Stimolazione in vitro e visualizzazione del rilascio di trap extracellulari nei Macrofagi derivati da Monciti Umani differenziati

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per rilevare la produzione di trap extracellulari macrofalo (MET) nella coltura di cellule vive utilizzando microscopia e colorazione a fluorescenza. Questo protocollo può essere ulteriormente esteso per esaminare specifici marcatori proteici MET mediante colorazione immunofluorescenza.

Abstract

Il rilascio di trappole extracellulari (ET) da parte dei neutrofili è stato identificato come un fattore che contribuisce allo sviluppo di malattie legate all'infiammazione cronica. Neutrophil ETs (NETs) sono costituiti da una rete di DNA, proteine istone, e varie proteine granulo (cioè, mieloperossiasi, elastasi, e cathepsin G). Altre cellule immunitarie, compresi i macrofagi, possono anche produrre ET; tuttavia, fino a che punto ciò si verifica in vivo e se le trappole extracellulari dei macrofazini (MET) svolgono un ruolo nei meccanismi patologici non è stato esaminato in dettaglio. Per comprendere meglio il ruolo delle MET nelle patologie infiammatorie, è stato sviluppato un protocollo per visualizzare il rilascio di MET dai macrofagi umani primari in vitro, che può essere sfruttato anche negli esperimenti di immunofluorescenza. Ciò consente un'ulteriore caratterizzazione di queste strutture e il loro confronto con gli ET rilasciati dai neutrofili. I macrofagi derivati dai monofati umani (HMDM) producono MET dopo l'esposizione a diversi stimoli infiammatori a seguito della differenziazione al fenotipo pro-infiammatorio M1. Il rilascio di MET può essere visualizzato mediante microscopia utilizzando una macchia di acido nucleico fluorescente verde che è impermeantto alle cellule vive (ad esempio, verde SYTOX). L'uso di macrofagi primari appena isolati, come l'HMDM, è vantaggioso nella modellazione di eventi infiammatori in vivo rilevanti per potenziali applicazioni cliniche. Questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare il rilascio di MET da linee cellulari monocitiche umane (ad esempio, THP-1) a seguito di differenziazione in macrofagi con acetato di mirino phorbol o altre linee cellulari di macrofalo (ad esempio, le cellule J774A.1 simili a murini.

Introduzione

Il rilascio di ET dai neutrofili è stato identificato per la prima volta come una risposta immunitaria innata innescata da infezione batterica¹. Sono costituite da una spina dorsale del DNA a cui sono legate varie proteine del granulo con proprietà antibatteriche, tra cui l'elastasi neutrofilo e la mieloperossia². Il ruolo principale degli ET neutrofili (NET) è quello di catturare gli agenti patogeni e facilitarne l'eliminazione³. Tuttavia, oltre al ruolo protettivo degli ET nella difesa immunitaria, un numero crescente di studi ha anche scoperto un ruolo nella patogenesi della malattia, in particolare durante lo sviluppo di malattie basate sull'infiammazione (ad es. artrite reumatoide e aterosclerosi⁴). Il rilascio degli ET può essere innescato da varie citochine pro-infiammatorie, tra cui l'interleuchina 8 (IL-8) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF)^5,6, e l'accumulo localizzato di ET può aumentare i danni ai tessuti ed evocare risposta pro-infiammatoria⁷. Ad esempio, le ET sono state implicate come un ruolo causale nello sviluppo dell'aterosclerosi^8,promuovendo la trombosi⁹e prevedendo il rischio cardiovascolare¹⁰.

Ora si riconosce che oltre ai neutrofili, altre cellule immunitarie (ad esempio, mastociti, eosofili e macrofagi) possono anche rilasciare ET in caso di esposizione alla stimolazione microbica o pro-infiammatoria^11,12. Questo può essere particolarmente significativo nel caso dei macrofagi, considerando il loro ruolo chiave nello sviluppo, nella regolamentazione e nella risoluzione delle malattie infiammatorie croniche. Pertanto, è importante ottenere una maggiore comprensione della potenziale relazione tra il rilascio di ET dai macrofagi e lo sviluppo di malattie correlate all'infiammazione. Recenti studi hanno dimostrato la presenza di MET e NET in placche aterosclerotiche umane intatte e trombi organizzi¹³. Allo stesso modo, i MET sono stati implicati nel guidare lesioni renali attraverso la regolazione delle risposte infiammatorie¹⁴. Tuttavia, a differenza dei neutrofili, ci sono dati limitati sui meccanismi della formazione MET dai macrofagi. Recenti studi che utilizzano modelli in vitro umano di formazione MET mostrano alcune differenze nei percorsi coinvolti in ogni tipo di cellula (cioè, per quanto riguarda l'assenza di citrigazione istone con macrofagi)⁶. Tuttavia, alcuni hanno dimostrato che il rilascio di NET può verificarsi anche in assenza di citrullination istone¹⁵.

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un metodo semplice e diretto per valutare il rilascio MET in un modello di macrofago clinicamente rilevante. Ci sono un certo numero di diversi modelli di cellule di macrofago in vitro che sono stati utilizzati per studiare MET (cioè, la linea cellulare monocito umano THP-1 e varie linee cellulari del macrofano murino)¹⁶. Esistono alcune limitazioni associate a questi modelli. Ad esempio, la differenziazione dei monociti THP-1 ai macrofagi richiede solitamente una fase di innesco, come l'aggiunta di acetato di forbol miristatico (PMA), che a sua volta attiva percorsi dipendenti dalla chinasi proteica C (PKC). Questo processo è noto per innescare la^release 4 ET e si traduce in un basso rilascio MET basale da cellule THP-1. Altri studi hanno evidenziato alcune differenze nella bioattività e nelle risposte infiammatorie montate dai macrofagi in vivo rispetto alle cellule THP-1 trattate da^PMA.

Allo stesso modo, il comportamento e le risposte infiammatorie di diverse linee cellulari simili a macrofagi murini non rappresentano completamente lo spettro di risposta dei macrofagi umani primari¹⁸. Pertanto, allo scopo di studiare la formazione di ET macrofaci nell'ambiente clinico, si ritiene che i macrofagi derivati da monofagi (HMDM) primari siano un modello più rilevante piuttosto che linee cellulari monocitiche o murine simili a macrofagi.

Il rilascio di ET dagli HMDM polarizzati M1 è stato dimostrato in seguito all'esposizione di queste cellule a diversi stimoli infiammatori, tra cui l'acido ipocilno ossidante derivato da mieloperossia derivato da minidrica (HOCl), PMA, TNF e IL-8⁶. Descritto qui è un protocollo per polarizzare gli HMDM al fenotipo M1 e visualizzare il successivo rilascio MET dopo l'esposizione a questi stimoli infiammatori. PMA è usato come stimolo del rilascio MET per facilitare il confronto con studi precedenti che hanno usato neutrofili. È importante sottolineare che, HOCl, IL-8, e TNF , sono utilizzati anche per stimolare il rilascio di MET, che si crede di essere modelli migliori dell'ambiente infiammatorio in vivo. Il metodo microscopico per la visualizzazione del rilascio di ET consiste nel macchiare il DNA extracellulare nelle colture di cellule vive utilizzando il verde SYTOX, una macchia di acido nucleico verde fluorescente impermeabile che è stata applicata con successo nei precedenti studi neutrofili. Questo metodo consente una valutazione rapida e qualitativa del rilascio di ET, ma non è appropriato come metodo autonomo per la quantificazione dell'estensione del rilascio ET. La metodologia alternativa deve essere utilizzata se è necessaria la quantificazione per confrontare l'entità del rilascio di ET derivante da diverse condizioni o interventi di trattamento.

Protocollo

L'HMDM è stato isolato dai preparati per le mani di bufala umana forniti dalla banca del sangue con l'approvazione etica del distretto sanitario locale di Sydney.

1. Cultura HMDM

1. Isolare i monociti dai preparati del camice buffo preparati dal sangue periferico di donatori umani sani utilizzando una preparazione disponibile in commercio per isolare i linfociti, seguita da eluriazione centrifuga contrastata^{19, 20}.
2. Confermare la presenza di monociti per citospinning e colorazione con macchie Giemsa modificate per caratterizzazione monocite¹⁹.
3. In condizioni sterili, regolare la densità dei monociti a 1 x 10⁶ cellule/mL utilizzando il supporto RPMI-1640 senza siero. Aggiungere 1 mL di questa sospensione cellulare a ogni pozzo di una piastra di coltura dei tessuti a 12 pozzetto. Coltura in un'incubatrice cellulare a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ per 2 h per promuovere l'aderenza alla piastra di coltura tissutale.
4. In condizioni sterili, rimuovere il supporto cellulare e sostituirlo con supporti di coltura RPMI-1640 completi contenenti 10% (v/v) siero umano in pool e 20 mM L-glutamine.
5. Coltura le cellule a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ in un'incubatrice cellulare per 8 giorni, cambiando i media ogni 2 giorni.

2. Polarizzazione di HMDM

1. In condizioni sterili, preparare i supporti di innesco M1 aggiungendo l'interferone z (IFN; 20 ng/mL) e il lipopolioaccharide (LPS; 1 g/mL) ai mezzi di coltura RPMI-1640 completi. Preparare il supporto di priming M2 aggiungendo l'interleucina 4 (IL-4; 20 ng/mL) al supporto di coltura RPMI-1640 completo.
2. In condizioni sterili, aspirare i media dei pozzi della piastra di coltura dei tessuti che contengono l'HMDM, che sono stati semiati e coltivati come descritto nella sezione 1.
3. Lavare con cura i pozze contenenti le cellule 3x con PBS sterile (preriscaldato a 37 gradi centigradi), utilizzando 1 mL di aliquote di PBS.
4. Aggiungere 1 mL del supporto di innesco M1 o M2 a ogni pozzo contenente l'HMDM (a seconda di quale sia appropriato per l'esperimento).
5. Incubare le cellule per 48 h a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ in un'incubatrice cellulare.

3. Stimolazione dell'HMDM per indurre MET Release

1. In condizioni sterili, preparare i mezzi di coltura contenenti diversi stimolatori del rilascio MET (a seconda di quale sia appropriato per l'esperimento) al supporto RPMI-1640 completo: PMA (25 nM), TNF (25 ng/mL) o IL-8 ricombinante umano (50 ng/mL (50 ng/mL ).
2. Per gli esperimenti con la stimolazione HOCl, preparare HOCl (200 m) in HBSS (preriscaldato a 37 gradi centigradi), immediatamente prima dell'aggiunta alle cellule. Assicurarsi che l'HOCl non sia preparato in un supporto completo della cella.
   NOT: La concentrazione della soluzione stock di HOCl viene quantificata misurando l'assorbimento UV della soluzione a 292 nm e pH 11⁶ e utilizzando un coefficiente di estinzione di 350 M^-1cm^-121.
3. Dopo il trattamento di polarizzazione descritto nella sezione 2, aspirare il supporto cellulare da ogni pozzo e lavare con cura le cellule 3x con 1 mL aliquote di: PBS sterile (per PMA, TNF e IL-8) o HBSS (per HOCl), che sono stati preriscaldati a 37 gradi centigradi.
4. Per gli esperimenti con PMA, TNF o IL-8: aggiungere 1 mL del supporto completo contenente PMA, TNF o IL-8 dopo la rimozione del PBS nella fase finale di lavaggio.
5. Per gli esperimenti con il TNF, incubare le cellule per 6 h a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ in un'incubatrice cellulare. Per esperimenti con PMA e IL-8, incubare le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ in un'incubatrice cellulare.
6. Per gli esperimenti con HOCl, aggiungere 1 mL di HOCl in HBSS dopo aver rimosso l'HBSS nella fase finale di lavaggio. Quindi, incubare le cellule per 15 min a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ in un'incubatrice cellulare.
   1. Aspirare con attenzione il supernatante cellulare e lavare le cellule 3x con 1 mL aliquote di HBSS come descritto al punto 3.3.
   2. Dopo aver rimosso l'HBSS dalla fase finale del lavaggio, aggiungere 1 mL di supporti di coltura RPMI-1640 completi. Quindi, incubare le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ in un'incubatrice cellulare.

4. Visualizzazione di MET nella cultura delle cellule vive

1. Preparare il coloranti verde SYTOX in HBSS ad una concentrazione di 40 M.
2. Alla fine dei trattamenti descritti nella sezione 3 per indurre il rilascio di MET, aggiungere direttamente 25 :L di 40 M del coloranti ad ogni pozzo contenente HMDM.
3. Incubare le cellule a temperatura ambiente (RT) per 5 min al buio.
4. Posizionare l'HMDM nei pozzi di coltura tissutale sullo stadio del microscopio di un microscopio fluorescente invertito per l'imaging.
5. Procedure per il microscopio
   1. Accendere una fonte di luce fluorescente ad ampio spettro, una fonte di luce del campo luminoso e un microscopio invertito installato con una fotocamera digitale a colori ad alta risoluzione (vedere Tabella dei materiali).
   2. Ruotare la ruota del filtro fino alla posizione di "numero 2" per la fluorescenza verde (eccitazione - 504 nm, emissione 523 nm) per l'imaging dei campioni macchiati di verde contenuti all'interno dei pozzi di coltura dei tessuti.
   3. Utilizzando l'obiettivo 5x, mettere a fuoco l'immagine con la messa a fuoco grossolana, quindi le manopole di messa a fuoco fine sul microscopio, fino a quando l'immagine appare nitida, chiara e messa a fuoco quando viene visualizzata attraverso l'oculare del microscopio.
   4. Impostare il microscopio alla modalità fotocamera.
   5. Avviare il software associato.
   6. Selezionare la scheda Acquisizione nel software.
   7. Fare clic sul pulsante Riproduci per visualizzare l'anteprima dell'immagine e regolare la manopola di messa a fuoco fine sul microscopio fino a quando l'immagine non appare nitida, chiara e messa a fuoco nella finestra di anteprima del software.
   8. Fare clic sul pulsante Acquisisci.
      NOT: L'immagine acquisita verrà visualizzata automaticamente nel software di accompagnamento.
   9. All'interno del software, fare clic su File Salva come tipo di file immagine richiesto.
   10. Al microscopio, ruotare la ruota del filtro fino alla posizione "numero 5" per l'imaging del campo luminoso e ripetere i passaggi da 4.5.2–4.5.9 per ottenere l'immagine del campo luminoso corrispondente.
   11. Ripetere i passaggi da 4.5.2– 4.5.10 se necessario per la successiva acquisizione dell'immagine.

Risultati

Le immagini di Brightfield che mostrano i cambiamenti morfologici dell'HMDM in risposta agli stimoli per la differenziazione cellulare sono mostrate nella Figura 1. I macrofagi polarizzati M1 da esperimenti con HMDM esposti a IFN e LPS hanno mostrato una forma di cella allungata e simile a un mandrino, come indicato dalle frecce nere nella Figura 1 (pannello centrale). Per fare un confronto, la morfologia dei macrofagi polarizzati M2 dopo l'esposizione dell'HMDM...

Discussione

La generazione e la visualizzazione della formazione MET utilizzando HmDM differenziate M1 rappresenta un nuovo modello in vitro che può essere utile per studiare il potenziale ruolo patologico di queste strutture macrofaghe, in particolare sotto l'infiammatorio cronico Condizioni. Fornisce un protocollo robusto per la stimolazione dei macrofagi umani primari per rilasciare MET, che può anche essere utilizzato in studi correlati con linee cellulari monociti o macrofagi murini. La riuscita implementazione di questo prot...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
120Q broad spectrum fluorescent light source	EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada		x-cite series
Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)	Sigma-Aldrich	CLS3336	For cell culture
Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)	Polysciences Inc.	24606	Characterisation of monocytes
Hanks balanced salt solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14025050	For washing steps and HOCl treatment
Hypochlorous acid (HOCl)	Sigma-Aldrich	320331	For MET stimulation
Interferon gamma	Thermo-Fisher	PMC4031	For M1 priming
Interleukin 4	Integrated Sciences	rhil-4	For M2 priming
Interleukin 8	Miltenyl Biotec	130-093-943	For MET stimulation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	59202C	Added to culture media
Lipopolysaccharide	Integrated Sciences	tlrl-eblps	For M1 priming
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS	1114544	For isolation of monocytes
Olympus IX71 inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan
Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139	For MET stimulation
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D5652	For washing steps
RPMI-1640 media	Sigma-Aldrich	R8758	For cell culture
SYTOX green	Life Technologies	S7020	For MET visulaization
TH4-200 brightfield light source	Olympus, Tokyo, Japan		x-cite series
Tumor necrosis factor alpha	Lonza	300-01A-50	For MET stimulation