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Descriviamo qui un metodo per fabbricare array di microelettrodi Ti3C2 MXene e utilizzarli per la registrazione neurale in vivo.
Le tecnologie impiantabili di microelettrodi sono state ampiamente utilizzate per chiarire le dinamiche neurali su microscala per ottenere una comprensione più profonda delle basi neurali delle malattie cerebrali e delle lesioni. Poiché gli elettrodi sono miniaturizzati alla scala delle singole cellule, un corrispondente aumento dell'impedimento dell'interfaccia limita la qualità dei segnali registrati. Inoltre, i materiali convenzionali degli elettrodi sono rigidi, con conseguente significativa disallineamento meccanico tra l'elettrodo e il tessuto cerebrale circostante, che suscita una risposta infiammatoria che alla fine porta a una degradazione delle prestazioni del dispositivo. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato un processo per fabbricare microelettrodi flessibili basato su Ti3C2 MXene, un nanomateriale recentemente scoperto che possiede capacità volumetriche, conduttività elettrica, funzionalità superficiali e di processabilità notevolmente elevate. Gli array flessibili di microelettrodi Ti3C2 MXene hanno un notevole basso impedimento dovuto all'elevata conduttività e all'elevata superficie specifica delle pellicole Ti3C2 MXene, e hanno dimostrato di essere squisitamente sensibili per la registrazione dell'attività neuronale. In questo protocollo, descriviamo un nuovo metodo per micropatterning Ti3C2 MXene in array di microelettrodi su substrati polimerici flessibili e ne delineamo l'uso per la registrazione in vivo di microelettroblugrafia. Questo metodo può essere facilmente esteso per creare array di elettrodi MXene di dimensioni arbitrarie o geometria per una serie di altre applicazioni in bioelettronica e può anche essere adattato per l'uso con altri inchiostri conduttivi oltre a Ti3C2 MXene. Questo protocollo consente una fabbricazione semplice e scalabile di microelettrodi da inchiostri conduttivi basati su soluzione, e in particolare permette di sfruttare le proprietà uniche dell'idrofilo Ti3C2 MXene per superare molte delle barriere che hanno a lungo ostacolato la diffusa adozione di nanomateriali a base di carbonio per microelettrodi neurali ad alta fedeltà.
Comprendere i meccanismi fondamentali alla base dei circuiti neurali e come le loro dinamiche sono alterate in malattie o lesioni, è un obiettivo fondamentale per sviluppare terapie efficaci per una vasta gamma di disturbi neurologici e neuromuscolari. Le tecnologie dei microelettrodi sono state ampiamente utilizzate per chiarire le dinamiche neurali su scale spaziali e temporali fini. Tuttavia, l'ottenimento di registrazioni stabili con elevato rapporto segnale-rumore (SNR) da elettrodi su microscala si è dimostrato particolarmente impegnativo. Poiché le dimensioni degli elettrodi sono ridotte per avvicinarsi alla scala cellulare, un corrispondente aumento degli elettrodi impedidegrada la qualità del segnale1. Inoltre, numerosi studi hanno dimostrato che gli elettrodi rigidi composti da materiali elettronici convenzionali di silicio e metallici producono danni significativi e infiammazione nel tessuto neurale, che limita la loro utilità per la registrazione a lungo termine2,3,4,5. Alla luce di questi fatti, c'è stato un notevole interesse nello sviluppo di microelettrodi con nuovi materiali che possono ridurre l'impedimento dell'interfaccia elettrode e possono essere incorporati in fattori di forma morbidi e flessibili.
Un metodo comunemente usato per ridurre l'impedimento dell'interfaccia del tessuto elettrodo è aumentare l'area su cui le specie ioniche nel fluido extracellulare possono interagire con l'elettrodo, o la "superficie effettiva" dell'elettrodo. Ciò può essere ottenuto attraverso la nanodorazione6, sgrossatura della superficie7, o elettroplastica con additivi porosi8,9. I nanomateriali hanno guadagnato un'attenzione significativa in questo campo perché offrono superfici specifiche intrinsecamente elevate e combinazioni uniche di proprietà elettriche e meccaniche favorevoli10. Ad esempio, i nanotubi di carbonio sono stati utilizzati come rivestimento per ridurre significativamente l'impedimento degli elettrodi11,12,13, l'ossido di grafene è stato trasformato in elettrodi morbidi e flessibili a sonda free-standing14, e il grafene poroso laser-pirolizzato è stato utilizzato per elettrodi flessibili e a basso impatto microbico (micro-ECoG)15. Nonostante la loro promessa, la mancanza di metodi di assemblaggio scalabili ha limitato l'adozione diffusa di nanomateriali per elettrodi di interfacciatura neurale. I nanomateriali a base di carbonio, in particolare, sono tipicamente idrofobici, e quindi richiedono l'uso di surfactants16, superacidi17, o la funzionalizzazione della superficie18 per formare acquisive dispersioni per metodi di lavorazione della soluzione, mentre metodi alternativi di fabbricazione, come la deposizione di vapore chimico (CVD), in genere richiedono alte temperature che sono incompatibili con molti substrati polimerici19,20,21 ,22.
Recentemente, è stata descritta una classe di nanomateriali bidimensionali (2D), noti come MXenes, che offre un'eccezionale combinazione di alta conduttività, flessibilità, capacità volumetrica e idrofilia intrinseca, il che li rende una classe promettente di nanomateriali per elettrodi di interfacciatura neurale23. Gli MXenes sono una famiglia di carburi metallici di transizione 2D e nitrati che sono più comunemente prodotti incidendo selettivamente l'elemento A da precursori stratificati. Queste sono tipicamente fasi MAX con la formula generale Mn, 1AXn, dove M è un metallo di transizione precoce, A è un elemento del gruppo 12-16 della tabella periodica, X è carbonio e/o azoto e n - 1, 2 o 324. I fiocchi bidimensionali di MXene hanno gruppi funzionali che terminano la superficie che possono includere idrossile (OH), ossigeno o fluoro. Questi gruppi funzionali rendono MXenes intrinsecamente idrofila e consentono la modifica o la funzionalizzazione flessibile della superficie. Della grande classe di MXenes, Ti3C2 è stato il più ampiamente studiato e caratterizzato25,26,27. Ti3C2 mostra capacità volumetrici notevolmente più elevata (1.500 F/cm3)28 rispetto al grafene attivato (-60-100 F/cm3)29, carbonio derivato da carbide (180 F/cm3)30e pellicole di gel di grafene (260 F/cm3)31. Inoltre, Ti3C2 mostra un'elevata conduttività elettronica (10.000 S/cm)32, e la sua biocompatibilità è stata dimostrata in diversi studi33,34,35,36. L'elevata capacità volumetrica dei film Ti3C2 è vantaggiosa per le applicazioni di rilevamento e stimolazione biologica, perché gli elettrodi che presentano un trasferimento di carica capacitivo possono evitare reazioni di idrolisi potenzialmente dannose.
Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato array di microelettrodi Ti3C2 flessibili e a film sottile, preparati utilizzando metodi di elaborazione delle soluzioni, in grado di registrare sia microelettrografia (microelettrocografica) che attività intracorticale di chiodare neuronale in vivo con alta SNR36. Questi elettrodi MXene hanno mostrato un'impedibilità significativamente ridotta rispetto agli elettrodi in oro abbinato alle dimensioni (Au), che possono essere attribuiti all'elevata conduttività di MXene e all'alta superficie degli elettrodi. In questo protocollo, descriviamo i passaggi chiave per la fabbricazione di array di microelettrodi planari di Ti3C2 MXene su substrati parilini-C flessibili e loro utilizzandoli in vivo per la registrazione intraoperatoria micro-ECoG. Questo metodo sfrutta la natura idrofila di MXene, che rende possibile l'uso di metodi di lavorazione della soluzione che sono semplici e scalabili senza richiedere l'uso di surfactants o superacidi per ottenere sospensioni acquose stabili. Questa facilità di processo può consentire una produzione conveniente di biosensori MXene su scala industriale, che è stata una grave limitazione all'adozione diffusa di dispositivi basati su altri nanomateriali di carbonio. L'innovazione chiave nella fabbricazione degli elettrodi sta nell'uso di uno strato polimerico sacrificale per micromodello il MXene dopo il rivestimento a rotazione, un metodo adattato dalla letteratura sul poli trasformato in soluzione (3,4-ethylenedioxythiophene):poly (s tyrene sulfominato) microelettrodi37, ma che non era stato precedentemente descritto per il modello MXene. Le eccezionali proprietà elettriche di Ti3C2,unite alla sua lavorabilità e alla morfologia 2D lo rendono un materiale molto promettente per le interfacce neurali. In particolare, Ti3C2 offre un percorso per superare il fondamentale compromesso tra l'area geometrica degli elettrodi e l'impedimento dell'interfaccia elettrochimica, un fattore limitante primario per le prestazioni degli elettrodi in microscala. Inoltre, la procedura di fabbricazione descritta in questo protocollo può essere adattata per produrre array di elettrodi MXene di diverse dimensioni e geometrie per diversi paradigmi di registrazione e può anche essere facilmente adattata per incorporare altri inchiostri conduttivi oltre a MXene.
Tutte le procedure in vivo sono conformi alla Guida dei National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Pennsylvania.
1. Sintesi di Ti3C2 MXene
NOTA: le procedure di reazione descritte in questa sezione sono destinate all'uso all'interno di un cofano di fumi chimico. I passaggi di lavaggio inclusi in questa procedura sono destinati ad essere utilizzati con tubi di centrifuga bilanciati. Tutti i rifiuti prodotti sono considerati rifiuti pericolosi e devono essere scartati in modo appropriato seguendo le linee guida dell'Università.
AVVISO: L'acido idrofluorico (HF) è un acido estremamente pericoloso e altamente corrosivo. Consultare le schede tecniche di sicurezza dei materiali (MSDS) per le sostanze chimiche utilizzate per sintetizzare gli MXenes prima dell'uso e implementare e seguire le misure di sicurezza appropriate. Adeguate attrezzature protettive personali (PPE) per la manipolazione HF comprende un cappotto da laboratorio, un grembino resistente agli acidi, scarpe a punta stretta, pantaloni lunghi, occhiali, scudo integrale, guanti nitrile e guanti resistenti HF in gomma butilo o gomma neoprene.
2. Fabbricazione di Array di microelettrodi Ti3C2 MXene
NOTA: la procedura descritta in questa sezione è destinata all'uso all'interno di una struttura standard per le camere pulite universitarie, ad esempio il Singh Center for Nanotechnology dell'Università della Pennsylvania. Questa struttura, così come strutture simili, sono accessibili agli utenti esterni come parte del National Nanotechnology Infrastructure Network (NNIN) supportato dalla National Science Foundation (NSF). In queste strutture, molti degli strumenti, delle attrezzature e dei materiali descritti in questa sezione sono forniti insieme all'accesso alla struttura della camera pulita e non richiederebbero un acquisto separato.
AVVISO: Molte delle sostanze chimiche utilizzate nella fabbricazione di elettrodi MXene sono pericolose, tra cui fotoresist, sviluppatore RD6, remover PG, soluzione di incisione in alluminio e ossido tampolonato e incisione di ossido. Consultare MSDS per queste sostanze chimiche prima dell'uso e implementare e seguire le misure di sicurezza appropriate in ogni momento. Tutte le sostanze chimiche devono essere maneggiate in una cappa di fumi.
3. Costruzione e interfacciamento dell'adattatore
NOTA: A questo punto, gli array di microelettrodi a film sottile devono essere interfacciati con un adattatore per connettersi al sistema di registrazione elettrofisiologico. Il controller di stimolazione/registrazione 128ch con la testata stim/record RHS2000 a 16-ch (Tabella dei materiali) utilizzata in questo protocollo richiede l'input tramite un connettore compatibile con il connettore a 18 pin A79039-001. In questa sezione viene utilizzata una scheda a circuito stampato (PCB, Figura 4A) con un connettore a forza di inserimento zero per l'interfacciamento con i cuscinetti di incollaggio Au sull'array di microelettrodi e il connettore A79040-001 per l'interfacciamento con la fase di registrazione del sistema di registrazione. A seconda del sistema di acquisizione dei dati, è possibile utilizzare diversi connettori sul PCB per consentire l'interfacciamento con il headstage elettrofisiologia.
4. Impianto acuto e registrazione neurale
NOTA: Gli interventi chirurgici sui ratti Maschi Adulti Sprague Dawley vengono eseguiti utilizzando strumenti sterili e con tecnica asettica. La frequenza respiratoria, il riflesso palpebrale e il riflesso del pizzico del pedale vengono controllati ogni 10 min per monitorare la profondità dell'anestesia. La temperatura corporea viene mantenuta con una piastra di riscaldamento.
I dati di esempio micro-ECoG registrati su una matrice di microelettrodi MXene sono illustrati nella Figura 5. Dopo l'applicazione dell'array di elettrodi sulla corteccia, chiari segnali fisiologici sono stati immediatamente evidenti sugli elettrodi di registrazione, con circa 1 mV segnali di ampiezza ECoG che appaiono su tutti gli elettrodi MXene. Gli spettri di potenza di questi segnali confermarono la presenza di due ritmi cerebrali comunemente osservati nei ratti sotto anestesia ketamina...
La procedura di sintesi e delaminazione MXene descritta in questo protocollo (HF/HCl/LiCl) è stata costruita dall'approccio di incisione MILD che impiegava un mezzo di incisione LiF/HCl (in situ HF)26. L'approccio MILD permette di devastare spontaneamente grandifiocchi di Ti3C (diversi m di dimensione laterale) durante il lavaggio, una volta raggiunto il pH 5/6. Rispetto all'incisione con la sola HF, questo si traduce in materiale con una qualità superiore e migliori propri...
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (grant no. R21-NS106434), il Citizens United for Research in Epilepsy Taking Flight Award, la Mirowski Family Foundation e Neil e Barbara Smit (F.V.); il National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (grant no. DGE-1845298 a N.D. e B.M.); l'Ufficio di ricerca dell'esercito (numero di accordo cooperativo W911NF-18-2-0026 a K.M.); e dall'esercito degli Stati Uniti tramite il Programma di Iniziativa Scientifica di Superficie presso il Edgewood Chemical Biological Center (PE 0601102A Progetto VR9 a Y.G. e K.M.). Questo lavoro è stato svolto in parte presso il Singh Center for Nanotechnology, che è supportato dal National Science Foundation National Nanotechnology Coordinated Infrastructure Program (NNCI-1542153).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
00-90 screw | McMaster-Carr | 90910A630 | Skull screw around which ground wire is wrapped |
128ch stimulation/recording controller | Intan Technologies | A component of the neural recording system. | |
175 mL polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | REF: 352076 | Used for washing |
18 position 0.5 mm pitch ZIF connector | Molex | 505110-1892 | Used to interface the flexible Parylene microelectrode array with the PCB adapter board. |
18 position dual row male nano-miniature (.025"/.64mm) connector | Omnetics Connector Corporation | A79008-001 | Used to interface the PCB adapter board to the recording headstage. |
3ML Disposable Plastic Set Transfer Graduated Pipettes | Rienar | Rienar-3ML-20PCS | Used for transferring etchant or MXene solutions |
50 mL polyproylene (PP) concial centrifuge tube | Falcon | REF: 352070 | Used for washing and size selection |
Al etchant Type A | Transene | 060-0026000-QT | For removing Al etch mask layer after final Parylene-C etch. |
Aluminum Powder, -325 Mesh, 99.5% (metals basis), particle size < 44 µm | Alfa Aesar | CAS: 7429-90-5 | Used for MAX synthesis |
AutoCAD software | Autodesk Inc. | Design software for drawing photomasks. Free alternatives include DraftSight and LayoutEditor. | |
Buffered Oxide Etchant 6:1 | JT Baker | 1178-03 | For removing SiO2 layer to expose MXene electrode contacts at the end of the fabrication procedure. |
Buprenorphine SR | Wildlife Pharmaceuticals | Analgesia for rat surgery | |
Centrifuge | Hermle | Benchmark Z 446 | Used for washing and size selection |
Dexdomitor | Midwest Veterinary Supply | 193.13250.3 | Anesthesia for rat surgery |
Drill burr | Fine Science Tools | 19007-07 | Burrs for drill |
Electric drill | Foredom | K.1070 | Micromotor drill for craniotomies |
Electron beam evaporator | Kurt J. Lesker Company | Used to evaporate Ti, Au, and SiO2 during fabrication. Most university clean rooms have this or a similar tool. | |
Ground wire | A-M Systems | 781500 | Bare silver wire |
Headspace Vial, glass | Supelco | REF: 27298 | Used for storing MXene solutions |
Hydrochloric acid (12.1N) | Fisher Scientific | CAS: 7647-01-0 | Corrosive; etchant material |
Hydrofluoric Acid, (48-51% solution in H2O) | Acros | CAS: 7664-39-3 | Etchant material |
Jupiter II RIE system | March Plasma Systems Inc. | Planar RIE etching system used to etch the Parylene-C using O2 plasma. Most university clean rooms have a comparable planar RIE etching system. | |
Kapton standard polyimide tape, 1/4" | DuPont | Used to add thickness to the Au bonding pad region of the flexible Parylene microelectrode array for insertion into the ZIF connector. | |
Ketamine | Hospital of the Univ. of Penn. | Anesthesia for rat surgery | |
KLA P-7 Stylus Profilometer | KLA Corporation | Used the measure 2D profiles to confirm complete etching through the sacrificial parylene-C layer in step 2.4.2. Most university clean rooms have this or a comparable stylus profilometer tool. | |
Lithium chloride, 99% for analysis, anhydrous | Acros | CAS: 7447-41-8 | Hygroscopic; delamination material |
MA6 mask aligner | Karl Suss Microtec AG | Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool. | |
Micro-90 cleaning solution | International Products Corporation | M-9050-12 | Used as the anti-adhesive layer to enable removal of the sacrificial Parylene-C layer to pattern the MXene |
NR71-3000p photoresist | Futurrex Inc. | NR71-3000p | Negative photoresist used to define Ti/Au traces and MXene patterns in the devices. |
Ophthalmic ointment | Midwest Veterinary Supply | 193.63200.3 | To prevent corneal drying during surgery |
Parylene deposition system | Specialty Coating Systems | Used to evaporate thin conformal films of Parylene-C | |
Parylene-C dimer | Specialty Coating Systems | 980130-c-01lbe | Flexible polymer used as bottom and top passivating layers for the flexible MXene devices |
Photomasks (chrome on soda lime glass) | University of Pennsylvania | Our photomasks were produced in the University clean room using a Heidelberg DWL66+ laser writer system, however several vendors manufacture photomasks from provided design files. | |
Povidone-iodine solution | Medline | MDS093901 | To help prevent infection around scalp incision |
Printed Circuit Board (PCB) | Advanced Circuits | Used to interface between the MXene electrode array and the measurement electronics such as the potentiostat and the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on the provided design files. | |
RD6 Developer | Futurrex Inc. | RD6 Developer | Used to develop NR71-3000p negative photoresist following UV exposure |
Reference 600 potentiostat | Gamry Instruments | Used to measure the electrodes' impedance to assess quality of the devices | |
Remover PG | MicroChem Corp. | G050200 | Used to remove NR71-3000p following metal deposition to perform lift-off patterning |
RHS2000 Stim SPI interface cable | Intan Technologies | A component of the neural recording system. | |
RHS2116 amplifier board | Intan Technologies | A component of the neural recording system. | |
Si wafers | Wafer World | 2885 | Substrate for fabrication |
Spin Coater | Cost Effective Equipment | For coating wafers with resists and applying the Micro-90 and MXene layers. Most university clean rooms have spin coaters. | |
Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 902 | For positioning the rat for neurosurgery |
Teflon-coated magnetic stir bar | Corning | REF: 1233W95 | Used to stir during etching and intercalation |
Titanium carbide, 99.5% (metals basis), particle size ~2 µm | Alfa Aesar | CAS: 12070-08-5 | Used for MAX synthesis |
Titanium powder, -325 mesh, 99% (metals basis), particle size < 44µm | Alfa Aesar | CAS: 7440-32-6 | Used for MAX synthesis |
Ultrasonic bath sonicator | Reynolds Tech | For removing metal and photoresist particles during lift-off processes to pattern metals. | |
UV vis spectrophotometer | ThermoScientific | Evolution 201 | Used to determine concentration and observe absorption peak |
Zetasizer, Particle Size Analysis | Malvern Panalytical | Nano ZS | Used to determine particle lateral size distibution |
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