Un metodo di cromatografia a gas pirolisi a due fasi con rilevamento spettrometrico di massa per l'identificazione di ingredienti di inchiostro del tatuaggio e prodotti contraffatti

Riepilogo

Questo metodo per la pirolisi in due fasi online accoppiato alla gascromatografia con rilevamento spettrometrico di massa e protocollo di valutazione dei dati può essere utilizzato per l'analisi multicomponente degli inchiostri per tatuaggi e la discriminazione dei prodotti contraffatti.

Abstract

Gli inchiostri per tatuaggi sono miscele complesse di ingredienti. Ognuno di essi possiede diverse proprietà chimiche che devono essere affrontate su analisi chimiche. In questo metodo per la pirolisi in due fasi in linea accoppiato alla spettrometria di massa gascromatografia (Py-GC-MS) composti volatili vengono analizzati durante una prima corsa di desorbimento. Nella seconda corsa, lo stesso campione essiccato viene pirolizzato per l'analisi di composti non volatili come pigmenti e polimeri. Questi possono essere identificati dai loro modelli di decomposizione specifici. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per differenziare l'originale da inchiostri contraffatti. Per accelerare l'identificazione della sostanza vengono applicati semplici metodi di screening per la valutazione dei dati utilizzando gli spettri di massa medi e le librerie di pirolisi autofatte. Utilizzando un software di valutazione specializzato per i dati di pirolisi GS-MS, è possibile ottenere un confronto rapido e affidabile del cromatogramma completo. Poiché GC-MS è usato come tecnica di separazione, il metodo è limitato alle sostanze volatili al momento del desorbimento e dopo la pirolisi del campione. Il metodo può essere applicato per lo screening rapido delle sostanze nelle indagini di controllo del mercato poiché non richiede fasi di preparazione dei campioni.

Introduzione

Gli inchiostri per tatuaggi sono miscele complesse costituite da pigmenti, solventi, leganti, tensioattivi, addensanti e, a volte, conservanti¹. L'accresciuta popolarità dei tatuaggi negli ultimi decenni ha portato alla creazione di una legislazione che affronti la sicurezza dell'inchiostro del tatuaggio in tutta Europa. Nella maggior parte dei casi, i pigmenti che danno colore e le loro impurità sono limitati e quindi devono essere monitorati da indagini di mercato di laboratorio statale per controllare la loro conformità con la legge.

Utilizzando l'approccio della spettrometria di massa di pirolisi-gas-cromatografia in linea (Py-GC-MS) descritta qui, più ingredienti possono essere identificati simultaneamente. Poiché i composti volatili, semi-volatili e non volatili possono essere separati e analizzati all'interno dello stesso processo, la varietà di composti bersaglio è alta rispetto ad altri metodi utilizzati per l'analisi dell'inchiostro del tatuaggio. I metodi di cromatografia liquida sono per lo più eseguiti con pigmenti solubilizzati in solventi organici². La spettroscopia Raman e la spettroscopia a infrarossi a trasformazione di Fourier (FT-IR) sono state descritte come strumenti idonei per l'identificazione di pigmenti e polimeri, ma sono limitate con miscele multi-ingrediente, poiché nessuna tecnica di separazione viene utilizzata in standard applicazioni di laboratorio^3,4. La spettrometria di massa a tempo di volo di desorbimento/ionizzazione laser (LDI-TOF-MS) è stata utilizzata anche per l'identificazione dei pigmenti e dei polimeri^5,6. Complessivamente, la maggior parte dei metodi mancano l'analisi dei composti volatili. La mancanza di librerie spettrali commerciali adatte è uno svantaggio comune di tutti questi metodi. L'identificazione dei pigmenti inorganici è stata spesso effettuata con spettrometria di massa al plasma accoppiata induttivamente (ICP-MS)^7,8 o spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDX)^4,9. Inoltre, la spettroscopia FT-IR e Raman sono state utilizzate per l'analisi di pigmenti inorganici come biossido di titanio o ossidi di ferro in altri campi di ricerca^10,11,12,13.

L'obiettivo di questo studio era quello di stabilire un metodo applicabile nei laboratori analitici standard con costi finanziari moderati per aggiornare i dispositivi esistenti e comuni. Py-GC-MS come descritto qui è un approccio non quantitativo per l'identificazione di ingredienti organici da miscele. Dopo l'identificazione di sostanze sospette in uno screening Py-GC-MS, le sostanze bersaglio possono essere quantificate con approcci più specializzati. È particolarmente interessante per l'analisi di sostanze non volatili e non solubili come pigmenti e polimeri.

Il metodo descritto può essere adattato per inchiostri e vernici in altri campi di applicazione. I metodi di valutazione dei dati descritti sono applicabili a tutte le indagini di pirolisi. Inoltre, i prodotti contraffatti, per lo più dai mercati asiatici, mostrano una potenziale fonte di rischio per il consumatore e un onere finanziario per i costruttori (comunicazione personale al 3 ° ECTP a Regensburg, germania, 2017). Il metodo descritto qui può essere utilizzato per confrontare le caratteristiche di inchiostri contraffatti putativo a una bottiglia originale, simile a approcci forensi pubblicati per l'identificazione di vernice auto¹⁴.

Protocollo

1. preparazione dell'inchiostro del tatuaggio e montaggio del campione

1. Utilizzare un tubo di pirolisi in vetro cavo da 25 mm come supporto campione e lana di quarzo per la preparazione del campione.
   1. Afferrare il tubo di pirolisi con le pinzette specializzate per tubi di pirolisi (cuocere per la decontaminazione) e inserire la quantità necessaria di lana di quarzo con pinzette appuntite nel tubo.
   2. Inserire due bastoncini di acciaio (cuocere per la decontaminazione) su ciascun lato del tubo di pirolisi e comprimere la lana in un tappo di spessore di 1 – 2 mm. Il tappo deve essere posizionato al terzo inferiore del tubo di pirolisi per ottenere un riscaldamento adeguato durante il processo di pirolisi.
   3. Accendere un bruciatore a gas e cuocere il tubo di pirolisi e riempire per 2 – 3 s da ogni lato per rimuovere i contaminanti.
      Nota: utilizzare guanti puliti e non toccare alcun elemento prima di maneggiare il tubo di pirolisi e la lana. Utilizzare la protezione per gli occhi e rimuovere tutti i liquidi e gli oggetti infiammabili durante la cottura del tubo di pirolisi. Il protocollo può essere fermato qui. Conservare i tubi di pirolisi preparati in un piatto di vetro pulito fino a nuovo uso.
2. Agitare le bottiglie di inchiostro del tatuaggio vigorosamente per 1 minuto a mano per garantire omogeneità. Inoltre, possono essere collocati in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 1 min. Alcuni inchiostri possono ancora mostrare pigmenti sedimentati dopo aver condotto entrambe le fasi e possono avere bisogno di omogeneizzazione prolungata.
3. Ottenere un microcapillare da 2 μL con un diametro inferiore al diametro interno del tubo di pirolisi. Immergere la punta capillare nell'inchiostro e aspirare circa 1 μL di inchiostro riempiendo la metà del capillare.
4. Inserire il capillare nel tubo di pirolisi e macchiare il tappo di lana di quarzo con l'inchiostro. Una colorazione chiara del colore deve essere visibile senza aggiungere troppa inchiostro al campione.
5. Ottenere un adattatore di trasporto in acciaio per l'unità di iniezione automatizzata e attaccare il tubo di pirolisi preparata ad esso utilizzando pinzette per tubi di pirolisi.
   1. Controllare che il tubo di pirolisi sia perfettamente verticale e non cada durante l'agitazione.
   2. Posizionare l'adattatore di trasporto nel cassetto nella posizione desiderata.
      Nota: l'inchiostro potrebbe contaminare l'adattatore di trasporto in acciaio a cui è attaccato il tubo di pirolisi; Pertanto, questo richiede una pulizia più accurata in seguito.

2. analisi dei campioni di inchiostro da parte di Py-GC-MS

1. Impostare il sistema GC-MS equipaggiato con un'unità di desorbimento termico (TDU) e un modulo pirolizer sulla parte superiore del sistema di iniezione a freddo (CIS) secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare una fonte di ioni di impatto di elettroni inerti (EI) a 70 eV ed elio con una purezza di 99,999% come gas vettore (1 mL/min). Impostare il rapporto di divisione del CIS a 1:50.
2. Installare una colonna HP-5MS e una colonna di protezione per la separazione. Impostare i seguenti parametri di analisi nel software di controllo degli strumenti: avviare la temperatura del forno a 50 ° c, tenere premuto per 2 minuti e rampa a 10 ° c/min a 320 ° c. Tenere la temperatura finale per ulteriori 5 min. impostare le temperature della linea di trasferimento a 320 ° c.
3. Eseguire ogni campione in una modalità di sfiato del solvente senza pirolisi per analizzare i composti semi-volatili.
   1. Utilizzare l'opzione di sfiato del solvente del TDU/iniettore e rampa la temperatura TDU dopo 0,5 min a partire da 50 ° c a 90 ° c ad una velocità di 100 ° c/min. Lo sfiato del solvente sarà spento dopo 1,9 minuti.
   2. Riscaldare la temperatura del TDU a 320 ° c a una velocità di 720 ° c/min per 3,5 min. I composti volatili vengono catturati nel CIS a-150 ° c.
   3. Tenere la temperatura CIS per 2 min e la rampa a 320 ° c a una velocità di 12 ° c/min.
      Nota: il tempo prolungato tra la preparazione del campione e l'analisi porta all'evaporazione dei composti volatili poiché il supporto del campione è aperto. Analizzare i campioni entro poche ore dopo la preparazione se i composti volatili sono presi di mira.
4. Condurre una seconda esecuzione dello stesso campione in cui l'unità di pirolisi viene utilizzata per indagare su composti non volatili.
   1. Utilizzare lo stesso programma del forno per la prima esecuzione di desorbimento.
   2. Mantenere la temperatura della costante CIS a 320 ° c e utilizzare un rapporto di divisione di 1:100.
   3. Rampa la TDU direttamente da 50 ° c a 320 ° c a una velocità di 720 ° c/min e mantenere costante per 1,6 min.
   4. Programmare una pirolisi di 6 s alla temperatura desiderata (qui 800 ° c) nel segmento di temperatura finale del TDU.
      Nota: assicurarsi di utilizzare una quantità adeguata di campione e il rapporto di divisione per evitare la contaminazione della colonna e MS. adattare i rapporti di suddivisione per i singoli set-up degli strumenti, se necessario.
5. Utilizzare uno standard di polistirolo per controllare le prestazioni dello strumento. Eseguire almeno tre campioni di polistirene prima e dopo ogni esperimento. Inserire 2 μL di uno standard di polistirene 4 mg/mL in diclorometano nella lana di vetro ed eseguire una pirolisi a 500 ° c per 0,33 min.
6. Controllare se il rapporto dell'area di picco del monomero di polistirolo e del dimero è compreso tra 3 e 4 e la coda del dimero è inferiore a 2 nel cromatogramma risultante (chiamato anche pirogramma). Mantenere i dati storici dei parametri di polistirene e calibrare la temperatura di pirolisi se il rapporto di picco è fuori portata.
   Nota: i valori per il rapporto di polistirolo e di dimero, così come il tailing, devono essere presi dai valori storici dei sistemi operativi ben.

3. approcci di valutazione dei dati

Nota: la valutazione dei dati deve essere adattata a seconda delle singole domande analitiche, ad esempio la ricerca di sostanze volatili, composti non volatili, prodotti di scissione pericolosi da pigmenti azoici o simili.

1. Valutazione dei dati per composti volatili
   1. Per la valutazione dei dati dei composti volatili, avviare il software di ricerca della libreria GC-MS Analysis/MS (vedere la tabella dei materiali) e aprire il cromatogramma della corsa di desorbimento.
   2. Selezionare le librerie commerciali facendo clic su spettro e selezionare libreria. Caricare la libreria di interesse.
   3. Selezionare i parametri di integrazione ed eseguire una ricerca libreria facendo clic su spettro e rapporto di ricerca libreria.
      Nota: prestare particolare attenzione a confrontare spettri di libreria di composti putativi identificati con gli spettri ottenuti nell'analisi dell'inchiostro. A volte le buone corrispondenze possono essere raggiunte nonostante la presenza di ulteriori picchi di massa molecolare negli spettri sconosciuti. Per un'identificazione inequivocabile, gli standard analitici devono essere analizzati utilizzando i parametri di configurazione e strumento per verificare i tempi di ritenzione e gli spettri.
2. Screening rapido per composti non volatili
   Nota: l'identificazione di composti non volatili dalla pirolisi si basa sulla presenza di più prodotti di decomposizione specifici del composto principale all'interno dello stesso pirogramma. Poiché i Pirogrammi possono contenere fino a diverse centinaia di composti, la valutazione manuale è difficilmente realizzabile. Inizia con un rapido approccio di valutazione dei dati utilizzando gli spettri di massa medi (AMS). Questo è utile per l'identificazione del pigmento più abbondante o polimero all'interno del campione. Questo approccio è adatto solo per lo screening rapido per la frode dichiarazione di inchiostro e per avere un punto di partenza per la valutazione manuale pirogramma.
   1. Per la valutazione dei dati di pirolisi, contrassegnare l'intero cromatogramma nel software di valutazione GC-MS (vedere la tabella dei materiali) con il tasto destro del mouse premuto per ottenere un AMS.
   2. Creare una libreria di spettri ottenuti di sostanze di riferimento conosciute di tutti i composti di interesse, ad esempio pigmenti e polimeri, facendo clic su spettro e modifica libreria (fare clic su Crea nuova libreria se non è presente).
   3. Selezionare Aggiungi nuova voce e compilare tutte le informazioni di interesse.
      Nota: selezionare gli spettri AMS di standard o inchiostri e fare clic su Spectrum e NIST Search se si desidera inoltrare a un altro software in grado di eseguire ricerche nella libreria ms.
   4. Generare un AMS del pirogramma inchiostro indagato e utilizzare la ricerca della libreria per il confronto con la libreria AMS autofatta¹⁵. Escludere le masse dal sanguinamento della colonna o da altri rumori di colonna.
      Nota: la corrispondenza più alta nell'elenco di ricerca della libreria sarà probabilmente il più abbondante pigmento o polimero negli inchiostri. Per verificarlo, confrontare i singoli prodotti di decomposizione caratteristici della sostanza osservati nella pirolisi della sostanza standard nel pirogramma dell'inchiostro analizzato (vedere paragrafo 3,4 e tabella complementare 1).
3. Identificazione di composti non volatili con software di valutazione pirogramma specializzato
   1. Converti i Pirogrammi di interesse nel formato necessario come indicato nelle istruzioni del software. Integrare il pirogramma in modo che si trovano un massimo di 200 composti. In caso contrario, il tempo di valutazione dei dati nel sofware di valutazione pirogramma aumenta significativamente.
   2. Costruire una cartella sul computer con tutte le voci pirogrammi che dovrebbero servire come una libreria, ad esempio, pigmento pirogramma biblioteca per l'identificazione del pigmento o pirogrammi di un inchiostro originale per confrontarlo con prodotti contraffatti putativo.
   3. Caricare il pirogramma sconosciuto nella libreria di schede di ricerca facendo clic su Sfoglia.
   4. Caricare la cartella della libreria e selezionare solo MS matching e RT matching nelle Opzioni di ricerca, poiché l'abbondanza complessiva varierà rispetto al pirogramma di pigmenti di riferimento.
   5. Fare clic su Avanzate nelle opzioni di ricerca. Selezionare il parametro "utilizzare solo picchi con gli spettri MS specificati" e utilizzare una soglia di adattamento di 850 nel software di valutazione pirogramma.
   6. Fare clic su Aggiungi per salvare gli spettri MS specificati (3 – 5 spettri MS dei picchi più abbondanti) da ogni pirogramma di pigmenti di riferimento o polimeri della libreria nelle opzioni di ricerca avanzata (cfr. tabella complementare 1). In questo modo solo i picchi correlati al pigmento vengono confrontati anche in un inchiostro multicomponente con picchi ad alta abbondanza altrimenti interferenti.
   7. Premere OK per tornare alla finestra principale.
   8. Fare clic su Cerca per avviare il confronto.
   9. Se necessario, andare alla scheda corrispondenza cromatogramma , selezionare un composto e fare clic su Invia a NIST per inoltrare gli spettri al software della libreria MS e identificare il composto.
      Nota: fare clic su Opzioni Invia a MS per includere gli spettri nelle Opzioni di ricerca avanzata (cf. Step 3.3.6).
4. Identificazione manuale delle sostanze
   Nota: se non è disponibile alcun software di valutazione pirogramma specializzata utilizzare la valutazione dei dati da parte del programma di ricerca libreria MS standard e biblioteca commerciale insieme con frammenti segnalati (tabella complementare 1) e la nostra libreria di pirolisi¹⁵. Il confronto manuale dei composti pirogrammi con prodotti di decomposizione conosciuti viene anche effettuato per verificare i colpi forniti nell'AMS.
   1. Per la valutazione dei dati per i composti non volatili, avviare il software di ricerca della libreria GC-MS Analysis/MS e aprire il cromatogramma della corsa di pirolisi.
   2. Seleziona le librerie di pirolisi commerciali e (auto-fatte) (ad esempio, la nostra libreria di pirolisi fornita¹⁵) facendo clic su spettro e Seleziona libreria. Caricare tutte le librerie di interesse.
   3. Integrare il pirogramma nel software di valutazione GC-MS e considerare tutti i picchi con un'area ≥ 0,2% della superficie totale (può essere adattato in modo che una quantità gestibile di picchi sarà integrato).
   4. Avviare la ricerca della libreria facendo clic su spettro e rapporto di ricerca della libreria.
   5. Confrontare manualmente tutte le corrispondenze di libreria con specifici prodotti di decomposizione dei pigmenti e dei polimeri nella tabella 1 supplementare o nei frammenti riportati nella letteratura^{16,17,18, 19} anni di ^{, 20} il ^{, 21} anni di ^{, 22} anni di ^, il ^{23 , 24} il ^{, 25} il ^{, 26}. per i pigmenti, sono necessari da 2 a 3 prodotti di decomposizione per identificare senza ambiguità il pigmento utilizzato.
      Nota: tutte le corrispondenze spettrali con le librerie corrispondenti devono essere valutate attentamente. Picchi aggiuntivi superiori al picco di massa spesso rappresentano strutture simili con gruppi laterali aggiuntivi. Se possibile, le sostanze di riferimento devono essere analizzate per ottenere il tempo di ritenzione individuale nell'impostazione analitica.

Risultati

Il metodo include un approccio cromatografico in due fasi per ogni campione (Figura 1). Nella prima corsa, il campione viene essiccato all'interno del sistema iniettore a 90 ° c prima che i composti volatili vengano trasferiti sulla colonna. Poiché il processo di essiccazione è incompleto nella maggior parte dei casi, i solventi residui e i composti volatili vengono trasferiti e analizzati. Nella seconda corsa, il campione precedentemente essiccato viene s...

Discussione

Py-GC-MS è un metodo di screening utile per un'ampia gamma di sostanze negli inchiostri per tatuaggi che possono essere utilizzati anche per l'analisi di altri prodotti. Rispetto ad altri metodi, Py-GC-MS può essere condotto con una preparazione minima del campione. I dispositivi GC-MS si trovano nella maggior parte dei laboratori analitici rispetto ai metodi più specializzati come MALDI-ToF-MS e EDX.

La valutazione dei dati dei pirogrammi può essere impegnativa, poiché l'elenco dei possi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
99.999% Helium carrier gas	Air Liquide, Düsseldorf, Germany	-
5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detectors	Agilent Technologies, Waldbronn, Germany	-
7890A gas chromatograph	Agilent Technologies, Waldbronn, Germany	-
AMDIS software (Version 2.7)	The National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD, USA	-	can be used for GC/MS peak integration, e.g. for transfer to pyrogram evaluation software
Cold Injection System (CIS)	Gerstel, Mühlheim, Germany	-
electron impact (EI) source	Agilent Technologies, Waldbronn, Germany	-
Enhanced ChemStation (E02.02.1431)	Agilent Technologies, Waldbronn, Germany	-	used to generate Average Mass Spektra (AMS), can be used for peak integration and standard GC/MS library search
J&W HP-5MS GC Column, 30 m, 0.25 mm, 0.25 µm, 5975T Column Toroid Assembly	Agilent Technologies, Waldbronn, Germany	29091S-433LTM
MassHunter Software	Agilent Technologies, Waldbronn, Germany	-	no Version specified, can be used for GC/MS peak integration and standard GC/MS library search
Microcapillary tube Drummond Microcaps, volume 2 µL	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P1549-1PAK
MS ChromSearch (Version 4.0.0.11)	Axel Semrau GmbH & Co. KG, Sprockhövel, Germany	-	specialized pyrogram evaluation software
NIST MS Search Program (MS Search version 2.0g)	The National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD, USA	-	used for MS and AMS library generation and corresponding substance search with selfmade and commercial libraries
NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library (EI) mainlib & replib (Data version: NIST v11)	The National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD, USA	-	used commercial mass spectral library
Polystyrene (average Mw ~192,000)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	430102-1KG
Pyrolysis tubes, tube type - quartz glass - lenght 25 mm; 100 Units	Gerstel, Mühlheim, Germany	018131-100-00
Pyrolyzer Module for TDU	Gerstel, Mühlheim, Germany	-
Quartz wool	Gerstel, Mühlheim, Germany	009970-076-00
Steel sticks	Gerstel, Mühlheim, Germany	-
Thermal Desorption Unit (TDU 2)	Gerstel, Mühlheim, Germany	-
Transport adapter	Gerstel, Mühlheim, Germany	018276-010-00
Tweezers for Pyrolysis tubes	Gerstel, Mühlheim, Germany	009970-074-00
Zebron Z-Guard Hi-Temp Guard Column, GC Cap. Column 10 m x 0.25 mm, Ea	Phenomenex Ltd. Deutschland, Aschaffenburg, Germany	7CG-G000-00-GH0