Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Riepilogo

Questo protocollo è progettato per l'imaging e l'analisi delle dinamiche dell'orientamento cellulare e della crescita dei tessuti nell'epitelio addominale della Drosophila mentre la mosca della frutta subisce la metamorfosi. La metodologia qui descritta può essere applicata allo studio di diverse fasi di sviluppo, tessuti e strutture subcellulari nella Drosophila o in altri organismi modello.

Abstract

All'interno di organismi multicellulari, tessuti e organi maturi mostrano alti gradi di ordine nelle disposizioni spaziali delle loro cellule costituenti. Un esempio notevole è dato da epiteli sensoriali, dove cellule della stessa identità o identità distinte sono riunite attraverso l'adesione delle cellule cellulari che mostra modelli planari altamente organizzati. Le celle si allineano l'una all'altra nella stessa direzione e mostrano polarità equivalente su grandi distanze. Questa organizzazione dell'epitelia matura è stabilita nel corso della morfogenesi. Per capire come si ottiene la disposizione planare dell'epitelio maturo, è fondamentale monitorare l'orientamento cellulare e le dinamiche di crescita con alta fedeltà spatiotemporale durante lo sviluppo in vivo. Strumenti analitici robusti sono inoltre essenziali per identificare e caratterizzare le transizioni da locale a globale. La pupa della Drosophila è un sistema ideale per valutare i cambiamenti di forma cellulare orientata alla base della morfogenesi epiteliale. L'epitelio pupali in via di sviluppo costituisce la superficie esterna del corpo immobile, consentendo l'imaging a lungo termine di animali intatti. Il protocollo qui descritto è progettato per immaginare e analizzare i comportamenti cellulari sia a livello globale che locale nell'epidermide addominale pupale man mano che cresce. La metodologia descritta può essere facilmente adattata all'imaging di comportamenti cellulari in altri stadi dello sviluppo, tessuti, strutture subcellulari o organismi modello.

Introduzione

Per ottenere i loro ruoli, i tessuti epiteliali si basano completamente sull'organizzazione spaziale dei loro componenti cellulari. Nella maggior parte degli epiteli, le cellule non solo sono imballate l'una contro l'altra per creare un preciso strato di ciottoli, ma si orientano rispetto agli assi del corpo.

L'importanza funzionale dell'organizzazione precisa dei tessuti è evidente negli epitelia sensoriali, come l'orecchio interno vertebrato e la retina. Nel primo caso, i capelli e le cellule di supporto si allineano in una direzione assiale specifica per rilevare in modo efficiente gli ingressi meccanici come il suono e il movimento^1,2. Allo stesso modo, l'organizzazione spaziale delle cellule fotorecettori è essenziale per ottenere proprietà ottiche ottimali dalla retina³. Il controllo spaziale della posizione e dell'orientamento cellulare è quindi di particolare rilevanza per una corretta funzione fisiologica.

La drosophila è un insetto olometabolo che subisce una completa trasformazione delle sue strutture del corpo larvale attraverso la metamorfosi, dando origine ai suoi tessuti adulti. La pupa della Drosophila è un modello eccellente per l'imaging dal vivo non invasivo di una varietà di eventi dinamici, tra cui migrazione cellulare dello sviluppo⁴, divisione cellulare e dinamica di crescita⁵, contrazione muscolare⁶, morte cellulare⁷, riparazione della ferita⁸e orientamento cellulare⁹. Nell'adulto Drosophila, l'epitelio esterno mostra un alto grado di ordine. Questo è facilmente osservabile sulle disposizioni dei tricomi (cioè le sporche cellulari provenienti da singole cellule epiteliali) e le setole sensoriali su tutta la superficie corporea della mosca¹⁰. Infatti, i tricomi sono allineati in file parallele che guidano il flusso d'aria¹¹. La morfogenesi dell'epitelia adulta e la disposizione ordinata delle singole cellule inizia durante l'embriogenesi e culmina durante le fasi puupali. Mentre negli embrioni divisioni cellulari, interlezioni e cambiamenti di forma diminuiscono tutti l'ordine dei tessuti^12,13, questo viene ripristinato nelle fasi successive dello sviluppo, soprattutto nelle fasi pupali, quando la mosca si avvicina alla maturità⁹.

La pupa di Drosophila immobile fornisce un sistema ideale per valutare i cambiamenti di forma e orientamento delle cellule. L'epidermide addominale pupa presenta vantaggi speciali. Mentre i precursori della testa adulta, del torace, dei genitali e delle appendici crescono e si modellano da stadi larve, gli istoblasti, che sono integrati nell'epidermide larvale, iniziano a crescere e differenziarsi solo a pupariation¹⁴. Questa caratteristica consente il monitoraggio di tutti gli eventi spatiotemporali coinvolti nella creazione di ordine tissutale nella sua interezza⁹.

Gli istoblasti sono specificati durante lo sviluppo embrionale in posizioni contralaterali in ogni segmento addominale presuntivo. L'epidermide addominale dorsale dell'adulto deriva da nidi di istoblasto dorsolaterale presenti nei compartimenti anteriori e posteriori^15,16. Mentre gli istoblasti si espandono, sostituendo le cellule epiteliali larve (LEC), i nidi contralaterali si fondono alla linea mediana dorsale formando un foglio confluente^17,18,19^,20.²⁰

Questo lavoro descrive 1) una metodologia per la dissezione, il montaggio e l'imaging dal vivo a lungo termine delle pupe della Drosophila, e 2) metodi analitici per studiare le dinamiche dell'orientamento cellulare e della crescita ad alta risoluzione spatiotemporale. Qui viene fornito un protocollo dettagliato che copre tutti i passaggi necessari dalla preparazione iniziale delle pupe (ad esempio, la messa in scena e l'imaging) all'estrazione e quantificazione delle caratteristiche di direzionalità e orientamento. Descriviamo anche come dedurre le proprietà dei tessuti locali dall'analisi dei cloni cellulari. Tutti i passaggi descritti sono minimamente invasivi e consentono analisi dal vivo a lungo termine. I metodi qui descritti possono essere facilmente adattati e applicati ad altri stadi di sviluppo, tessuti o organismi modello.

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Protocollo

NOTA: Questo protocollo è suddiviso in cinque fasi: (1) mettere in scena le pupe, (2) preparare le pupe per l'imaging, (3) l'imaging live della crescita dell'epitelio addominale in crescita, (4) generazione di mosaici genetici, (5) elaborazione e analisi dei dati (comprese le sezioni che descrivono come analizzare la dinamica dell'orientamento cellulare dai contorni di giunzione cellulare e dalla dinamica di crescita dei cloni cellulari).

1. Staging delle pupe di Drosophila prima dell'imaging

1. Mosche di coltura del genotipo appropriato su supporto standard in fiale di plastica a 25 gradi centigradi per 5 giorni (12 h) dopo la deposizione delle uova (AEL).
   NOTA: La metamorfosi inizia entro il confinamento delle larve della terza stella nel caso pupalo a 120 h AEL fino a 0 h dopo la formazione del puparium (APF). Questa transizione è facilmente identificabile, perché le larve smettono di nutrirsi e muoversi e la regione opercolare si forma (Figura 1A) a 0-12 h APF. Il pupario è inizialmente morbido e bianco, ma progressivamente indurisce e abbronza.
2. Trasferire prepupae bianche (0 h APF) in una fiala di plastica fresca utilizzando un pennello inumidito. Gli animali possono essere tenuti a temperature diverse a seconda dell'esperimento progettato fino all'età desiderata.
   NOTA: La formazione di pupa (cioè la pupazione) avviene a 12 h APF, quando la testa e le appendici della mosca adulta sono totalmente everse (Figura 1A). A questo punto il caso pupa è completamente separato dalla pupa, consentendone la rimozione completa (Figura 1A).

2. Preparazione pupe per l'imaging dal vivo

NOTA: dopo la messa in scena, le pupe vengono sezionate e montate come descritto di seguito (vedere anche la Figura 1).

1. Rimuovere le pupe in scena dalla parete della fiala con l'aiuto delle pinze.
2. Incollare il lato ventrale di ogni pupa su uno scivolo di vetro coperto con nastro adesivo a due lati. Toccare delicatamente gli spiracoli di testa (cioè la regione opercolare) e la superficie dorsale della pupa con le punte delle pinze per assicurare l'adesione della custodia pupale al nastro (Figura 1A, B).
   NOTA: La superficie dorsale deve affrontare per facilitare la dissezione della cassa e il recupero della pupa.
3. Iniziare la dissezione sotto uno stereomicroscopio rimuovendo delicatamente l'opercolo dal pupario con le pinze (Figura 1C).
4. Inserire una punta delle pinze in un angolo superficiale tra la custodia pupeali e la superficie della pupa attraverso l'apertura opercolare. Strappare lateralmente il caso dalla testa alla coda in una o più oscillazioni, evitando di pizzicare la pupa (Figura 1D). Ripiegare la custodia pupa incrinata ai lati laterali mentre si continua a procedere verso l'estremità posteriore (Figura 1E).
   NOTA: La custodia pupal è abbastanza rigida e si rompe facilmente. In caso di elevata umidità o in particolare sfondi genotici, la custodia della pupali diventa più morbida e lo strappo è più difficile. In questi casi, la fessurazione del caso della pupal può essere aiutata pungendo i suoi bordi liberi con entrambe le punte delle pinze.
5. Rimuovere la pupa dalla custodia della pupa aperta inserendo con attenzione le pinze sotto l'animale e tirando delicatamente verso l'alto (Figura 1F). La pupa si attaccherà alla punta delle pinze (Figura 1G-H).
6. Trasferire la pupa con l'aiuto delle pinze in un piatto con fondo di vetro e depositarla sopra una piccola goccia di olio di alocarbonio permeabile a gas (Figura 1I). Tenere la pupa delicatamente dal lato ventrale per evitare eventuali danni ai tessuti.
   NOTA: La goccia di olio di alocarbonio deve essere piccola, con un diametro di circa meno della metà della lunghezza della pupa. Tale importo è sufficiente per aderire la pupa al vetro da capillarità e per correggere l'ottica per gli obiettivi di immersione dell'olio.
7. Rotolare un pezzo di carta velina bagnata ai bordi del piatto per mantenere l'umidità. Coprire il piatto per evitare la disidratazione delle pupe durante l'imaging.
   NOTA: sia le pupe femminili che maschili possono essere impiegate per l'imaging. Si consiglia di utilizzare il terzo segmento addominale (AIII) come metamero addominale di riferimento poiché è quasi identico in entrambi i sessi in termini di dimensioni, forma e patterning.

3. Immagini dal vivo di epitelia addominale in crescita

NOTA: È stato utilizzato un microscopio confocale a scansione laser invertito dotato di un obiettivo di immersione dell'olio 40x/1.3 NA per l'immagine delle pupe in diversi stadi di sviluppo.

1. Orientare la pupa sopra la goccia d'olio sulla parabola inferiore di vetro in base al dominio e al processo da valutare (ad esempio dorsolateralmente per l'imaging dal vivo a lungo termine della prima espansione dei nidi dorsali, o dorsalmente per immaginare la loro espansione tardiva e il rimodellamento dei tessuti). Vedere Figura 1J, K e Figura 4.
2. Trasferire la parabola con fondo di vetro contenente le pupe montate allo stadio del microscopio e concentrarsi sulla superficie dell'area addominale utilizzando la luce trasmessa.
   NOTA: Anche se questo protocollo è ottimizzato per l'imaging su microscopi invertiti, è anche possibile eseguire l'imaging su un microscopio verticale. In tal caso, il campione viene posto sullo stadio del microscopio con la superficie inferiore di vetro rivolta verso l'alto. L'olio di alocarbonio tiene ogni pupa su un menisco.
3. Impostare i parametri di acquisizione: 1) il numero di fette z è di solito compreso tra 20-40 per consentire un'appropriata ricostruzione bidimensionale (2D) dell'epidermide addominale; 2) dimensione del gradino tra ogni fetta (ad es. 1 micron); 3) intervallo di tempo per la registrazione (un intervallo di 5 minuti è adatto per analisi ad alta fedeltà della dinamica di orientamento cellulare); risoluzione fotogramma (ad es. 1024 x 1024).
4. Accendere i laser appropriati (ad esempio, 488 nm e 561 nm per visualizzare rispettivamente i fluorofori GFP e RFP) e regolare le impostazioni di potenza e guadagno/offset del laser per visualizzare le celle contrassegnate. Utilizzare la potenza laser più bassa possibile (nell'intervallo 5% - 20%) per ridurre al minimo il fotosbiancamento e la fototossicità.
5. Impostare manualmente la posizione e i limiti appropriati dello stack z per più pupe utilizzando lo stadio motorizzato collegato e il software di acquisizione multiposizione al microscopio.

4. Generazione di mosaici genetici per seguire i comportamenti dei cloni cellulari

NOTA: Utilizziamo la ricombinazione mitotica per indurre mosaici genetici nell'epitelio addominale tramite ricombinazione site-specific (FLP/FRT system^21,22) (Figura 2).

1. Incroci a essere donne vergini che trasportano un transgene Flippase (hs-FLP) indotto da urti di calore, un sito di destinazione di riconoscimento FLP (FRT) in una posizione genomica specifica (ad es. sito FRT nella posizione 40A sul braccio L del cromosoma 2) e un marcatore cellulare riconoscibile (ad esempio, Ubi-RFP.nls o Ubi-GFP.nls) si distale nel sito FRT, ai maschi mutanti che trasportano un sito genomico FRT nella posizione equivalente (Figura 2A-C).
   NOTA: Gli effetti autonomi e non autonomi all'interno o all'esterno dei cloni per qualsiasi perdita genica di funzione potrebbero essere studiati utilizzando specifici alleli recessivi distale nel sito FRT.
2. Generare cloni somatici FLP/FRT negli istoblasti mediante trattamento con urto termico nella terza fase larvale instar della progenie della croce. Ciò viene eseguito immergendo le fiale di plastica contenenti gli animali in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 45 min a 1 h nella fase delle larve erranti (LIII).
   NOTA: Il periodo sensibile per la ricombinazione mitotica è la fase G2 del ciclo cellulare. Gli histoblasti vengono arrestati nel G2 durante l'intero sviluppo larvale.
3. Punteggio clone gemelli per assenza (cioè cellule mutanti) o livelli migliorati (cioè cellule a due punti di tipo selvaggio) del marcatore proteico fluorescente da 16 h APF in poi(Figura 2D).
   NOTA: In media, 45 min a 1 h a 37 gradi centigradi rende circa solo 2-3 cloni gemelli per regione di interesse (ad esempio, l'emisegmento addominale). Le pupe che mostrano anche un'alta densità di cloni (ad esempio, più di quattro cloni gemelli per emisegmento) dovrebbero essere scartate da ulteriori analisi quantitative.
4. Al momento dell'identificazione del clone, l'immagine giorno di vita pupa nella fase desiderata e per il periodo di tempo desiderato come descritto nella sezione precedente.

5. Trattamento e analisi dei dati

NOTA: i dati vengono elaborati utilizzando ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

1. Distinguere la dinamica dell'orientamento cellulare dai contorni di giunzione cellulare.
   1. Proiettare le sezioni di stack z acquisite dalla microscopia confocale in 2D utilizzando la funzione di proiezione massima di intensità (MIP) di ImageJ.
      NOTA: il numero di fette per pila deve essere ridotto al minimo per evitare il rumore di messa a fuoco generato dai macrofagi che pattugliano sotto l'epidermide.
   2. Impostare un sistema di coordinate planare che ivi i punti di riferimento dei tessuti affidabili (ad esempio, i limiti del compartimento A/P) per l'analisi di ogni set di dati (Figura 3A).
      NOTA: l'utilizzo degli stessi riferimenti planari per ogni set di dati consentirà di confrontare più misurazioni.
   3. Utilizzare il plug-in OrientationJ (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) di ImageJ^23,24 sui bordi delle celle locali per ottenere valori di orientamento qualitativi e quantitativi. Il plug-in esegue il rendering di sovrapposizioni codificate a colori sulle immagini di input in base agli orientamenti locali e fornisce valori numerici quando viene utilizzato in modalità quantitativa (Figura 3B'B'' e Figura C''''').
      NOTA: Il plugin OrientationJ si basa su tensori di struttura, 2 x 2 matrice di eigenvalues derivati da gradiente e derivati direzionali (vedi riferimenti^23,24 per una descrizione dettagliata).
   4. Utilizzare l'opzione Distribuzione OrientationJ per colorare gli orientamenti dei bordi delle celle rispetto al sistema di coordinate planari impostato (ad esempio, mappe di orientamento del bordo della cella) (Figura 3B). L'opzione Distribuzione si trova sotto il menu del plugin in ImageJ. Le impostazioni da utilizzare sono: finestra gaussiana sigma s 1 pixel; Spline cubica - Sfumatura; Coesità minima : 20%; Energia minima: 1%. Gli orientamenti dei bordi delle celle vengono visualizzati come immagine codificata a colori utilizzando l'opzione Rilievo colore del plug-in (Tonalità - orientamento; Saturazione e coerenza; e Luminosità: immagine di input).
      NOTA: le aree che contengono fluorescenza di fondo non forniscono alcuna informazione direzionale e devono essere escluse manualmente dall'analisi. Le impostazioni di soglia elevata riducono i pixel considerati nelle immagini elaborate.
   5. Utilizzare l'opzione Misura OrientationJ per quantificare gli orientamenti cellulari e l'allineamento direzionale delle celle (ad esempio, coerenza) (Figura 3C). L'opzione Misura si trova sotto il menu del plugin in ImageJ. Generare piccole regioni adiacenti non sovrapposte di interesse (ROI) di peso uniforme (64 x 64 pixel, circa 20 m x 20 m) all'interno dell'area occupata dagli istoblasti (Figura 3C).
   6. Calcolare l'orientamento locale dominante (ovvero, l'orientamento medio tra la mappa di orientamento del bordo delle celle media delle celle adiacenti) e la coerenza dei ROI. Il software calcola l'orientamento predominante e la coerenza locale all'interno di ogni ROI (Figura 3C).
      NOTA: I valori eigen più grandi e più piccoli del tensore della struttura stimato da OrientationJ vengono utilizzati per calcolare la coerenza come rapporto tra la loro differenza e la loro somma. La coerenza è delimitata tra i valori di 0-1. Il valore 1 indica l'uniformità dell'allineamento completo, mentre un valore pari a 0 indica aree isotropiche senza allineamento.
   7. Analizza statisticamente i valori calcolati di orientamento e coerenza da più immagini utilizzando pacchetti software liberi come PAST²⁵. I dati assitali come i valori di orientamento (in gradi) sono descritti in modo appropriato dalle statistiche direzionali.
   8. Attraverso il software, calcolare la direzione media e la varianza circolare per ogni set di distribuzioni di orientamento. Il significato statistico della differenza tra la distribuzione degli orientamenti tra genotipi o condizioni diversi viene determinato utilizzando il test non parametrico Mardia-Watson-Wheeler (W-test) per distribuzioni uguali.
   9. Calcolare la rilevanza statistica della differenza di coerenza applicando il test non parametrico Kolmogorov-Smirnov (test K-S). Visualizzare i dati graficamente come desiderato (grafici polari, grafici a barre, box plot e così via).
2. Dinamica di crescita dei cloni cellulari
   NOTA: i passaggi seguenti consentono di recuperare i parametri geometrici e di forma per le celle da immagini MIP 2D contenenti i cloni di interesse. Per i confronti tra più cloni, le immagini devono essere acquisite con le stesse impostazioni.
   1. Segmentare le aree clonate disegnando i loro contorni con lo strumento Selezione a mano libera ImageJ.
   2. Calcolare i parametri geometrici e di forma utilizzando lo strumento Imposta misurazioni di ImageJ nel menu Analizza. Attivare le opzioni Area, Perimetro, Adatta ellissee Descrittore forma .
      NOTA: Ciò consentirà il recupero di diversi parametri geometrici, tra cui l'area (somma dei pixel all'interno del clone), il perimetro (somma del pixel del bordo del clone), le proporzioni (AR, il rapporto tra gli assi maggiore e minore dell'ellisse Legendre più adatta inscritta nel bordo del clone) e l'angolo di orientamento (cioè l'angolo dell'asse maggiore del clone rispetto al contorno anteroposteriore).
   3. Il calcolo dei rapporti non dimensionali da queste misure recupera i parametri della forma. Questi includono rotondità (4 x [area]/x x [asse maggiore]²), rugosità (solidità - area/area convessa) e circolarità (4x x [area]/[perimetro]²).
      NOTA: Ognuno dei parametri di forma rappresenta il grado di deviazione dei cloni da forme ideali come un cerchio o uno scafo convesse delimitato e sono tutti delimitati tra i valori di 0 e 1. Valori pari a 1 indicano la simmetria massima (ad esempio, complessità minima).
   4. Analizzare statisticamente i parametri geometrici e di forma tra genotipi o condizioni diversi utilizzando Microsoft Excel e/o PAST. Il significato statistico della differenza viene determinato utilizzando un test t di Student a due code non accoppiato per la media uguale o il test K-S-S- non parametrico per distribuzioni uguali tra le condizioni. I dati possono essere visualizzati graficamente come desiderato (ad esempio, grafici a barre, box plot, ecc.). Vedere la Figura 5.

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Risultati

Il protocollo sopra descritto riguarda la preparazione delle pupe della Drosophila per l'imaging dal vivo a lungo termine e le procedure per l'analisi dell'orientamento cellulare e delle dinamiche di crescita dell'epidermide addominale. Applicando questa metodologia è possibile generare filmati ad alta risoluzione delle pupe in via di sviluppo per periodi fino a 48 h senza fotosbiancamento significativo o fototossicità. Istantanee che raffigurano l'epidermide addominale (ad ese...

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Discussione

L'ordine a lungo raggio è una caratteristica essenziale della maggior parte delle unità fisiologiche funzionali. Durante la morfogenesi, l'ordine si ottiene attraverso l'integrazione di istruzioni complesse implementate con alta precisione temporale e spaziale. I vincoli multipli e multilivello sono integrati in disposizioni tissutali stereotitipati.

Polarità e direzionalità sono fondamentali per una disposizione spaziale ordinata durante lo sviluppo. Polarità implica rottura di simmetria...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis Software	-	ImageJ	Analyzing data
Drosophila	Atpa::GFP	-	Strains employed for data collection
Drosophila	hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	Strains employed for data collection
Dumont 5 Forceps	FST	11251-20	1.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom Plates	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	Mounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	mounting pupae
Inverted Confocal microscope	Zeiss	LSM700	Data collection
Stereomicroscope	Leica	DFC365FX	Visualization of the pupae during dissection