Uso dell'analogo della pirimidina, 5-iodo-2′-deossiuridina (IdU) con marcatori del ciclo cellulare per stabilire fasi del ciclo cellulare in una piattaforma di citometria di massa

Riepilogo

Questo protocollo adatta le misurazioni del ciclo cellulare per l'uso in una piattaforma di citometria di massa. Con le capacità multiparametriche della citometria di massa, la misurazione diretta dell'incorporazione di iodio consente l'identificazione delle cellule in fase S, mentre i marcatori del ciclo intracellulare consentono la caratterizzazione di ogni stato del ciclo cellulare in una serie di condizioni sperimentali.

Abstract

La regolazione della fase del ciclo cellulare è un aspetto importante della proliferazione cellulare e dell'omeostasi. L'interruzione dei meccanismi regolatori che governano il ciclo cellulare è una caratteristica di una serie di malattie, incluso il cancro. Lo studio del ciclo cellulare richiede la capacità di definire il numero di cellule in ogni porzione della progressione del ciclo cellulare e di delineare chiaramente tra ciascuna fase del ciclo cellulare. L'avvento della citometria di massa (MCM) offre un enorme potenziale per l'analisi di singole cellule ad alto rendimento attraverso misurazioni dirette di isotopi elementari e lo sviluppo di un metodo per misurare lo stato del ciclo cellulare mediante MCM estende ulteriormente l'utilità dell'MCM. Qui descriviamo un metodo che misura direttamente la 5-iodo-2′-deossiuridina (IdU), simile alla 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU), in un sistema MCM. L'uso di questo MCM basato su IdU offre diversi vantaggi. In primo luogo, l'IdU viene rapidamente incorporata nel DNA durante la sua sintesi, consentendo una misurazione affidabile delle cellule nella fase S con incubazioni di soli 10-15 minuti. In secondo luogo, l'IDU viene misurata senza la necessità di anticorpi secondari o la necessità di degradazione del DNA. In terzo luogo, la colorazione IdU può essere facilmente combinata con la misurazione della ciclina B1, della proteina del retinoblastoma fosforilato (pRb) e dell'istone fosforilato H3 (pHH3), che fornisce collettivamente una chiara delineazione delle cinque fasi del ciclo cellulare. La combinazione di questi marcatori del ciclo cellulare con l'elevato numero di parametri possibili con MCM consente la combinazione con numerose altre metriche.

Introduzione

La citometria di massa consente di rilevare circa 40 parametri sfruttando l'alta risoluzione e la natura quantitativa della spettroscopia di massa. Gli anticorpi marcati con metallo vengono utilizzati al posto degli anticorpi coniugati con fluorofori che consentono un numero maggiore di canali e producono uno spillover minimo ^1,2. MCM presenta vantaggi e svantaggi per quanto riguarda l'analisi del ciclo cellulare rispetto alla citometria a flusso. Uno dei principali vantaggi dell'MCM è che l'elevato numero di parametri consente la misurazione simultanea dello stato del ciclo cellulare in un gran numero di tipi di cellule T immunofenotipicamente distinti in campioni altamente eterogenei. MCM è stato utilizzato con successo per misurare lo stato del ciclo cellulare durante la normale emopoiesi nel midollo osseo umano³ e modelli murini transgenici di deficit di telomerasi⁴. L'analisi dello stato del ciclo cellulare nella leucemia mieloide acuta (LMA) ha mostrato che il ciclo cellulare è correlato alle risposte note alle terapie cliniche, fornendo una visione in vivo delle caratteristiche funzionali che possono informare le selezioni terapeutiche⁵. Un secondo vantaggio dell'analisi del ciclo cellulare citometrico di massa è la capacità di misurare un gran numero di altri marcatori funzionali che possono essere correlati con lo stato del ciclo cellulare. Recenti lavori sono stati in grado di correlare la sintesi di proteine e RNA con lo stato del ciclo cellulare attraverso l'uso di IdU e anticorpi marcati con metallo a BRU e rRNA⁶. Questo tipo di analisi altamente parametrica che misura lo stato del ciclo cellulare in numerose popolazioni in un continuum di differenziazione sarebbe quasi impossibile con l'attuale tecnologia di citometria a flusso. Il principale svantaggio dell'MCM è la mancanza di coloranti di DNA o RNA comparabili a quelli utilizzati nella citometria a flusso fluorescente (ad esempio, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, ecc.). I coloranti fluorescenti possono fornire misurazioni relativamente precise del contenuto di DNA e RNA, ma questa precisione è possibile solo a causa dei cambiamenti nelle proprietà fluorescenti di questi coloranti che si verificano dopo l'intercalazione tra basi nucleotidiche. L'analisi MCM non è quindi in grado di misurare il contenuto di DNA o RNA con precisione simile. Invece, l'analisi del ciclo cellulare citometrico di massa si basa su misurazioni di proteine correlate allo stato del ciclo cellulare come la ciclina B1, la proteina del retinoblastoma fosforilato (pRb) e l'istone H3 fosforilato (pHH3) combinato con la misurazione diretta dell'atomo di iodio dall'incorporazione di IdU nelle cellule di fase S. Questi due approcci di misurazione producono risultati molto simili durante la normale proliferazione cellulare, ma possono potenzialmente essere discordanti quando la progressione del ciclo cellulare viene interrotta.

La misurazione del numero di cellule in ciascuna fase del ciclo cellulare è importante per comprendere il normale sviluppo del ciclo cellulare e l'interruzione del ciclo cellulare, che è comunemente osservato nei tumori e nelle malattie immunologiche. MCM fornisce una misurazione affidabile dei fattori extracellulari e intracellulari utilizzando anticorpi marcati con metallo; tuttavia, la misurazione della fase S era limitata in quanto l'intercalatore del DNA basato sull'iridio non era in grado di distinguere tra DNA 2N e 4N. Al fine di definire le fasi del ciclo cellulare, Behbehani ha sviluppato un metodo che utilizza IdU con una massa di 127, che rientra nell'intervallo del citometro di massa e consente la misurazione diretta delle cellule nella fase S³. Questa misurazione diretta elude la necessità di anticorpi secondari o l'uso di agenti denaturanti del DNA come acido o DNasi. In combinazione con marcatori di ciclo intracellulare, consente un'alta risoluzione della distribuzione del ciclo cellulare in modelli sperimentali.

Questo protocollo adatta le misurazioni del ciclo cellulare dai comuni protocolli di citometria a flusso per MCM. I nostri metodi forniscono un modo comodo e semplice per includere i parametri del ciclo cellulare. L'incorporazione di IdU di campioni in vitro richiede solo da 10 a 15 minuti di incubazione a 37 °C, che è più breve della maggior parte dei protocolli di colorazione BrdU che raccomandano tempi di incubazione di diverse ore ^3,7. I campioni incorporati in IdU e BrdU possono essere fissati utilizzando uno stabilizzatore proteomico e quindi conservati per qualche tempo in un congelatore a -80 °C. Ciò consente di archiviare un gran numero di campioni colorati con IdU per l'analisi dei lotti senza ridurre la qualità del campione.

Protocollo

1. Preparazione delle scorte di IDU

1. Sciogliere la 5-iodo-2'-deossiuridina (IdU) nel DMSO ad una concentrazione di 50 mM. Filtro sterile, aliquota in provette da 10-50 μL e conservare a -80 °C
2. Rimuovere IdU dal congelatore e scongelare a temperatura ambiente. Diluire IdU in RPMI-1640 per ottenere una soluzione di lavoro ad una concentrazione finale di 1 mM. Pipetta su e giù o vortice da mescolare.
   1. Tipicamente, diluire l'IdU concentrata nel mezzo in cui le cellule vengono coltivate (ad esempio DMEM, IMDM, ecc.) o diluirla in PBS per l'aggiunta direttamente al sangue periferico o ai campioni di aspirato del midollo osseo. Questa fase di pre-diluizione facilita la miscelazione del DMSO con i mezzi acquosi delle cellule di interesse.
      NOTA: la concentrazione finale di IdU durante l'incubazione deve essere di 10 μM; una soluzione di 1 mM può essere aggiunta con un rapporto di 10 μL per ogni 1 mL di mezzo.

2. Incubazione IDU e conservazione dei campioni

1. Conservare i campioni in un incubatore umidificato a 37 °C. Rimuovere il campione dall'incubatore e spostarlo in una cappa di biosicurezza.
2. Aggiungere 10 μL di 1 mM IdU a ogni 1 mL di campione.
   1. Per una piastra a 6 pozzetti, aggiungere 30 μL di 1 mM IdU ai 3 mL di terreno di coltura in ciascun pozzetto. IdU può anche essere utilizzato direttamente negli aspirati del midollo osseo e negli studi murini⁴.
3. Introdurre nuovamente il campione nell'incubatore a 37 °C per 10-15 minuti. Mantenere le cellule nelle condizioni ottimali di crescita di interesse durante l'esposizione a IdU al fine di ottenere la misurazione più accurata della fase S.
4. Dopo l'incubazione IdU, rimuovere il campione e trasferirlo in un tubo conico.
5. Centrifugare il campione a 400 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
6. Aspirare il surnatante e risospendere in 200 μL di PBS.
   1. Se necessario, eseguire una macchia viva / morta (usando cisplatino) in questa fase per contrassegnare le cellule morte prima della fissazione e del congelamento.
      NOTA: La colorazione del rodio vivo / morto non funziona bene dopo la permeabilizzazione del metanolo, quindi non è raccomandato per l'uso nelle analisi del ciclo cellulare.
7. Aggiungere 18,75 μL di paraformaldeide (PFA) al 16% al PBS per una concentrazione finale dell'1,5% di PFA. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. Centrifugare il campione a 400 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
8. Aspirare la soluzione di PBS/PFA e risospendere il campione in 500 μL di terreno di colorazione cellulare (CSM; 1x PBS con 0,5% BSA e 0,02% di azoturo di sodio) + 10% di DMSO prima del congelamento.
   1. Se si utilizza uno stabilizzatore proteomico commerciale, aggiungere 280 μL di stabilizzatore proteomico al campione risospeso in 200 μL di PBS (1:1.4). Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti e quindi introdurre direttamente a -80 °C.
      NOTA: È stato dimostrato che l'IDU si incorpora efficacemente entro 10-15 minuti di incubazione a 37 °C. Le incubazioni di IdU più lunghe di 10-15 minuti ridurranno progressivamente la risoluzione delle popolazioni in fase S e G2, poiché le cellule marcate con IdU lasciano la fase S e progrediscono verso la fase G2 o M. Abbiamo anche osservato che l'incubazione a lungo termine con IdU può causare morte cellulare e artefatti del ciclo cellulare. La successiva elaborazione cellulare e la colorazione degli anticorpi dopo l'incorporazione di IdU sono sufficienti per lavare via l'IdU residua che non è stata incorporata nelle cellule in fase S. Non abbiamo osservato un significativo background di iodio quando si utilizza il protocollo in vitro qui descritto; Tuttavia, abbiamo osservato molto raramente contaminazione da iodio nei campioni clinici. Ciò può verificarsi da procedure mediche, come il contrasto di iodio in una scansione TC, o da farmaci contenenti iodio. Se si osservano grandi quantità di fondo per via parenterale di Idrauli, il campione non deve essere eseguito per evitare danni al rilevatore del citometro di massa.

3. Campioni di colorazione per citometria di massa

1. Rimuovere i campioni da -80 °C e lasciarli scongelare prima della colorazione superficiale.
   1. Se si utilizza il metodo di fissaggio SmartTube, scongelare i campioni a 0-4 °C per evitare ulteriori fissaggi mentre i campioni si riscaldano.
2. Dopo che i campioni sono stati scongelati, trasferire circa 1-2 milioni di cellule in una provetta FACS da 5 ml.
3. Centrifugare il tubo FACS a 600 x g per 5 minuti e riempire il tubo FACS con un mezzo di colorazione cellulare (CSM) per lavare le cellule. Ripeti un'altra volta.
   1. Se è noto che le cellule si attaccano insieme, aggiungere 400 U / mL di eparina ai lavaggi CSM per evitare il contatto cellula-cellula, ma questo non è strettamente necessario.
4. Incubare le cellule con agente bloccante FC, 5 μL dell'agente per 100 μL di cellule, per 10 minuti a temperatura ambiente.
5. Preparare una miscela di anticorpi che macchierà la superficie, o la porzione extracellulare, delle cellule. La miscela colorante totale ammonterà a 100 μL per 1-2 milioni di cellule in ciascun test. La miscela colorante sarà bilanciata di conseguenza con CSM ed eparina nel tubo del cocktail e FACS.
   NOTA: l'aggiunta di CSM in questa fase ridurrà anche gli artefatti di colorazione non specifici⁸. Questa miscela colorante dipende interamente dai bersagli di interesse e dal fenotipo superficiale (ad esempio, uno studio che coinvolge le cellule T utilizzerà una miscela superficiale di CD45, CD3, CD4, CD8, ecc.). Un protocollo dettagliato di elaborazione e colorazione dei campioni può essere trovato in Behbehani e McCarthy et ^al.9,10.
6. Aggiungere la miscela colorante superficiale alle celle e incubare a temperatura ambiente con agitazione continua per 30-60 minuti.
7. Dopo la colorazione, riempire il tubo FACS con CSM e centrifugare a 600 x g per 5 minuti.
8. Lavare altre due volte con CSM, ruotando il campione a 600 x g per 5 minuti e aspirando ogni lavaggio CSM.
9. Fissare gli anticorpi extracellulari aggiungendo 1 mL di PBS con 10% CSM e 1,5% PFA.
10. Riempire il tubo FACS contenente la miscela PBS/CSM/PFA con CSM. Girare a 600 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante.
11. Aggiungere metanolo a -20 °C.
12. Vortice il campione per 1-2 minuti per ottenere una sospensione a singola cellula e verificare che tutti i grumi cellulari siano stati nuovamente sospesi.
13. Mentre il campione sta ruotando lentamente, aggiungere rapidamente 1 mL di metanolo ghiacciato utilizzando una pipetta da 1.000 μL con una punta del filtro.
14. Tenere il tubo FAC verso la luce e assicurarsi che non ci siano grumi visibili; La nuvolosità è prevedibile. Eventuali grumi renderanno il campione inutilizzabile per la successiva analisi MCM.
15. Conservare il campione a -20 °C per 10-20 minuti.
16. Preparare la miscela di colorazione intracellulare durante questo periodo. La miscela di colorazione intracellulare dipenderà dagli obiettivi di interesse. Per l'analisi del ciclo cellulare, includere CyclinB1, pRb, Ki67 e pHH3 in questa miscela colorante, ma altri marcatori intracellulari possono essere aggiunti secondo necessità.
17. Dopo 10-20 minuti a -20 °C, rimuovere il campione, aggiungere 1,5 mL di PBS e riempire il resto con CSM.
18. Centrifugare il campione 600 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante.
19. Lavare altre due volte con CSM, ruotando il campione a 600 x g per 5 minuti e aspirando il surnatante ogni volta.
20. Dopo l'ultimo lavaggio CSM, centrifugare il campione e lasciare un volume residuo di circa 50 μL.
21. Aggiungere la miscela di anticorpi preparata (in genere aggiungere 50 μL di cocktail colorante anticorpale per ottenere un volume di colorazione finale di 100 μL) al campione e incubare su una piattaforma di agitazione per 30-60 minuti a temperatura ambiente.
22. Dopo la colorazione aggiungere CSM e centrifugare a 600 x g per 5 min.
23. Aspirare il CSM, lavare nuovamente con CSM, ruotando a 600 x g per 5 minuti, aspirando il CSM, quindi aggiungere PBS.
24. Dopo il completamento della colorazione intracellulare, posizionare le cellule in una soluzione intercalator che fissa gli anticorpi alle cellule e colora il DNA di ciascuna cellula per consentire l'identificazione. La soluzione di intercalatore contiene intercalatore di iridio non isotopicamente puro (pentametilciclopentadienil-Ir(III)-dipiridosofenzina) aggiunto dalla soluzione madre del produttore ad una concentrazione di 500 μM. Diluire il brodo di Iridio 1:4000 in una soluzione di PBS e PFA all'1,5%. Aggiungere la soluzione di intercalatore di iridio a 100-200 μL per milione di cellule per colorare uniformemente e prevenire la sovracolorazione.
    NOTA: L'iridio in questa soluzione intercalator ha lo scopo di identificare le cellule per il gating singoletto, non deve essere usato per macchie vive / morte. Se si desiderano macchie vive/morte, devono essere eseguite prima della fissazione come notato sopra e in McCarthy et ^al.9.
25. Conservare i campioni in soluzione di intercalatore in frigorifero a 4 °C per un massimo di due settimane prima dell'acquisizione del campione sul CyTOF.

4. Funzionamento del citometro di massa

NOTA: L'operazione di citometria di massa può essere specifica della macchina. Si consiglia sempre di controllare il manuale utente CyTOF prima dell'operazione. Inoltre, ci sono attualmente due articoli JoVE che trattano l'avviamento e la manutenzione della macchina ^9,11.

1. Controllare il nebulizzatore per eventuali intasamenti, crepe e altre irregolarità prima di utilizzare il citometro di massa.
2. Collegare il nebulizzatore al citometro e iniziare la procedura di riscaldamento. Non avviare il citometro di massa senza il nebulizzatore in posizione.
3. Far scorrere l'acqua attraverso le linee di campionamento una volta che il citometro di massa ha terminato il riscaldamento. La camera di spruzzatura deve raggiungere circa 200 °C prima di eseguire la regolazione o l'analisi del campione.
4. Acqua corrente per 5-10 min. Dopo 5-10 minuti, caricare la soluzione di ottimizzazione e selezionare il gestore di ottimizzazione. La soluzione di sintonizzazione è una soluzione contenente concentrazioni fisse di metalli e utilizzata per ottimizzare il citometro di massa prima dell'acquisizione del campione
5. In Gestione ottimizzazione, selezionare Anteprima una volta che la soluzione di ottimizzazione ha raggiunto un record di hit in stato stazionario per iniziare il processo di ottimizzazione automatica.
6. Una volta terminata la messa a punto, caricare il campionatore con acqua e lasciare che l'acqua scorra attraverso le linee di campionamento durante l'elaborazione del campione. Il protocollo dettagliato per il funzionamento quotidiano del citometro e la messa a punto è disponibile su Leipold¹¹.
7. Occasionalmente, la messa a punto automatica non si sintonizza sulle prestazioni ottimali della macchina. Ripetere la procedura di ottimizzazione per correggere questo problema.
8. Lavare il campione con CSM una volta e con acqua deionizzata pura due volte prima dell'acquisizione del campione. Il lavaggio con acqua è importante per rimuovere il sale residuo dal PBS / CSM.
9. Controllare la sensibilità e il flusso del campione utilizzando sfere di equilibratura fornite dal produttore, perle di polistirene caricate con concentrazioni di metallo note.
10. Modificare la modalità di acquisizione dalla modalità di ottimizzazione alla modalità di acquisizione degli eventi. Impostare il limite di tempo per interrompere l'acquisizione a 120 s. Attendere 45 secondi prima di selezionare Registra.
11. Il citometro di massa interromperà automaticamente l'acquisizione del campione dopo 120 secondi. Utilizzare il visualizzatore di grafici a pioggia per controllare l'intensità di Eu151 e Eu153.
12. Perle di equilibrio diluite in acqua deionizzata pura con un rapporto 1:20.
13. Prima dell'acquisizione del campione, controllare il gestore dell'esperimento. Utilizza Gestione esperimenti per assegnare nomi ai canali e aggiungere canali da registrare.
    1. Assicurarsi che il canale 127-I sia aggiunto se si utilizza IdU.
    2. Si noti che è essenziale impostare il citometro di massa per misurare i parametri necessari (ad esempio, IdU) prima dell'acquisizione del campione. Se i canali non vengono selezionati in anticipo, i dati non verranno raccolti da alcun canale non selezionato e non possono essere recuperati.
14. Diluire le cellule ad una concentrazione di circa 1-2 x 10⁶/mL utilizzando l'acqua deionizzata pura 1:20 e la miscela di perline di equilibrio. Far passare le celle attraverso il tubo FACS sormontato dal filtro per rimuovere eventuali grumi residui.
15. Caricare il campione e modificare il tempo di acquisizione.
16. Premi Anteprima e attendi che il conteggio degli eventi al secondo si stabilizzi.
    1. Non eseguire eventi superiori a 400 eventi al secondo, questo porterà a quantità significative di doppietti e detriti. In genere raccogliamo almeno da 20.000 a 50.000 eventi cellulari, ma il numero ottimale dipenderà dal disegno sperimentale. La colorazione di un massimo di 2 milioni di cellule produrrà in genere da 300.000 a 400.000 eventi cellulari. Si noti che non tutti gli eventi saranno celle (nel conteggio degli eventi saranno inclusi detriti e eventi di perline).
17. Una volta effettuata l'acquisizione del campione, caricare una soluzione di lavaggio, avviare l'induzione del campione ed eseguire per 5-10 minuti. Dopo 5-10 minuti interrompere l'induzione del campione e far scorrere l'acqua per 10-20 minuti. La soluzione di lavaggio è una soluzione debole di acido fluoridrico progettata per rimuovere il metallo residuo dalle linee del campione.
18. Spegnere il citometro di massa e rimuovere il nebulizzatore. Il nebulizzatore sarà caldo, fare attenzione durante la manipolazione.

5. Analisi dei dati

1. Al fine di rimuovere le perline e anche di correggere la deriva del segnale durante l'acquisizione del campione, normalizzare i file FCS utilizzando il software Fluidigm o l'applicazione sviluppata da Finck¹².
2. Caricare l'FCS su Cytobank o altro software di analisi della citometria a flusso. I file FCS possono essere utilizzati in qualsiasi software compatibile, ai fini di questo protocollo tutti i gating e ulteriori analisi sono stati eseguiti in Cytobank¹³.
3. Prima di poter disegnare le porte del ciclo cellulare, escludere eventuali doppietti o detriti cellulari dall'analisi a valle, questo può essere fatto utilizzando il grafico biassiale di Lunghezza evento vs 191-Ir (Figura 1a). Le cellule formeranno una popolazione distinta e^{luminosa che può} essere utilizzata per escludere doppietti e detriti. Questo è il cancello della canottiera. Questo metodo di gating rimuove in genere circa il 50-60% degli eventi di celle doppiette, quindi potrebbero essere necessarie strategie aggiuntive per rimuovere gli eventi rimanenti della cella doppietta.
   1. Modificare la scala di lunghezza dell'evento (minima e massima) per rendere le celle più prominenti per facilitare il gating singoletto.
   2. Rimuovete ulteriormente doppietti e detriti utilizzando i parametri gaussiani, residuo e offset. Un residuo più alto con offset inferiore è anche detriti e doppietti, e il gating intorno a questa popolazione può rimuovere ulteriormente doppietti e detriti (Figura 1b, c).
4. Gating di fase S – La fase S è la porta più facile da disegnare, ma anche la più importante. Disegna questa porta usando un grafico biassiale di IdU vs pRb, Ki67 o cyclinB1. Le celle IdU⁺ in fase S formeranno una popolazione distinta quando si osservano questi grafici biassiali (Figura 2b).
5. G0/G1-fase, G2/M-fase gating – Stabilire le porte di fase G0/G1 e G2/M sul grafico IdU vs CyclinB1 e l'uso dell'incorporazione IdU è fondamentale per stabilire il confine tra le porte di fase G0/G1 e G2/M. La fase G0/G1 sarà bassa di CyclinB1/IdU- e la fase G2/M sarà alta di CyclinB1^/IdU-. Una buona colorazione della CiclinaB1 mostrerà una popolazione naturale tra le popolazioni G0-G1 e G2-M; Tuttavia, questo varierà tra i tipi di campioni e cellule in condizioni sperimentali. In condizioni sperimentali in cui la distribuzione del ciclo cellulare può essere influenzata e c'è meno separazione tra la fase G0/G1 di CyclinB1 e la fase G2/M, l'utilizzo della fase S consentirà un gating coerente per particolari tipi di cellule in ogni specifico esperimento. Questo metodo è dettagliato di seguito.
   1. Tracciare solo le celle di fase S su CyclinB1 vs IdU per aiutare a stabilire la separazione tra fase G0 / G1 e fase G2 / M. Disegnare un gate^sull'alta popolazione di CyclinB1 e regolare fino a quando circa il 5% superiore della popolazione della fase S è all'interno del cancello (Figura 2c). Questo stabilisce il punto di interruzione tra le porte di fase G0/G1 e G2/M (Figura 2e,f). La popolazione attiva sarà cambiata nella popolazione di interesse e la porzione residente all'interno del cancello precedente sarà la popolazione della fase G2 / M mentre il resto sarà la popolazione della fase G0 / G1.
6. Gating di fase G0 – Stabilisce la fase G0 sul grafico pRb vs IdU. La fase G0 sarà rappresentata da ^{una popolazione} pRb^bassa/IdU-. La popolazione ciclica attiva avrà un'alta espressione di incorporazione di pRb e IdU, la porta di fase G0 può essere disegnata su questo confine in quanto si esprime tipicamente in due popolazioni distinte (Figura 2g,i).
   1. Definire la fase G0 rendendo la popolazione della fase S disegnata in precedenza (Figura 2b) la popolazione attiva e disegnando un gate che incorpora il 90-100% superiore della popolazione^alta pRb. Questa è la popolazione ciclica pRb+ (Figura 2i), la popolazione bassa di pRb al di fuori di questo cancello è^{la popolazione} G0 (Figura 2j).
   2. Se pRb non è disponibile o non può essere registrato, utilizzare Ki67 vs IdU per stabilire la popolazione in fase G0. Disegnando un gate che rappresenta la maggior parte della popolazione della fase S e usando quel gate come confine per Ki67 vs IdU il resto della popolazione sarà la fase G0 (Figura 3a).
7. Gating di fase M – Stabilire la fase M nel grafico biassiale IdU vs pH3. La fase M rappresenta una frazione molto piccola di cellule ed è controllata sulla popolazione^elevata di pH3 (Figura 2d).
8. L'incorporazione di IdU non è riuscita o non è stata possibile – Se l'IdU non è disponibile, definire il ciclo cellulare e non le frazioni cicliche usando Ki67 e pRb. Ki67 e pRb, in condizioni normali, formano due popolazioni distinte: Ki67 alto/pRb^alto e Ki67 basso/pRb^basso. La doppia popolazione positiva rappresenta la popolazione ciclica attiva, correlata alla fase G1, alla fase S, alla fase G2 e alla fase M. La popolazione doppiamente bassa rappresenta la popolazione non ciclica, correlata alla fase G0 (Figura 3b).
   NOTA: Non è possibile delineare ogni singola fase utilizzando Ki67 vs pRb ma è possibile determinare effetti sperimentali sulle relative popolazioni cicliche/non ciclistiche.
9. Analisi del ciclo cellulare – Una volta stabilite le porte, esportare i valori numerici dalle porte per ulteriori analisi. Le percentuali in ogni ciclo possono essere ottenute sottraendo le singole popolazioni dalle popolazioni combinate. La fase G0, disegnata sulla percentuale di gate basso^{IdU basso} di pRb, può essere sottratta dalla fase G0/G1, disegnata su CyclinB1^bassoIdU^neg, per trovare la percentuale di fase G1. Analogamente la percentuale di fase G2 è derivata dalla sottrazione della porta di fase M dalla porta di fase G2/M. Questo genererà valori numerici per ogni singola fase del ciclo cellulare; G0, G1, S, G2 e M. I valori numerici generati per ogni singola fase del ciclo cellulare possono essere utilizzati per ulteriori analisi come grafici e analisi statistiche.

Risultati

Utilizzando cellule HL-60 e un aspirato del midollo osseo umano è possibile mostrare come le condizioni sperimentali possono influenzare la distribuzione e l'analisi del ciclo cellulare. In primo luogo, la strategia di gating deve essere stabilita per dimostrare come vengono derivate le fasi del ciclo cellulare. Nella Figura 1 mostriamo l'istituzione della porta singoletto, che è importante per separare detriti cellulari e doppietti, stabilendo una singola popolazione cellulare. Per le lin...

Discussione

Gli esempi qui presentati dimostrano come utilizzare una piattaforma MCM per analizzare la distribuzione del ciclo cellulare. È stato anche dimostrato che l'analisi del ciclo cellulare è sensibile alle condizioni sperimentali come il tempo e la temperatura, che è una considerazione importante che i ricercatori devono prendere quando considerano MCM per la loro analisi del ciclo cellulare¹⁴. I campioni lasciati in deposito per un breve periodo di tempo, non più di un'ora, avranno un'incorporazi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059	Component of CSM
Centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420	Sample centrifugation
Cleaved-PARP (D214)	BD Biosciences	F21-852	Identification of apoptotic cells
Cyclin B1	BD Biosciences	GNS-1	G2 Resolution
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650	Cryopreservative
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	201078	Internal metal standard for CyTOF performance
FACS Tube w/ mesh strainer	Corning	08-771-23	Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085	Cell culture growth supplement
Helios	Fluidigm		CyTOF System/Platform
Heparin	Sigma	H3393	Staining additive to prevent non-specific staining
IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine)	Sigma	I7125	Incorporates in S-phase
Ki-67	eBiosciences	SolA15	Confirmation of G0/G1
MaxPar Multi Label Kit	Fluidigm	201300	Metal labeling kit, attaches metals to antibodies
Microplate Shaker	Thermo Scientific	88880023	Mixing samples during staining
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	15710	Fixative
pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine	Fluidigm	201192	Cell identification during CyTOF acquisition
p-H2AX (S139)	Millipore	JBW301	Detection of DNA damage
p-HH3 (S28)	Biolegend	HTA28	M-phase Resolution
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Wash solution for cell culture and component of fixative solution
p-Rb (S807/811)	BD Biosciences	J112906	G0/G1 Resolution
Proteomic Stabilizer	SmartTube Inc	PROT1	Sample fixative
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Cell culture growth medium
Sodium Azide	Acros Organics	AC447810250	Component of CSM/Antibody buffer, biocide