Использование аналога пиримидина, 5-йод-2'-дезоксиуридина (IdU) с маркерами клеточного цикла для установления фаз клеточного цикла на платформе массовой цитометрии

Резюме

Этот протокол адаптирует измерения клеточного цикла для использования в платформе массовой цитометрии. Благодаря многопараметрическим возможностям массовой цитометрии прямое измерение включения йода позволяет идентифицировать клетки в S-фазе, в то время как маркеры внутриклеточного цикла позволяют характеризовать состояние каждого клеточного цикла в различных экспериментальных условиях.

Аннотация

Регуляция фазы клеточного цикла является важным аспектом клеточной пролиферации и гомеостаза. Нарушение регуляторных механизмов, регулирующих клеточный цикл, является особенностью целого ряда заболеваний, в том числе онкологических. Изучение клеточного цикла требует способности определять количество клеток в каждой части прогрессии клеточного цикла, а также четко разграничивать каждую фазу клеточного цикла. Появление массовой цитометрии (MCM) обеспечивает огромный потенциал для высокопроизводительного анализа отдельных клеток посредством прямых измерений элементарных изотопов, а разработка метода измерения состояния клеточного цикла с помощью MCM еще больше расширяет полезность MCM. Здесь мы описываем метод, который непосредственно измеряет 5-йодо-2'-дезоксиуридин (IdU), аналогичный 5-бром-2'-дезоксиуридину (BrdU), в системе MCM. Использование этого MCM на основе IdU дает несколько преимуществ. Во-первых, IdU быстро включается в ДНК во время ее синтеза, что позволяет надежно измерять клетки в S-фазе с инкубацией всего за 10-15 минут. Во-вторых, IdU измеряется без необходимости вторичных антител или необходимости деградации ДНК. В-третьих, окрашивание IdU можно легко комбинировать с измерением циклина B1, фосфорилированного белка ретинобластомы (pRb) и фосфорилированного гистона H3 (pHH3), что в совокупности обеспечивает четкое разграничение пяти фаз клеточного цикла. Комбинация этих маркеров клеточного цикла с большим количеством параметров, возможных с MCM, позволяет комбинировать их со многими другими показателями.

Введение

Масс-цитометрия позволяет обнаруживать около 40 параметров, используя преимущества высокого разрешения и количественного характера масс-спектроскопии. Антитела, меченные металлами, используются вместо флуорофорных конъюгированных антител, которые допускают большее количество каналов и производят минимальный побочный эффект ^1,2. MCM имеет преимущества и недостатки в отношении анализа клеточного цикла по сравнению с проточной цитометрией. Одним из основных преимуществ MCM является то, что большое количество параметров позволяет одновременно измерять состояние клеточного цикла в большом количестве иммунофенотипически различных типов Т-клеток в очень гетерогенных образцах. MCM успешно используется для измерения состояния клеточного цикла при нормальном кроветворении в костном мозге^{человека 3} и трансгенных мышиных моделях дефицита теломеразы⁴. Анализ состояния клеточного цикла при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) показал, что клеточный цикл коррелирует с известными реакциями на клиническую терапию, обеспечивая понимание in vivo функциональных характеристик, которые могут информировать о выборе терапии⁵. Вторым преимуществом массового цитометрического анализа клеточного цикла является возможность измерения большого количества других функциональных маркеров, которые могут быть коррелированы с состоянием клеточного цикла. Недавняя работа смогла коррелировать синтез белка и РНК с состоянием клеточного цикла с помощью IdU и меченных металлами антител к BRU и рРНК⁶. Такой высокопараметрический анализ, измеряющий состояние клеточного цикла в многочисленных популяциях в континууме дифференцировки, был бы практически невозможен с современной технологией проточной цитометрии. Основным недостатком MCM является отсутствие сопоставимых красителей ДНК или РНК, используемых во флуоресцентной проточной цитометрии (например, DAPI, Hoechst, Pyronin Y и т. Д.). Флуоресцентные красители могут давать относительно точные измерения содержания ДНК и РНК, но эта точность возможна только благодаря изменениям флуоресцентных свойств этих красителей, которые происходят при интеркаляции между нуклеотидными основаниями. Таким образом, анализ MCM не может измерить содержание ДНК или РНК с аналогичной точностью. Вместо этого массовый цитометрический анализ клеточного цикла основан на измерениях белков, связанных с состоянием клеточного цикла, таких как циклин B1, фосфорилированный белок ретинобластомы (pRb) и фосфорилированный гистон H3 (pHH3) в сочетании с прямым измерением атома йода от включения IdU в клетки S-фазы. Эти два подхода к измерению дают очень похожие результаты во время нормальной клеточной пролиферации, но потенциально могут быть диссонирующими, когда прогрессирование клеточного цикла нарушается.

Измерение количества клеток в каждой фазе клеточного цикла важно для понимания нормального развития клеточного цикла, а также нарушения клеточного цикла, которое обычно наблюдается при раке и иммунологических заболеваниях. MCM обеспечивает надежное измерение внеклеточных и внутриклеточных факторов с использованием метенных металлом антител; однако измерение S-фазы было ограничено, поскольку интеркалятор ДНК на основе иридия не мог различать 2N и 4N ДНК. Чтобы определить фазы клеточного цикла, Бехбехани разработал метод, в котором используется IdU с массой 127, который попадает в диапазон массового цитометра и позволяет напрямую измерять клетки в S-фазе³. Это прямое измерение обходит необходимость во вторичных антителах или использовании денатурирующих ДНК агентов, таких как кислота или ДНКаза. В сочетании с маркерами внутриклеточного цикла он обеспечивает высокое разрешение распределения клеточного цикла в экспериментальных моделях.

Этот протокол адаптирует измерения клеточного цикла из общих протоколов проточной цитометрии для MCM. Наши методы обеспечивают удобный и простой способ включения параметров клеточного цикла. Для включения образцов IdU in vitro требуется всего от 10 до 15 минут инкубации при 37 ° C, что короче, чем у большинства протоколов окрашивания BrdU, которые рекомендуют время инкубации в несколько часов ^3,7. Образцы, включенные в IdU и BrdU, могут быть зафиксированы с помощью протеомного стабилизатора, а затем храниться в течение некоторого времени в морозильной камере с температурой -80 °C. Это позволяет архивировать большое количество образцов, окрашенных IdU, для пакетного анализа без снижения качества образцов.

протокол

1. Подготовка запасов IdU

1. Растворить 5-йодо-2'-дезоксиуридин (IdU) в ДМСО до концентрации 50 мМ. Стерильный фильтр аликвотировать в пробирки по 10-50 мкл и хранить при температуре -80 °C
2. Достаньте IdU из морозильной камеры и разморозьте при комнатной температуре. Разбавьте IdU в RPMI-1640, чтобы получить рабочий раствор при конечной концентрации 1 мМ. Пипеткой вверх и вниз или вихревым для перемешивания.
   1. Как правило, разводят концентрированный IdU в среде, в которой культивируются клетки (например, DMEM, IMDM и т. д.), или разбавляют его в PBS для добавления непосредственно к образцам аспирата периферической крови или костного мозга. Эта стадия предварительного разбавления облегчает смешивание ДМСО с водными средами интересующих клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация IdU во время инкубации должна составлять 10 мкМ; раствор 1 мМ можно добавить в соотношении 10 мкл на каждый 1 мл среды.

2. Инкубация IdU и сохранение образцов

1. Храните образцы в увлажненном инкубаторе с температурой 37 °C. Извлеките образец из инкубатора и переместите образец в колпак биобезопасности.
2. Добавьте 10 мкл 1 мМ IdU на каждый 1 мл образца.
   1. Для 6-луночного планшета добавьте 30 мкл 1 мМ IdU к 3 мл питательных сред в каждой лунке. IdU также можно использовать непосредственно в аспиратах костного мозга, а также в исследованиях на мышах⁴.
3. Поместите образец обратно в инкубатор при температуре 37 °C на 10-15 минут. Поддерживайте клетки в оптимальных условиях роста, представляющих интерес во время воздействия IdU, чтобы получить наиболее точное измерение S-фазы.
4. После инкубации IdU извлеките образец и переложите в коническую пробирку.
5. Отжимайте образец при 400 x g в течение 10 мин при комнатной температуре.
6. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют в 200 мкл PBS.
   1. При необходимости выполните живое/мертвое окрашивание (с использованием цисплатина) на этом этапе, чтобы пометить мертвые клетки перед фиксацией и замораживанием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание живого/мертвого родия плохо работает после пермеабилизации метанолом, поэтому его не рекомендуется использовать в анализе клеточного цикла.
7. Добавьте 18,75 мкл 16% параформальдегида (ПФА) в PBS для получения конечной концентрации 1,5% PFA. Инкубировать при комнатной температуре 10 мин. Отжимайте образец при 400 x g в течение 10 мин при комнатной температуре.
8. Аспирируйте раствор PBS/PFA и повторно суспендируйте образец в 500 мкл среды для окрашивания клеток (CSM; 1x PBS с 0,5% BSA и 0,02% азида натрия) + 10% ДМСО перед замораживанием.
   1. При использовании коммерческого протеомного стабилизатора добавьте 280 мкл протеомного стабилизатора в образец, повторно взвешенный в 200 мкл PBS (1:1,4). Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем поместите непосредственно в -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Было показано, что IdU эффективно включается в течение 10-15 минут инкубации при 37 ° C. Инкубация IdU продолжительностью более 10-15 минут будет постепенно снижать разрешение популяций S и G2-фазы, поскольку меченные IdU клетки покидают S-фазу и переходят в фазу G2 или M. Мы также заметили, что длительная инкубация с IdU может вызвать гибель клеток и артефакты клеточного цикла. Последующая клеточная обработка и окрашивание антител после включения IdU достаточны для вымывания остаточного IdU, который не был включен в клетки S-фазы. Мы не наблюдали значительного йодного фона при использовании протокола in vitro, описанного здесь; Однако мы очень редко наблюдали загрязнение йодом в клинических образцах. Это может произойти из-за медицинских процедур, таких как контрастирование йода при компьютерной томографии, или из-за йодсодержащих фармацевтических препаратов. Если наблюдается большое количество фона IdU, образец не следует запускать, чтобы избежать повреждения детектора масс-цитометра.

3. Окрашивание образцов для массовой цитометрии

1. Снимите образцы с -80 °C и дайте им оттаять перед окрашиванием поверхности.
   1. При использовании метода фиксации SmartTube размораживайте образцы при 0-4 °C, чтобы избежать дополнительной фиксации по мере нагревания образцов.
2. После того, как образцы будут разморожены, перенесите примерно 1-2 миллиона клеток в пробирку FACS объемом 5 мл.
3. Центрифугируйте пробирку FACS при 600 x g в течение 5 мин и заполните пробирку FACS средой для окрашивания клеток (CSM) для промывки клеток. Повторите еще один раз.
   1. Если известно, что клетки слипаются, добавьте 400 ЕД / мл гепарина в промывки CSM, чтобы предотвратить контакт клеток с клетками, но это не является строго необходимым.
4. Инкубируют клетки с FC-блокатором, 5 мкл агента на 100 мкл клеток, в течение 10 мин при комнатной температуре.
5. Приготовьте смесь антител, которые окрасят поверхность или внеклеточную часть клеток. Общая окрашивающая смесь составит 100 мкл на 1-2 миллиона клеток в каждом тесте. Красящая смесь будет уравновешена соответственно CSM и гепарином в коктейле и пробирке FACS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление CSM на этом этапе также уменьшит количество неспецифических артефактов окрашивания⁸. Эта окрашивающая смесь полностью зависит от интересующих мишеней и поверхностного фенотипа (например, в исследовании с участием Т-клеток будет использоваться поверхностная смесь CD45, CD3, CD4, CD8 и т. д.). Подробный протокол обработки и окрашивания образцов можно найти в Behbehani and McCarthy et ^al.9,10.
6. Добавьте в клетки смесь для окрашивания поверхности и выдержите при комнатной температуре при непрерывном встряхивании в течение 30-60 мин.
7. После окрашивания заполните пробирку FACS CSM и открутите при 600 x g в течение 5 мин.
8. Промойте еще два раза с помощью CSM, вращая образец при 600 x g в течение 5 минут и аспирируя каждую стирку CSM.
9. Зафиксируйте внеклеточные антитела, добавив 1 мл PBS с 10% CSM и 1,5% PFA.
10. Заполните пробирку FACS, содержащую смесь PBS/CSM/PFA, CSM. Отжимайте при 600 x g в течение 5 минут и аспирируйте надосадочную жидкость.
11. Добавьте метанол при -20 °C.
12. Встряхните образец в течение 1-2 минут, чтобы получить суспензию одной клетки, и убедитесь, что все клеточные скопления были повторно суспендированы.
13. Пока образец медленно вращается, быстро добавьте 1 мл ледяного метанола с помощью пипетки объемом 1000 мкл с наконечником фильтра.
14. Поднесите трубку FAC к свету и убедитесь, что на ней нет видимых комков; Следует ожидать облачности. Любые скопления сделают образец непригодным для последующего анализа MCM.
15. Храните образец при температуре -20 °C в течение 10-20 минут.
16. За это время приготовьте внутриклеточную окрашивающую смесь. Внутриклеточная окрашивающая смесь будет зависеть от интересующих целей. Для анализа клеточного цикла включите в эту окрашивающую смесь CyclinB1, pRb, Ki67 и pHH3, но при необходимости можно добавить и другие внутриклеточные маркеры.
17. Через 10-20 мин при -20 °C извлеките образец, добавьте 1,5 мл PBS и заполните остаток CSM.
18. Центрифугируйте образец 600 x g в течение 5 мин и аспирируйте надосадочную жидкость.
19. Промойте еще два раза CSM, отжимая образец при 600 x g в течение 5 минут и каждый раз аспирируя надосадочную жидкость.
20. После последней промывки CSM центрифугируйте образец и оставьте остаточный объем примерно 50 мкл.
21. Добавляют приготовленную смесь антител (обычно добавляют 50 мкл коктейля для окрашивания антител для достижения конечного объема окрашивания 100 мкл) к образцу и инкубируют на встряхивающей платформе в течение 30-60 минут при комнатной температуре.
22. После окрашивания добавляют CSM и центрифугу при 600 x g в течение 5 мин.
23. Аспирируйте CSM, снова промойте CSM, вращая при 600 x g в течение 5 минут, аспирируя CSM, затем добавьте PBS.
24. После завершения внутриклеточного окрашивания поместите клетки в интеркаляторный раствор, который фиксирует антитела к клеткам и окрашивает ДНК каждой клетки, чтобы обеспечить идентификацию. Интеркаляторный раствор содержит неизотопно чистый иридиевый интеркалятор (пентаметилциклопентадиенил-Ir(III)-дипиридофеназин), добавленный из исходного раствора производителя в концентрации 500 мкМ. Разбавьте иридиевый запас 1:4000 в растворе PBS и 1,5% PFA. Добавьте раствор иридиевого интеркалатора в концентрации 100-200 мкл на миллион клеток, чтобы равномерно окрасить и предотвратить переокрашивание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иридий в этом растворе интеркалатора предназначен для идентификации клеток для синглетного стробирования, его не следует использовать для живых/мертвых пятен. Если желательны живые/мертвые пятна, их необходимо выполнить перед фиксацией, как отмечено выше и в McCarthy et ^al.9.
25. Храните образцы в растворе интеркалятора в холодильнике при температуре 4 °C до двух недель до получения образца на CyTOF.

4. Работа масс-цитометра

ПРИМЕЧАНИЕ: Операция массовой цитометрии может быть специфической для машины. Перед началом работы всегда рекомендуется ознакомиться с руководством пользователя CyTOF. Кроме того, в настоящее время есть две статьи JoVE, посвященные запуску и техническому обслуживанию машин ^9,11.

1. Перед работой масс-цитометра проверьте небулайзер на наличие засоров, трещин и других неровностей.
2. Подключите небулайзер к цитометру и начните процедуру прогревания. Не запускайте массовый цитометр без установленного небулайзера.
3. Пропустите воду через линии отбора проб, как только масс-цитометр закончит прогрев. Перед настройкой или анализом образца температура в распылительной камере должна нагреться примерно до 200 °C.
4. Пропустите воду на 5-10 мин. Через 5-10 минут загрузите решение для настройки и выберите менеджер настройки. Настроечное решение представляет собой раствор, содержащий фиксированные концентрации металлов и используемый для оптимизации массы цитометра перед взятием образца
5. В диспетчере настройки выберите Предварительный просмотр после того, как решение настройки достигнет записи попадания в устойчивое состояние, чтобы начать процесс автоматической настройки.
6. После завершения настройки загрузите пробоотборник водой и дайте воде пройти через пробоотборные линии во время обработки пробы. Подробный протокол ежедневной работы и настройки цитометра можно найти по адресу Leipold¹¹.
7. Иногда автоматическая настройка не настраивается на оптимальную производительность машины. Повторите процедуру настройки, чтобы исправить это.
8. Перед взятием образца промойте образец CSM один раз и чистой деионизированной водой дважды. Промывание водой важно для удаления остатков соли из PBS/CSM.
9. Проверьте чувствительность и расход образца с помощью поставляемых производителем уравновешивающих шариков, полистирольных шариков, загруженных известными концентрациями металлов.
10. Измените режим сбора данных с настройки на режим захвата событий. Установите ограничение по времени остановки сбора данных на уровне 120 с. Подождите 45 секунд, прежде чем выбрать «Запись».
11. Масс-цитометр автоматически остановит сбор образца через 120 секунд. Используйте средство просмотра графика дождя, чтобы проверить интенсивность Eu151 и Eu153.
12. Разбавьте шарики равновесия в чистой деионизированной воде в соотношении 1:20.
13. Перед взятием образца проверьте диспетчера эксперимента. Используйте диспетчер экспериментов, чтобы назначать имена каналам и добавлять каналы для записи.
    1. Убедитесь, что 127-й канал добавлен при использовании IdU.
    2. Обратите внимание, что перед взятием образца важно настроить масс-цитометр для измерения необходимых параметров (например, IdU). Если каналы не выбраны заранее, данные не будут собираться ни с одного невыбранного канала и не могут быть восстановлены.
14. Разбавьте клетки до концентрации примерно 1-2 x 10⁶ / мл, используя чистую деионизированную воду 1:20 и смесь уравновешивающих шариков. Пропустите ячейки через трубку FACS с фильтром, чтобы удалить остатки комков.
15. Загрузите образец и измените время сбора.
16. Нажмите кнопку «Просмотр» и дождитесь стабилизации количества событий в секунду.
    1. Не запускайте события, превышающие 400 событий в секунду, это приведет к значительному количеству дублетов и мусора. Обычно мы собираем от 20 000 до 50 000 клеточных событий, но оптимальное количество будет зависеть от дизайна эксперимента. Окрашивание до 2 миллионов клеток обычно дает от 300 000 до 400 000 клеточных событий. Обратите внимание, что не все события будут ячейками (в подсчет событий будут включены события мусора и бусин).
17. После того, как отбор проб завершен, загрузите моющий раствор, начните индукцию образца и работайте в течение 5-10 минут. Через 5-10 минут прекратите индукцию образца и запустите воду на 10-20 минут. Промывочный раствор представляет собой слабый раствор плавиковой кислоты, предназначенный для удаления остатков металла из линий отбора проб.
18. Выключите масс-цитометр и извлеките небулайзер. Небулайзер будет горячим, будьте осторожны во время обращения.

5. Анализ данных

1. Чтобы удалить шарики, а также исправить дрейф сигнала во время сбора образцов, нормализуйте файлы FCS с помощью программного обеспечения Fluidigm или приложения, разработанного Finck¹².
2. Загрузите FCS в Cytobank или другое программное обеспечение для анализа проточной цитометрии. Файлы FCS могут использоваться в любом совместимом программном обеспечении, для целей этого протокола все стробирование и дальнейший анализ были выполнены в Cytobank¹³.
3. Прежде чем можно будет нарисовать ворота клеточного цикла, исключите любые дублеты или клеточный мусор из последующего анализа, это можно сделать с помощью двухосного графика зависимости длины события от 191-Ir (рис. 1a). Клетки будут формировать отчетливую, яркую популяцию^{Ir high} , которая может быть использована для исключения дублетов и мусора. Это синглетные ворота. Этот метод стробирования обычно удаляет около 50-60% событий дублетных клеток, поэтому могут потребоваться дополнительные стратегии для удаления оставшихся событий дуплетных клеток.
   1. Измените шкалу длины события (минимальную и максимальную), чтобы клетки выглядели более заметными, чтобы помочь в синглетном стробировании.
   2. Далее удалите дублеты и мусор с помощью параметров Гаусса, остатка и смещения. Более высокий остаток с меньшим смещением также является мусором и дублетами, и стробирование вокруг этой популяции может дополнительно удалить дублеты и мусор (рис. 1b, c).
4. Стробирование S-фазы - S-фаза - самый простой затвор для рисования, но также и самый важный. Нарисуйте этот затвор, используя двухосный график IdU против pRb, Ki67 или cyclinB1. Клетки S-фазы IdU⁺ образуют отдельную популяцию при взгляде на эти двухосные графики (рис. 2b).
5. G0/G1-фаза, G2/M-фазовое стробирование – Установите фазовые затворы G0/G1 и G2/M на графике IdU vs CyclinB1, и использование включения IdU имеет решающее значение для установления границы между фазовыми затворами G0/G1 и G2/M. G0 / G1-фаза будет CyclinB1^низкой / IdU-, а G2 / M-фаза будет^{CyclinB1 высокой} / ^IdU-. Хорошее окрашивание CyclinB1 покажет естественную популяцию между популяциями G0-G1 и G2-M; Однако это будет варьироваться в зависимости от образца и типа клеток в экспериментальных условиях. В экспериментальных условиях, когда может быть нарушено распределение клеточного цикла и существует меньшее разделение между G0/G1-фазой CyclinB1 и G2/M-фазой, использование S-фазы позволит обеспечить последовательное стробирование для определенных типов клеток в каждом конкретном эксперименте. Этот метод подробно описан ниже.
   1. Нанесите на график только ячейки S-фазы на CyclinB1 и IdU, чтобы помочь установить разделение между G0 / G1-фазой и G2 / M-фазой. Нарисуйте ворота на^{высокой} популяции CyclinB1 и отрегулируйте их до тех пор, пока примерно 5% верхних 5% популяции S-фазы не окажутся внутри ворот (рис. 2c). При этом устанавливается точка разрыва между фазовыми затворами G0/G1 и G2/M (рис. 2, e,f). Активная популяция будет изменена на интересующую популяцию, и часть, находящаяся внутри предыдущих ворот, будет популяцией G2/M-фазы, а остальная часть будет популяцией G0/G1-фазы.
6. G0-фазное стробирование - Установите G0-фазу на графике pRb против IdU. Фаза G0 будет представлена^{популяцией pRb low/IdU}-. Активная циклическая популяция будет иметь высокую экспрессию включения pRb и IdU, на этой границе можно нарисовать G0-фазовый гейт, поскольку он обычно экспрессируется в двух различных популяциях (рис. 2g,i).
   1. Определите G0-фазу, сделав популяцию S-фазы, нарисованную ранее (рис. 2b), активной популяцией и нарисовав ворота, включающие верхние 90-100% населения^{с высоким} pRb. Это популяция велосипедистов pRb+ (рис. 2i),^низкая популяция pRb за пределами этих ворот — популяция G0 (рис. 2j).
   2. Если pRb недоступен или не может быть записан, используйте Ki67 против IdU для определения популяции G0-фазы. Нарисовав ворота, представляющие большую часть популяции S-фазы, и используя эти ворота в качестве границы для Ki67 и IdU, остальная часть популяции будет G0-фазой (рис. 3a).
7. Стробирование M-фазы - Установите M-фазу на двухосном графике IdU и pH3. М-фаза представляет собой очень маленькую часть клеток и ограничена популяцией^{с высоким} рН3 (рис. 2d).
8. Включение IdU не удалось или было невозможно - Если IdU недоступен, определите циклические и не циклические фракции клеток, используя Ki67 и pRb. Ki67 и pRb в нормальных условиях образуют две различные популяции: Ki67 с^{высоким} /^{высоким} pRb и Ki67^с низким / низким уровнем^pRb. Двойная положительная популяция представляет собой активную велосипедную популяцию, коррелирующую с G1-фазой, S-фазой, G2-фазой и М-фазой. Двойная низкая популяция представляет собой нециклическую популяцию, коррелирующую с G0-фазой (рис. 3b).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Невозможно разграничить каждую отдельную фазу с использованием Ki67 против pRb, но экспериментальное воздействие на относительные циклические/нециклические популяции могут быть определены.
9. Анализ клеточного цикла - После того, как ворота установлены, экспортируйте числовые значения из ворот для дальнейшего анализа. Проценты в каждом цикле могут быть достигнуты путем вычитания отдельных популяций из объединенных популяций. G0-фаза, нарисованная на^{низком уровне} IdU pRb, процент затвора может быть вычтен из G0/G1-фазы, нарисованной на^{CyclinB1 с низкимотрицательным} IdU, чтобы найти процент G1-фазы. Точно так же процент фазы G2 получается из вычитания затвора М-фазы из затвора G2/M-фазы. Это приведет к получению числовых значений для каждой отдельной фазы клеточного цикла; G0, G1, S, G2 и M. Числовые значения, сгенерированные для каждой отдельной фазы клеточного цикла, могут быть использованы для дальнейшего анализа, такого как построение графиков и статистический анализ.

Результаты

Используя клетки HL-60 и аспират костного мозга человека, можно показать, как экспериментальные условия могут влиять на распределение и анализ клеточного цикла. Во-первых, необходимо разработать стратегию стробирования, чтобы продемонстрировать, как формируются фазы клеточного цикла.

Обсуждение

Представленные здесь примеры демонстрируют, как использовать платформу MCM для анализа распределения клеточного цикла. Также было продемонстрировано, что анализ клеточного цикла чувствителен к экспериментальным условиям, таким как время и температура, что является важным соображение...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059	Component of CSM
Centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420	Sample centrifugation
Cleaved-PARP (D214)	BD Biosciences	F21-852	Identification of apoptotic cells
Cyclin B1	BD Biosciences	GNS-1	G2 Resolution
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650	Cryopreservative
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	201078	Internal metal standard for CyTOF performance
FACS Tube w/ mesh strainer	Corning	08-771-23	Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085	Cell culture growth supplement
Helios	Fluidigm		CyTOF System/Platform
Heparin	Sigma	H3393	Staining additive to prevent non-specific staining
IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine)	Sigma	I7125	Incorporates in S-phase
Ki-67	eBiosciences	SolA15	Confirmation of G0/G1
MaxPar Multi Label Kit	Fluidigm	201300	Metal labeling kit, attaches metals to antibodies
Microplate Shaker	Thermo Scientific	88880023	Mixing samples during staining
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	15710	Fixative
pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine	Fluidigm	201192	Cell identification during CyTOF acquisition
p-H2AX (S139)	Millipore	JBW301	Detection of DNA damage
p-HH3 (S28)	Biolegend	HTA28	M-phase Resolution
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Wash solution for cell culture and component of fixative solution
p-Rb (S807/811)	BD Biosciences	J112906	G0/G1 Resolution
Proteomic Stabilizer	SmartTube Inc	PROT1	Sample fixative
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Cell culture growth medium
Sodium Azide	Acros Organics	AC447810250	Component of CSM/Antibody buffer, biocide