Non caricare più di un terzo dell'altezza del pozzo per assicurare una sottile banda sul gel (se necessario, utilizzare pozzi multipli). Il liquido nel serbatoio inferiore può essere altamente radioattivo.
    4. Rimuovere le lastre di vetro del vassoio del gel e porre il gel su un pezzo di pellicola trasparente. Piegare l'involucro di plastica per coprire la parte superiore del gel per fare un panino tenuta d'aria. Posizionare il sandwich di gel su uno schermo di fosforo tungstato di calcio ed esporre con un strumento di imaging. Immagine del gel nuovo con regolare la luce di sapere dove sono i bordi del gel.
    5. Utilizzare una software di elaborazione immagine per sovrapporre le due immagini. Allineare il gel verso l'immagine stampata. Usare una lama di rasoio fresca per tagliare le bande desiderate fuori il gel. Posizionare 1 o 2 fette del gel in un tubo di 1,7 mL.
      Nota: Assicurarsi che l'immagine stampata ha le stesse dimensioni come il gel effettivo. Ricontrollare l'allineamento da imaging il gel rimanente dopo tagliare la fetta di gel.
    6. Recuperare il primer marcato P 32seguendo la procedura descritta 1.1.13 a 1.1.16. Prendere 1,0 µ l della soluzione in una provetta 0,4 mL e diluire il primer con 1 x TE buffer per ottenere la radioattività di 1,0 µ l a ~ 100.000 cpm. Memorizzare il purificato 32P-labeled primer a-80 ° C fino a reazione di modificazione di RNA 2'-OH, ma per non più di 4 settimane.
  3. Associazione di piccola molecola e la modifica di 2'-OH del RNA
    1. Per preparare quattro campioni, aggiungere 8 pmol RNA in 32 μL di buffer di TE x 0,5 ad un tubo di 1,7 mL, calore a 80 ° C per 2 min e snap-cool sul ghiaccio per almeno 1 min.
      Nota: Utilizzare la seguente equazione per calcolare il peso molecolare approssimativo di RNA: MW = (n # di basi) x 340 Da.
    2. Aggiungere 8 μL di 5x pieghevole mix contenente 500 mM HEPES (pH 8.0), 20 mM MgCl2e 500 mM NaCl. Aliquota 9 µ l della miscela RNA in ciascuno dei quattro PCR tubi e con l'etichetta #1-#4. Aggiungere 1 μL di 10% DMSO nella #1 provetta, 1 μL di soluzione concentrata piccola molecola (10% DMSO) in #2, 1 μL di soluzione diluita piccola molecola (10% DMSO) in #3 e 1 μL di acqua in #4.
    3. Incubare le provette PCR a 37 ° C in un termociclatore per 30 min.
    4. Destra prima la reazione di modificazione di 2'-OH, diluire 1 μL di soluzione di riserva di NAI (2 M) con 3 μL di acqua trattata con DEPC per produrre una soluzione di lavoro di 0,5 M. Senza indugio, aggiungere 1 μL di soluzione di lavoro nelle provette #1, #2 e #3 NAI e 1 μL di 25% DMSO in #4. Incubare a 37 ° C in un termociclatore per 15 min.
    5. Aggiungere 100 μL di eluizione/precipitazioni mescolare (vedere il passaggio 1.1.13 per ricetta), 2 μL di glicogeno (15 mg/mL) e trasferire tutto il liquido in ciascuna provetta PCR in una provetta di 1,7 mL. Aggiungere 0,34 mL di EtOH 200-prova ghiacciata (volume x 3) in ogni provetta. Mix nel Vortex per 5 s e posto i tubi in un congelatore a-80 ° C per almeno 1 h.
      Nota: Durante questo periodo, iniziare ad impostare il gel di sequenziamento per essere utilizzato nel passaggio 1.5.1.
    6. Centrifuga per 15 min a 14.000 x g e a 4 ° C. Rimuovere il sopranatante senza disturbare il pellet di RNA. Lavare la pallina del RNA aggiungendo 80% EtOH (0,5 mL per tubo), vortex per 15 s e centrifugare per 15 min 20.000 x g e a 4 ° C. Rimuovere il surnatante nuovamente.
      Nota: Facoltativamente, è possibile utilizzare un contatore Geiger per garantire il pellet radioattivo mantenendo nel tubo.
    7. Asciugare il pellet di RNA per 5 min aggiungere 9 μL di acqua RNAsi-libera e Miscelare pipettando su e giù per 10 volte.
      Nota: Non asciugare troppo la pallina del RNA. Tutte le precipitazioni dovrebbe essere sciolto alla fine di questo passaggio.
  4. Estensione di primer e preparazione di marcatore
    1. Trasferire il RNA modificato in 4 nuove provette per PCR e con l'etichetta #1-#4 come in precedenza. Aggiungere 2 pmol controllo RNA in 7 μL di acqua trattata con DEPC a 4 tubi PCR aggiuntivi e con l'etichetta #5 – n. 8. Aggiungere 2 µ l di primer radioattivo (punto 1.2.6) in tutte le otto tubi. Calore per ricottura a 65 ° C per 5 minuti, poi raffreddare immediatamente fino a 4 ° C in termociclatore.
    2. Aggiungere 4 μL di RT buffer 5x (Vedi Tabella materiali), 1 μL di ditiotreitolo (DTT, 0.1 M) e 1 μL di miscela del dNTP (10 mM) per ciascuna delle otto provette PCR.
    3. Aggiungere 2 μL di DEPC-trattati H2O a tubi #1 – n. 4. Aggiungere 4 μL di ddATP (5 mM), 4 μL di ddTTP (5 mM) e 4 μL di ddCTP (5 mM) in provette #5 – n. 7, rispettivamente. Aggiungere 1 μL di ddGTP (5 mM) e 3 μL di acqua trattata con DEPC tubo #8. Pipettare quattro volte per mescolare.
    4. Riscaldare a 52 ° C per 1 min in termociclatore. Aggiungere 1 μL della trascrittasi inversa (Vedi Tabella materiali), quindi Miscelare pipettando su e giù per quattro volte. Incubare la reazione a 52 ° C per 20 min.
    5. Aggiungere 1 μL di 5 M NaOH in ciascuna delle provette per idrolizzare il RNA. Riscaldare i tubi a 95 ° C per 5 min.
    6. Aggiungere 5 µ l di 1 M HCl e ripetere la precipitazione dell'etanolo (passaggi 1.3.5 e 1.3.6), salvo omettere il glicogeno e il trasferimento di liquidi.
      Nota: Omettendo il punto 1.4.6 risultati in una regione sfocatura nel mezzo il gel conosciuto come il "sale davanti".
    7. Asciugare il pellet di DNA per 5 min. aggiungere 10 μL di H2O e 10 μL di 2 x TBE-urea campione tampone di caricamento e pipetta su e giù per 10 volte per ridisciogliere. Calore a 70 ° C per 5 min. Posizionare i tubi sul ghiaccio prima di caricamento del gel.
  5. Analisi della pagina
    1. Per preparare un gel di poliacrilammide 8% sequenziamento, seguire passaggi 1.1.6 a 1.1.10 con le seguenti modifiche: utilizzare 100 mL di soluzione al 40% acrilammide/bisacrylamide (29: 1) per preparare una soluzione di acrilammide 8% e lastre di vetro di sequenziamento gel (ad es., 46 x 57 cm) con un distanziatore di 0,4 mm.
    2. Caricare 10 μL di campione dal passaggio 1.4.7. Esegua il gel a 65 W per 2 ore o fino a quando il colorante di fondo raggiunge 3/4 del gel.
      Nota: Memorizzare il resto dei campioni a-80 ° C per ripetere se necessario.
    3. Rimuovere la piastra di vetro siliconato superiore rimuovendo il distanziale e delicatamente inserendo una spatola. Posizionare un pezzo di carta da filtro grande per coprire il gel e premere delicatamente per consentire il gel a rispettare la carta da filtro. A partire dall'estremità inferiore, sollevare la carta da filtro e rimuovere il gel dalla lastra di vetro insieme.
    4. Collocare il gel insieme con la carta da filtro su un pezzo di plastica trasparente che è abbastanza grande per coprire il gel tutto (filtro carta rivolto verso l'alto). Trasferire il panino dell'involucro di plastica/carta da filtro/gel un gel asciuga con la carta da filtro lato rivolto verso il basso.
      Attenzione: Per evitare la contaminazione di materiale radioattivo, utilizzare 3 o 4 più pezzi di grandi dimensioni carta da filtro tra il sandwich di gel e gel più secca.
    5. Asciugare il gel a 70 ° C per 1 h con un vuoto. Trasferire il sandwich di gel su una foto-sbiancato fosforo storage schermo cassetta. Esporre la radioattività del gel sullo schermo per 4 – 16 h.
    6. Posizionare lo schermo del deposito di fosforo su un dispositivo di imaging e scansione con risoluzione media (~ 30 min).
      Nota: Se un artefatto di sorriso-simile è presente nell'immagine di gel, è possibile utilizzare correzione software (ad es., SAFA) per elaborare l'immagine per una qualità pubblicabile. Tenete a mente che la corsia di marcatore standard è 1 nucleotide più lungo le corsie di modifica 2'-OH.

2. forma nelle celle

  1. Disegno dell'iniettore
    Nota: A differenza di forma in vitro, non è necessario progettare una cassetta di espressione nella cella forma. Tuttavia, un set di primer ottimale deve essere utilizzato e deve essere valutato prima forma sperimentare.
    1. Generare almeno tre coppie di primer unico di uno strumento di progettazione basato su BLAST primer (ad es., Primer-BLAST). Per studiare il pre-mRNA in cellule umane, selezionare il genoma umano (non del trascrittoma) come un database di riferimento nei parametri di controllo di Primer coppia specificità. Scegli la dimensione degli ampliconi nel range di 200 – 1.000 coppia di basi (bp).
    2. Estrarre il DNA genomico da ~ 106 celle di interesse con un metodo basato su colonna di spin con il trattamento di RNasi A e proteasi K (Vedi Tabella materiali e utilizzare il protocollo del produttore). Normalizzare il DNA genomico purificato nel buffer di TE 0,1 μg/μL.
    3. Test PCR con il protocollo eseguito ai punti 1.1.1 e 1.1.2.
      Nota: Il set di primer desiderato dovrebbe produrre una singola banda su un gel di agarosio al 1,8%.
  2. Preparazione e aggiornamento di 2'-OH delle cellule
    Nota: Per aumentare l'abbondanza del pre-mRNA di interesse, un minigene con la sequenza corretta sotto promotore del citomegalovirus (CMV) per espressione costitutiva è transfected nelle cellule dell'ospite.
    1. Pre-riscaldare il mezzo di coltura contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1 x miscela antibiotica in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) a 37 ° C. Cellule 293T seme al 50% confluency 24 h prima la transfezione in terreno di coltura. Cambiare il mezzo in 2% FBS in DMEM senza antibiotici ~ 1 h prima la transfezione.
    2. Aggiungere 10 μg di plasmide minigene in 100 μL di media riduttori del siero (Vedi Tabella materiali) in 1 bene di una piastra a 96 pozzetti. Dispensare la soluzione su e giù per quattro volte per mescolare.
    3. Aggiungere 40 μL di reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali) in 100 μL di media riduttori del siero in un altro pozzetto della piastra. Pipettare fino e giù quattro volte per mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    4. Aggiungere la soluzione di intero plasmide alla sospensione di reagente di transfezione. Pipettare fino e giù quattro volte per mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
    5. Aggiungere l'intero DNA / miscela di reagente di transfezione goccia a goccia sulla superficie del mezzo in tutto il piatto. Incubare a 37 ° C per 6 – 12 ore.
    6. Il mezzo di aspirare e lavare delicatamente una volta con 5 mL di tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4, senza CaCl2 e MgCl2, Vedi Tabella materiali). Tripsinizzano le cellule con 3 mL di soluzione di tripsina. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    7. Battere il piatto delicatamente per dissociare le cellule dalla parte inferiore del piatto. Neutralizzare la tripsina con 6 mL di terreno di coltura. Centrifugare a 300 x g per 4 minuti e rimuovere il mezzo.
    8. Risospendere le cellule di6 ~ 10 per ciascun campione in 199 μL del mezzo di reazione (1% FBS in DMEM) e trasferire la sospensione cellulare in una piastra a 96 pozzetti. Incubare le cellule con 1 μL di soluzione di lavoro composto o 1 μL di DMSO in tutti i tre controlli per 30 min a 37 ° C.
      Nota: Tre campioni di controllo dovrebbero essere inclusi: controllo di DMSO con NAI, RNA denaturato con NAI e NAI controllo negativo.
    9. Aggiungere 10 μL di 2m NAI a ciascun campione, ad eccezione del controllo denaturante (DC) RNA e controlli negativi NAI. Pipettare fino e giù quattro volte per mescolare. Incubare a 37 ° C per 15 min. Agitare delicatamente le piastre per risospendere le cellule ogni 5 min.
    10. Trasferire le cellule in provette da 1,7 mL e centrifugare a 400 x g per 2 minuti senza indugio. Rimuovere il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare.
    11. Aggiungere 0,4 mL di tiocianato di guanidinium (Vedi Tabella materiali). Vortex per 15 s per omogeneizzare. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 min.
      Nota: I campioni possono essere conservati a-20 ° C fino a procedere con il passaggio successivo.
  3. Estrazione del RNA
    1. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio a ciascuno dei campioni di omogeneizzato il tiocianato di guanidinium. Vortexare per 15 s. Incubare a temperatura ambiente per 2 min.
    2. Centrifugare per 5 min 12.000 x g e a 4 ° C. Lo strato acquoso incolore superiore contiene RNA. Trasferire ~ 380 μL di soluzione acquosa in una nuova provetta di 1,7 mL.
      Attenzione: Non disturbare l'interfase per evitare contaminazioni.
    3. Aggiungere 1,5 x volume di EtOH (~ 570 μL). Vortex per 15 s a mescolare.
    4. Trasferire 600 μL di miscela di RNA in un isolamento di RNA spin-colonna (Vedi Tabella materiali). Centrifugare a 12.000 x g per 15 s. scartare l'eluente. Ripetere questo passaggio per passare attraverso tutto il liquido nella stessa colonna di spin.
    5. Lavare la colonna con 0,35 mL di tampone RW1 (Vedi Tabella materiali) facendo girare per 15 s. aggiungere 80 μL di dnasi RNAsi-libera ho nel buffer di RDD (Vedi Tabella materiali). Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
      Nota: È fondamentale per rimuovere tutta la contaminazione del DNA.
    6. Successivamente lavare la colonna con 0,35 mL di tampone RW1 e 0,6 mL di buffer di x RPE 2 (Vedi Tabella materiali) di filatura per 15 s ad ogni passo. Asciugare la colonna mediante centrifugazione la colonna di spin con un tubo di raccolta vuota a 12.000 x g per 1 min.
    7. Aggiungere 32 μL di acqua RNAsi-libera al centro della colonna. Incubare per 1 min. Centrifugare a 12.000 x g per 30 s per ottenere ~ 30 μL di soluzione di RNA purificato. Mettere i campioni a-20 ° C durante l'elaborazione del campione denaturato.
  4. Preparazione di controllo RNA denaturato
    1. Campione di RNA posto 30 µ l, per la DC in un tubo di plastica di 1,7 mL sul ghiaccio. Aggiungere 50 μL di formammide e 15 μL di tampone DC contenente 300 mM HEPES (pH 8.0) e 25 mM EDTA nel tubo.
    2. Calore per denaturare il RNA a 95 ° C per 1 min. rapidamente aggiungere 5 μL di soluzione di riserva di NAI (2 M), poi scorri due volte per mescolare e mettere il tubo indietro al blocco riscaldante. Incubare a 95 ° C per un ulteriore 1 min poi immediatamente mettere il tubo sul ghiaccio.
    3. Aggiungere 0,4 mL di tiocianato di guanidinium. Ripetere i passaggi 2.3.1–2.3.4.
    4. Lavare la colonna con 0,6 mL di buffer di x RPE 2 (Vedi Tabella materiali) di filatura per 15 s ad ogni passo. Asciugare la colonna mediante centrifugazione la colonna di spin con un tubo di raccolta vuota a 12.000 x g per 1 min.
    5. Aggiungere 32 μL di acqua RNAsi-libera al centro della colonna. Incubare per 1 min. Centrifugare a 12.000 x g per 30 s per ottenere ~ 30 μL di soluzione di RNA DC recuperati.
  5. Estensione dell'iniettore
    1. Normalizzare la soluzione di RNA da 2.3.7 e 2.4.5 in 0,5 μg/μL con acqua RNAsi-libera. Appena preparare 30mm MnCl2 soluzione da polvere O di MnCl2∙4H2.
    2. Trasferire 9 μL di soluzione di RNA per ciascun campione in una striscia PCR. Aggiungere 1 μL di 10 mM dNTP e 1 μL di iniettore di gene-specific 2 μM (SPG) in ciascun tubo. Pipettare fino e giù quattro volte per mescolare. Incubare a 65 ° C per 5 min in un termociclatore e mettere il ghiaccio per > 1 min.
      Nota: In alternativa, 1 μL di un nonamer casuale può essere utilizzato in sostituzione del SPG.
    3. In ciascuna provetta PCR, aggiungere una miscela di 2 μL di tampone di RT 10x (Vedi Tabella materiali), 4 μL di 30mm MnCl2e 2 μL di 100 mM DTT. Pipettare su e giù 4 x a mescolare. Incubare a 42 ° C per 2 min.
    4. Aggiungere 1 μL della trascrittasi inversa (Vedi Tabella materiali). Pipettare su e giù 4 x a mescolare. Incubare a 42 ° C in un termociclatore per 3 h.
  6. Preparazione di biblioteca e sequenziamento di nuova generazione
    1. Impostare una reazione di PCR aggiungendo 1 μL di DNA polimerasi, 5 μL di tampone di DNA polimerasi 10x (Vedi Tabella materiali), 2 μL di DMSO, 1.5 μL per ciascuno dei primer (10 μM), 34 μL di H2O e 5 μL di cDNA dal punto 2.5.4.
    2. Impostare il termociclatore come segue: fase 1) 95 ° C per 2 min; fase 2) 95 ° C per 30 s; fase 3) 60 ° C per 30 s; fase 4) 68 ° C per 30 s; ciclo di fase 5) torna alla fase 2 per 30 cicli; fase 6) 68 ° C per 3 min; e fase 7) infinito che tiene a 4 ° C fino al passaggio seguente.
    3. Purificare l'amplicone utilizzando gel di agarosio al 1,8%.
      Nota: La band PCR dovrebbe essere visualizzato come una singola banda sul gel.
    4. Costruire la libreria utilizzando frammentazione standard e i metodi di legatura stabiliti nella letteratura6,26.
    5. Sequenza di un'apparecchiatura di sequenziamento di nuova generazione utilizzando 1x75 monolato letture per generare circa 10 milioni legge per campione.
    6. Analizzare i risultati utilizzando ShapeMapper e SuperFold software pacchetti sviluppati da settimane gruppo26.

Risultati

Precedentemente abbiamo dimostrato che un RNA splicing modulatore, SMN-C2, interagisce con motivo AGGAAG sull'esone 7 del pre-mRNA del gene SMN2 e utilizzato forma di valutare i cambiamenti strutturali di RNA in presenza di SMN-C26. Il sito di legame di SMN-C2 è distinto dall'approvato dalla FDA oligonucleotide antisenso (ASO) per la SMA, nusinersen, che si lega e blocca il silenziatore d'impionbatura intronic (ISS) il introne 727,

Discussione

In forma in vitro, è fondamentale utilizzare modello RNA omogeneo di alta qualità. Trascrizione di T7, tuttavia, spesso produce sequenze eterogenee36. Soprattutto, sequenze con ± 1 nucleotidi al 3'-terminale con rendimenti non trascurabile36 sono solitamente difficili da rimuovere dalla purificazione del gel di poliacrilammide. Modello di RNA eterogeneo può causare più di un set del segnale del sequenziamento gel profilo del prodotto primer extension, che a volte rende...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato reso possibile dalla concessione NIH R01 (NS094721, K.A.J.).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
DNA oligonucleotideIDTgBlock for > 200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master MixThermo FisherF566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kitTakara740609.50
MegaScript T7 transcription kitThermo FisherAM1333Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated waterThermo Fisher750023
2X TBE-urea sample bufferThermo FisherLC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)Bio-Rad1610146
10X TBE bufferThermo Fisher15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter UnitThermo Fisher166-0045
KimwipeKimberly-Clark34133
TEMEDThermo Fisher17919
SYBR-Safe dyeThermo FisherS33102
6 % TBE-urea mini-gelThermo FisherEC6865BOX
ChemiDocBio-Rad
T4 PNKNEBM0201S
γ-32P-ATPPerkin ElmerNEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying ScreenGE HealthcareRPN1669calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screenMolecular DynamicsBAS-IP MS 3543 E
Amersham TyphoonGE Healthcare
NAI (2M)EMD Millipore03-310
GlycoBlueThermo FisherAM9515
SuperScript IV Reverse TranscriptaseThermo Fisher18090010Contains 5X RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM)Thermo FisherR0192
ddNTP set (5mM)SigmaGE27-2045-01
large filter paperWhatman1001-917
Gel dryerHoeferGD 2000
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51104Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34Addgene72287
Heat inactivated FBSThermo Fisher10438026
Pen-StrepThermo Fisher15140122
Opti-MEM IThermo Fisher31985062
FuGene HDPromegaE2311
TrpLEThermo Fisher12605010
DPBS without Ca/ MgThermo Fisher14190250
TRIzolThermo Fisher15596018
RNeasy mini columnQiagen74104Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase SetQiagen79254Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamideThermo FisherAM9342
MnCl2•4H2OSigma-AldrichM3634
random nonamerSigma-AldrichR7647
SuperScript First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher11904-018Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerseThermo Fisher12344024
NextSeq500Illumina
NucAway columnThermo FisherAM10070for desalting purpose

Riferimenti

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