Fabricação de Matrizes de microeletrodo Ti3C2 MXene para gravação neural in vivo

Resumo

Descrevemos aqui um método para fabricar matrizes de microeletrodos Ti₃C₂ MXene e utilizá-las para gravação neural in vivo.

Resumo

As tecnologias de microeletrodos implantáveis têm sido amplamente utilizadas para elucidar a dinâmica neural na microescala para obter uma compreensão mais profunda dos fundamentos neurais de doenças cerebrais e lesões. Como os eletrodos são miniaturizados à escala de células individuais, um aumento correspondente na impedância da interface limita a qualidade dos sinais registrados. Além disso, os materiais de eletrodos convencionais são rígidos, resultando em uma significativa incompatibilidade mecânica entre o eletrodo e o tecido cerebral circundante, o que provoca uma resposta inflamatória que eventualmente leva a uma degradação do desempenho do dispositivo. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um processo para fabricar microeletrodos flexíveis baseados em Ti₃C₂ MXene, um nanomaterial recentemente descoberto que possui notável alta capacidade volumétrica, condutividade elétrica, funcionalidade de superfície e capacidade de processamento em dispersões aquosas. Matrizes flexíveis de microeletrodos Ti₃C₂ MXene têm uma impedância notavelmente baixa devido à alta condutividade e alta área de superfície específica dos filmes Ti₃C₂ MXene, e eles provaram ser requintadamente sensíveis para registrar atividade neuronal. Neste protocolo, descrevemos um novo método para micropadronizar Ti₃C₂ MXene em matrizes de microeletrodos em substratos poliméricos flexíveis e delinear seu uso para gravação de microeletrocorticografia ao vivo. Este método pode ser facilmente estendido para criar matrizes de eletrodos MXene de tamanho arbitrário ou geometria para uma gama de outras aplicações em bioeletrônica e também pode ser adaptado para uso com outras tintas condutoras além de Ti₃C₂ MXene. Este protocolo permite a fabricação simples e escalável de microeletrodos a partir de tintas condutoras baseadas em soluções, e especificamente permite aproveitar as propriedades únicas de icti_{3C 2} MXene para superar muitas das barreiras que há muito dificultam a adoção generalizada de nanomateriais à base de carbono para microeletrodos neurais de alta fidelidade.

Introdução

Entender os mecanismos fundamentais subjacentes aos circuitos neurais e como sua dinâmica é alterada em doenças ou lesões, é um objetivo crítico para o desenvolvimento de terapêuticas eficazes para uma ampla gama de distúrbios neurológicos e neuromusculares. As tecnologias de microeletrodos têm sido amplamente utilizadas para elucidar a dinâmica neural em escalas espaciais e temporais finas. No entanto, obter gravações estáveis com alta relação sinal-ruído (SNR) a partir de eletrodos de microescala provou ser particularmente desafiador. À medida que as dimensões dos eletrodos são reduzidas à aproximação da escala celular, um aumento correspondente na impedância de eletrodos degrada a qualidade do sinal¹. Além disso, inúmeros estudos têm demonstrado que eletrodos rígidos compostos por materiais eletrônicos convencionais de silício e metal produzem danos significativos e inflamação no tecido neural, o que limita sua utilidade para o registro a longo prazo^2,3,4,5. Diante desses fatos, houve um interesse significativo no desenvolvimento de microeletrodos com novos materiais que podem reduzir a impedância da interface eletrodo-tecidual e podem ser incorporados em fatores de forma suave e flexível.

Um método comumente usado para reduzir a impedância da interface eletrodo-tecidual está aumentando a área sobre a qual espécies iônicas no fluido extracelular podem interagir com o eletrodo, ou a "área de superfície eficaz" do eletrodo. Isso pode ser alcançado através da nanopadronização⁶, roughening superficial⁷, ou eletroplating com aditivos porosos^8,9. Os nanomateriais ganharam atenção significativa neste campo porque oferecem áreas de superfície específicas intrinsecamente altas e combinações únicas de propriedades elétricas e mecânicas favoráveis¹⁰. Por exemplo, nanotubos de carbono têm sido usados como revestimento para reduzir significativamente a impedância de eletrodos^11,12,13, óxido de grafeno foi processado em eletrodos de sonda sem fio e flexíveis¹⁴, e o grafeno poroso piralificado a laser foi utilizado para eletrocorticografia flexível e de baixa impesão (micro-ECoG) eletrocógrafos¹⁵. Apesar de sua promessa, a falta de métodos de montagem escaláveis limitou a adoção generalizada de nanomateriais para eletrodos interligados neurais. Nanomateriais à base de carbono, em particular, são tipicamente hidrofóbicos, e, portanto, requerem o uso de surfactantes¹⁶, superácidos¹⁷, ou funcionalização superficial¹⁸ para formar dispersões aquosas para métodos de fabricação de processamento de soluções, enquanto métodos alternativos de fabricação, como deposição de vapor químico (DCV), normalmente requerem altas temperaturas incompatíveis com muitos substratos poliméricos^{19,20,21 ,22}.

Recentemente, uma classe de nanomateriais bidimensionais (2D), conhecidos como MXenes, foi descrita que oferece uma combinação excepcional de alta condutividade, flexibilidade, capacitância volumétrica e hidrofilia inerente, tornando-os uma classe promissora de nanomateriais para eletrodos interficiais neurais²³. MXenes são uma família de carbides de metal de transição 2D e nitrides que são mais comumente produzidos gravando seletivamente o elemento A de precursores em camadas. Estas são tipicamente fases MAX com a fórmula geral M_n+1AX_n, onde M é um metal de transição precoce, A é um elemento de grupo 12-16 da tabela periódica, X é carbono e/ou nitrogênio, e n = 1, 2 ou 3²⁴. Os flocos mxene bidimensionais têm grupos funcionais de terminação de superfície que podem incluir hidroxilo (−OH), oxigênio (-O) ou fluorina (-F). Esses grupos funcionais tornam os MXenes inerentemente hidrofílicos e permitem modificação ou funcionalidade de superfície flexível. Da grande classe de MXenes, ti₃C₂ tem sido o mais estudado e caracterizado^25,26,27. Ti₃C₂ mostra capacidade volumétrica notavelmente maior (1.500 F/cm³)²⁸ do que o grafeno ativado (~60-100 F/cm³)²⁹, carbonos derivados de carbóide (180 F/cm³)³⁰, e filmes de gel de grafeno (~260 F/cm³)³¹. Além disso, ti₃C₂ mostra uma condutividade eletrônica extremamente alta (~10.000 S/cm)³², e sua biocompatibilidade tem sido demonstrada em diversos estudos^33,34,35,36. A alta capacidade volumétrica dos filmes Ti₃C₂ é vantajosa para aplicações biológicas de sensoriamento e estimulação, pois eletrodos que exibem transferência de carga capacitiva podem evitar reações de hidrólise potencialmente prejudiciais.

Nosso grupo demonstrou recentemente matrizes flexíveis de microeletrodos Ti₃C_2, preparadas usando métodos de processamento de soluções, que são capazes de registrar tanto a microeletrocorticografia (micro-ECoG) quanto a atividade intracortical neuronal de piqueamento in vivo com o Alto SNR³⁶. Estes eletrodos MXene mostraram impedância significativamente reduzida em comparação com eletrodos de ouro (Au) com tamanho, que podem ser atribuídos à alta condutividade de MXene e à área de superfície alta dos eletrodos. Neste protocolo, descrevemos os passos-chave para a fabricação de matrizes de microeletrodos planar de Ti₃C₂ MXene em substratos parylene-C flexíveis e utilizando-os in vivo para gravação intraoperatória de micro-ECoG. Este método aproveita a natureza hidrofílica da MXene, o que possibilita o uso de métodos de processamento de soluções simples e escaláveis, sem exigir o uso de surfactantes ou superácidos para alcançar suspensões aquosas estáveis. Essa facilidade de processabilidade pode permitir a produção econômica de biosensores MXene em escalas industriais, o que tem sido uma grande limitação para a adoção generalizada de dispositivos com base em outros nanomateriais de carbono. A principal inovação na fabricação de eletrodos está no uso de uma camada polimérica sacrificial para micropadronizar o MXene após o revestimento spin, um método adaptado da literatura sobre polipoli de solução processada (3,4-etilenoiophene):poly (sulfona estireno) (PEDOT:PSS) microelectrodes^37,mas que não havia sido descrito anteriormente para o padrão MXene. As excepcionais propriedades elétricas de Ti₃C_2,juntamente com sua processabilidade e morfologia 2D fazem dele um material muito promissor para interfaces neurais. Em particular, o Ti₃C₂ oferece um caminho para superar a troca fundamental entre área geométrica de eletrodos e impedância de interface eletroquímica, fator principal de limitação para o desempenho de eletrodos em microescala. Além disso, o procedimento de fabricação descrito neste protocolo pode ser adaptado para produzir matrizes de eletrodos MXene de tamanhos e geometrias variados para diferentes paradigmas de gravação, e também pode ser facilmente adaptado para incorporar outras tintas condutoras além de MXene.

Protocolo

Todos os procedimentos vivos constituídos ao Guia nacional de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Pensilvânia.

1. Síntese de Ti₃C₂ MXene

NOTA: Os procedimentos de reação descritos nesta seção são destinados ao uso dentro de uma capa de fume química. As etapas de lavagem incluídas neste procedimento devem ser utilizadas com tubos de centrífuga equilibrados. Todos os resíduos produzidos são considerados resíduos perigosos e devem ser descartados adequadamente seguindo as diretrizes da Universidade.

ATENÇÃO: O ácido fluorídrico (HF) é um ácido extremamente perigoso e altamente corrosivo. Consulte as folhas de dados de segurança dos materiais (MSDS) para obter os produtos químicos usados para sintetizar MXenes antes de usar e implementar e seguir as medidas de segurança apropriadas. Equipamentos de proteção individual adequados (EPI) para manuseio de HF incluem um casaco de laboratório, avental resistente ao ácido, sapatos de dedo próximo, calças compridas, óculos, escudo facial completo, luvas de nitrile e luvas resistentes a HF feitas de borracha butil ou borracha neoprene.

1. Síntese de fase MAX
   1. Sinthesize Ti₃AlC₂ por bola moendo TiC (2 μm), Ti (44 μm) e Al (44 μm) em uma relação molar (TiC:Ti:Al) de 2:1:1 para 18 h usando bolas de zircônia. Coloque os pós em um cadinho de alumina, aqueça a 1.380 °C (5 °C) e segure por 2 h argônio. Depois que os pós foram resfriados, moa o bloco MAX e peneira através de uma peneira de malha de 200 (<74 μm tamanho de partículas).
      NOTA: O precursor da fase Ti₃AlC₂ MAX usado para sintetizar MXenes mostrou-se ter implicações diretas nas propriedades Ti₃C₂ MXene resultantes³⁸. O Ti₃C₂ usado para fabricar eletrodos neurais foi seletivamente gravado a partir de MAX preparado após um procedimento anterior²⁶.
2. Gravura: Remoção da camada Al em Ti₃ALC₂ em uma solução ácida etchant(Figura 1A)
   1. Prepare a solução de gravura seletiva em um recipiente plástico de 125 mL adicionando primeiro 12 mL de água deionizada (DI H₂O) seguido pela adição de 24 mL de ácido clorídrico (HCl). Usando todos os PPE gravuras HF apropriados, adicione 4 mL de HF ao recipiente etchant. Realize a gravação seletiva adicionando lentamente 2 g de ti₃alc₂ max fase ao recipiente de reação e mexendo com uma barra magnética Teflon por 24 h a 35 °C a 400 rpm.
3. Lavagem: Trazendo o material para pH neutro.
   1. Encha dois tubos centrífugas de 175 mL com 100 mL de DI H₂O. Divida a mistura de reação de gravação em 175 tubos de centrífuga mL e lave o material por centrífuga repetida a 3.500 rpm (2.550 x g) por 5 min. Decant o supernatante ácido em um recipiente de resíduos perigosos plásticos. Repita até que o pH chegue a 6.
4. Intercalação: Inserção de moléculas entre partícula Multicamada MXene para despertar interações fora do plano (Figura 1B)
   1. Adicione 2 g de cloreto de lítio (LiCl) a 100 mL de DI H₂O e mexa a 200 rpm até dissolver. Misture 100 mL de LiCl/H₂O com o sedimento Ti₃C₂/Ti₃ALC₂ e mexa a reação por 12 h a 25 °C.
5. Delaminação: Esfoliação da partícula multicamada a granel em camada única a poucas Ti₃C₂ MXene (Figura 1C)
   1. Lave a reação intercalation em 175 tubos de centrífuga mL por centrífuga em 2.550 x g por 5 min. Decant o supernatante claro. Repita até que um supernatante escuro seja encontrado.
   2. Continue a centrífuga por 1h a 2.550 x g. Decante o supernatante verde diluído.
   3. Re-disperse o sedimento inchado com 150 mL de DI H₂O. Transfira supernatante para tubos centrífugas de 50 mL e centrífuga sem 2.550 x g por 10 minutos para separar max (sedimento) restante de MXene (supernatante).
      NOTA: A redispersão do sedimento se tornará difícil e exigirá agitação ou agitação manual.
   4. Colecione supernatant como Ti₃C₂ MXene. Realize mais seleção de tamanho e otimização da solução para isolar flocos de camada única a pouca camada, coletando o supernatante após uma etapa de centrífuga em 2.550 x g por 1 h.
6. Armazenamento de soluções: Embalagem da tinta MXene para armazenamento de longo prazo(Figura 1D)
   1. Argon borbulhe as soluções por 30 min antes da embalagem em um frasco de espaço de cabeça lacrado argon (transferência via seringa). Armazene soluções em altas concentrações (>5 mg/mL), longe da luz solar, e a baixas temperaturas (≤5°C) para garantir a longevidade.

2. Fabricação de Ti₃C₂ Matrizes de microeletrodo mxene

NOTA: O procedimento descrito nesta seção destina-se a uso dentro de uma instalação padrão de sala limpa da universidade, como o Singh Center for Nanotechnology da Universidade da Pensilvânia. Esta instalação, assim como instalações similares, são acessíveis a usuários externos como parte da Rede Nacional de Infraestrutura de Nanotecnologia (NNIN) apoiada pela Fundação Nacional de Ciência (NSF). Nessas instalações, muitas das ferramentas, equipamentos e materiais descritos nesta seção são fornecidos juntamente com o acesso à instalação da sala limpa e não exigiriam compra separada.

ATENÇÃO: Muitos dos produtos químicos usados na fabricação de eletrodos MXene são perigosos, incluindo fotoresists, desenvolvedor RD6, remover PG, solução de gravação de alumínio e etchant de óxido tampão. Consulte o MSDS para obter esses produtos químicos antes de usar e implementar e seguir as medidas de segurança apropriadas o tempo todo. Todos os produtos químicos devem ser manuseados em um capô de fumaça.

1. Deposite uma camada inferior de 4 μm de espessura de parylene-C em um wafer Si limpo (ver Figura 2A).
2. Use a primeira fotomáscara (máscara-1) para definir as interconexões metálicas dos dispositivos, bem como um anel de metal ao redor da borda do wafer para auxiliar em etapas posteriores de decolagem(Figura 2B).
   1. O casaco de giro NR71-3000p no wafer a 3.000 rpm para 40 s. Leve assar o wafer em uma placa quente por 14,5 min a 95 °C.
   2. Carregue o wafer e a máscara-1 em um alinhador de máscaras. Posicione o wafer para que o anel na fotomáscara se sobreponha a todas as bordas do wafer.
   3. Expor com i-line (comprimento de onda de 365 nm) em uma dose de 90 mJ/cm². Asse o wafer em um prato quente por 1 min a 115 °C.
   4. Mergulhe o wafer no desenvolvedor RD6 por 2 minutos, agitando continuamente a solução. Enxágüe bem com DI H₂O e seque com uma arma N_2.
   5. Use um evaporador de feixe de elétrons para depositar 10 nm Ti, seguido por 100 nm Au no wafer.
      NOTA: Parâmetros típicos de depoimento são uma pressão base de 5 x 10^-7 Torr e uma taxa de 2 Å/s.
   6. Mergulhe o wafer no removedor PG por ~10 minutos até que a fotoresiste se dissolva e o excesso de metal tenha sido totalmente levantado, deixando Ti/Au apenas nos traços de interconexão desejados e no anel ao redor da borda do wafer. Uma vez que a decolagem aparece completa, sonicate para 30 s para remover quaisquer traços restantes de metal indesejado. Enxágüe wafer primeiro em solução de remover limpo PG, depois enxaguar completamente em DI H₂O e secar o wafer com uma arma N_2.
3. Deposite a camada parylene-C sacrificial(Figura 2C).
   1. Exponha o wafer ao plasma O₂ por 30 s para tornar a camada parylene-C subjacente hidrofílica. Solução de limpeza do casaco de giro 2% (por exemplo, Micro-90) no DI H₂O no wafer a 1.000 rpm por 30 s. Deixe o wafer secar por pelo menos 5 min.
      NOTA: A solução de sabão diluído atua como um antiadesivo, permitindo que a camada parylene-C sacrificial seja descascada mais tarde no processo.
   2. Deposite 3 μm de parylene-C no wafer.
4. Use a segunda fotomáscara (máscara-2) para definir os padrões MXene e um anel ao redor da borda do wafer (Figura 2D).
   1. Repita as etapas 2.2.1-2.2.4, desta vez usando máscara-2 e alinhando cuidadosamente as marcas de alinhamento entre o wafer e a fotomáscara antes da exposição.
   2. Use a gravura de íonre reativo de plasma O₂ (RIE) para gravar através da camada parylene-C sacrificial nas áreas não cobertas pela fotoresistpara definir os eletrodos e traços MXene, que devem se sobrepor parcialmente com as interconexões Ti/Au, bem como o anel ao redor das bordas do wafer. Confirme a gravação completa da camada parylene-C sacrificial usando um profilómetro para medir o perfil entre as interconexões Ti/Au expostas e a camada parylene-C inferior.
      NOTA: Quando a gravação estiver completa, o perfil através da superfície metálica exposta será suave, enquanto a camada parile-C inferior será áspera e parcialmente gravada. Esta etapa de gravação deve ser completada em um sistema rie planar, não um asher barril, e tempos e parâmetros de gravação serão altamente dependentes do sistema RIE.
5. Spin-coat a solução MXene no wafer (Figura 2E).
   1. Pipette MXene solução em cada um dos padrões MXene desejados, em seguida, gire o wafer a 1.000 rpm para 40 s. Seque o wafer em uma placa quente de 120 °C por 10 min para remover qualquer água residual do filme MXene.
6. Use um evaporador de feixe de elétrons para depositar 50 nm SiO₂ no wafer, para agir como uma camada protetora sobre os padrões de MXene para etapas de processamento subsequentes.
   NOTA: Parâmetros típicos de depoimento são uma pressão base de 5 x 10^-7 Torr e uma taxa de 2 Å/s.
7. Remova a camada parylene-C sacrificial para padronizar as camadas MXene e SiO₂ (Figura 2F).
   1. Aplique uma pequena gota de DI H₂O à beira do wafer e use pinças para descascar a camada parylene-C sacrificial, começando onde suas bordas são definidas no ringue ao redor do wafer.
      NOTA: A água se combinará com o resíduo de sabão abaixo da camada parilencial-C sacrificial para permitir essa decolagem.
   2. Enxágüe o wafer completamente em DI H₂O para remover qualquer resíduo de solução de limpeza restante. Seque o wafer com uma arma N_2, em seguida, coloque em uma placa quente de 120 °C por 1h para remover qualquer água residual dos filmes mxene padronizados.
8. Deposite a camada superior de 4 μm de espessura de parylene-C (Figura 2G).
9. Use a terceira fotomáscara (máscara-3) para definir contorno saque do dispositivo e aberturas sobre eletrodos e almofadas de ligação Au (VIAs) (Figura 2H).
   1. Repita as etapas 2.2.1-2.2.4, desta vez usando máscara-3 e alinhando cuidadosamente as marcas de alinhamento entre o wafer e a fotomáscara antes da exposição.
   2. Use um evaporador de feixe de elétrons para depositar 100 nm Al no wafer.
      NOTA: Parâmetros típicos de depoimento são uma pressão base de 5 x 10^-7 Torr e uma taxa de 2 Å/s.
   3. Mergulhe o wafer no removedor PG por ~10 minutos até que o metal tenha sido totalmente levantado, deixando Al cobrindo os dispositivos com aberturas para os eletrodos e almofadas de ligação. Quando a decolagem estiver completa, sonicate para 30 s para remover quaisquer traços restantes de metal indesejado. Enxágüe wafer primeiro em solução de remover limpo PG, depois enxaguar completamente em DI H₂O e secar o wafer com uma arma N_2.
10. Etch o parylene-C para padronizar o contorno do dispositivo e aberturas sobre eletrodos e almofadas de ligação Au (VIAs) (Figura 2I). Use o O₂ plasma RIE para gravar através das camadas parylene-C ao redor dos dispositivos, e através da camada parylene-C superior cobrindo os contatos de eletrodo MXene e as almofadas de ligação Au.
    NOTA: A gravação é completa quando nenhum resíduo parylene-C permanece no wafer entre os dispositivos. A camada SiO₂ que cobre o MXene agirá como uma camada de parada de gravura, impedindo que o plasma O₂ gravura ou danificasse os contatos do eletrodo MXene.
11. Etch a camada Al cobrindo os dispositivos usando uma gravação química molhada em Al etchant tipo A a 50 °C ou por 10 min, ou por 1 min passado quando todos os traços visuais de Al desapareceram, o que vier primeiro. Etch the SiO₂ cobrindo os eletrodos MXene usando uma gravura química molhada em 6:1 etchant de óxido tampão (BOE) para 30 s(Figura 2J).
    NOTA: As matrizes de microeletrodos MXene estão agora completas.
12. Solte os dispositivos do wafer de substrato Si colocando uma pequena gota de DI H₂O na borda de um dispositivo e descascando suavemente o dispositivo à medida que a água é perversa por baixo dele por ação capilar(Figura 2K e Figura 3).

3. Construção e Interface

NOTA: Neste ponto, as matrizes de microeletrodos de filme fino devem ser interfacedas com um adaptador para se conectar ao sistema de gravação de eletrofisiologia. O controlador de estimulação/gravação de 128ch com o headstage RHS2000 16-ch stim/record(Tabela de Materiais)usado neste protocolo requer entrada através de um conector compatível com o conector a79039-001. Esta seção utiliza uma placa de circuito impresso (PCB, Figura 4A) com um conector de força de inserção zero (ZIF) para interagir com as almofadas de ligação Au na matriz de microeletrodos e o conector A79040-001 para interagir com o estágio principal do sistema de gravação. Dependendo do sistema de aquisição de dados, diferentes conectores podem ser usados no PCB para permitir a interligação com o headstage da eletrofisiologia.

1. Solde os conectores Omnetics e ZIF ao PCB, aplicando uma fina película de pasta solda da pasta solda em cada uma das almofadas de contato no PCB, colocando as peças em seus locais apropriados e aquecendo em uma placa quente até que a solda reflua reflua para formar conexões (Figura 4B).
   NOTA: A solda de refluxo pode ser feita muito facilmente em uma placa quente ou em um forno de torradeira e não requer o uso de um forno de refluxo caro.
2. Aplique duas camadas de fita poliimide (Tabela de Materiais) na parte traseira da região da almofada de ligação Au da matriz de microeletrodo MXene para dar ao dispositivo espessura suficiente para ser fixado no conector ZIF. Depois de aplicar a fita, corte qualquer excesso além das bordas do dispositivo parylene-C usando uma lâmina de barbear ou tesoura de precisão(Figura 4C).
3. Seja um escopo de inspeção ou usando óculos de ampliação, alinha mxene matriz de microeletrodo no conector ZIF para que as almofadas de ligação Au se alinham com os pinos dentro do conector ZIF, em seguida, feche o ZIF para formar uma conexão segura (Figura 4D,E).
   NOTA: O conector ZIF usado aqui é um conector de 18 canais, enquanto o dispositivo usado aqui tem 16 canais. Os canais extras não contatados são facilmente identificados como um circuito aberto por meio de testes de impedância durante as sessões de gravação.
4. Teste a impedância eletroquímica dos eletrodos MXene usando um potenciostat para garantir a fabricação e conexão bem sucedidas com o adaptador PCB.
   NOTA: Valores razoáveis de impedância são dados na seção de discussão para ajudar na solução de problemas.

4. Implantação aguda e gravação neural

NOTA: Cirurgias em ratos machos adultos Sprague Dawley são realizadas usando instrumentos estéreis e com técnica asséptica. A taxa respiratória, o reflexo palpebral e o reflexo da pitada de pedal são verificados a cada 10 min para monitorar a profundidade da anestesia. A temperatura corporal é mantida com uma almofada de aquecimento.

1. Administrar analgesia preventiva (injeção subcutânea de liberação sustentada de buprenorfina [SR], 1,2 mg/kg).
2. Administrar anestesia (injeção intraperitoneal de uma mistura de 60 mg/kg de cetamina e 0,25 mg/kg dedexmedetomidina).
3. Confirme o nível adequado de anestesia a cada 10 min ao longo do experimento, verificando se há ausência de reflexos palpebral e de pitada de pedal.
4. Rato seguro em quadro estereotaxico, aplique lubrificante ocular aos olhos e limpe couro cabeludo raspado com 10% de povido-iodo.
5. Exponha a calvaria com incisão única do couro cabeludo midline e dissecação contundente do tecido subjacente.
6. Coloque um parafuso 00-90 no crânio para servir de chão para gravações.
7. Usando uma broca dentária com uma pequena rebarba, faça uma craniotomia no local de gravação cortical desejado.
8. Proteja o conector de matriz a um manipulador estereotaxic e posicione o dispositivo sobre a craniotomia. Suavemente mais baixo até que toda a matriz esteja em contato com o córtex exposto.
9. Enrole o fio de chão ao redor do parafuso do crânio.
10. Conecte o headstage do sistema de gravação à matriz e comece a registrar atividade espontânea.

Resultados

Os dados de micro-ECoG de amostra registrados em uma matriz de microeletrodo MXene são mostrados na Figura 5. Após a aplicação da matriz de eletrodos no córtex, sinais fisiológicos claros foram imediatamente aparentes nos eletrodos de gravação, com aproximadamente 1 mV de amplitude ECoG aparecendo em todos os eletrodos MXene. Espectros de energia desses sinais confirmaram a presença de dois ritmos cerebrais comumente observados em ratos anestesia de cetamina-dexmedetomidina: oscila?...

Discussão

O procedimento de síntese e delaminação mxene descrito neste protocolo (HF/HCl/LiCl) foi construído a partir da abordagem de gravação MILD que empregava um LiF/HCl (in situ HF) etchant médio²⁶. A abordagem MILD permite que grandes flocos Ti₃C₂ (vários μm em tamanho lateral) sejam espontaneamente delaminados durante a lavagem uma vez que pH ~5-6 tenha sido alcançado. Em comparação com a gravação apenas com HF, isso resulta em material com maior qualidade e melhor...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
00-90 screw	McMaster-Carr	90910A630	Skull screw around which ground wire is wrapped
128ch stimulation/recording controller	Intan Technologies		A component of the neural recording system.
175 mL polypropylene (PP) conical centrifuge tubes	Falcon	REF: 352076	Used for washing
18 position 0.5 mm pitch ZIF connector	Molex	505110-1892	Used to interface the flexible Parylene microelectrode array with the PCB adapter board.
18 position dual row male nano-miniature (.025"/.64mm) connector	Omnetics Connector Corporation	A79008-001	Used to interface the PCB adapter board to the recording headstage.
3ML Disposable Plastic Set Transfer Graduated Pipettes	Rienar	Rienar-3ML-20PCS	Used for transferring etchant or MXene solutions
50 mL polyproylene (PP) concial centrifuge tube	Falcon	REF: 352070	Used for washing and size selection
Al etchant Type A	Transene	060-0026000-QT	For removing Al etch mask layer after final Parylene-C etch.
Aluminum Powder, -325 Mesh, 99.5% (metals basis), particle size < 44 µm	Alfa Aesar	CAS: 7429-90-5	Used for MAX synthesis
AutoCAD software	Autodesk Inc.		Design software for drawing photomasks. Free alternatives include DraftSight and LayoutEditor.
Buffered Oxide Etchant 6:1	JT Baker	1178-03	For removing SiO2 layer to expose MXene electrode contacts at the end of the fabrication procedure.
Buprenorphine SR	Wildlife Pharmaceuticals		Analgesia for rat surgery
Centrifuge	Hermle	Benchmark Z 446	Used for washing and size selection
Dexdomitor	Midwest Veterinary Supply	193.13250.3	Anesthesia for rat surgery
Drill burr	Fine Science Tools	19007-07	Burrs for drill
Electric drill	Foredom	K.1070	Micromotor drill for craniotomies
Electron beam evaporator	Kurt J. Lesker Company		Used to evaporate Ti, Au, and SiO2 during fabrication. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Ground wire	A-M Systems	781500	Bare silver wire
Headspace Vial, glass	Supelco	REF: 27298	Used for storing MXene solutions
Hydrochloric acid (12.1N)	Fisher Scientific	CAS: 7647-01-0	Corrosive; etchant material
Hydrofluoric Acid, (48-51% solution in H2O)	Acros	CAS: 7664-39-3	Etchant material
Jupiter II RIE system	March Plasma Systems Inc.		Planar RIE etching system used to etch the Parylene-C using O2 plasma. Most university clean rooms have a comparable planar RIE etching system.
Kapton standard polyimide tape, 1/4"	DuPont		Used to add thickness to the Au bonding pad region of the flexible Parylene microelectrode array for insertion into the ZIF connector.
Ketamine	Hospital of the Univ. of Penn.		Anesthesia for rat surgery
KLA P-7 Stylus Profilometer	KLA Corporation		Used the measure 2D profiles to confirm complete etching through the sacrificial parylene-C layer in step 2.4.2. Most university clean rooms have this or a comparable stylus profilometer tool.
Lithium chloride, 99% for analysis, anhydrous	Acros	CAS: 7447-41-8	Hygroscopic; delamination material
MA6 mask aligner	Karl Suss Microtec AG		Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Micro-90 cleaning solution	International Products Corporation	M-9050-12	Used as the anti-adhesive layer to enable removal of the sacrificial Parylene-C layer to pattern the MXene
NR71-3000p photoresist	Futurrex Inc.	NR71-3000p	Negative photoresist used to define Ti/Au traces and MXene patterns in the devices.
Ophthalmic ointment	Midwest Veterinary Supply	193.63200.3	To prevent corneal drying during surgery
Parylene deposition system	Specialty Coating Systems		Used to evaporate thin conformal films of Parylene-C
Parylene-C dimer	Specialty Coating Systems	980130-c-01lbe	Flexible polymer used as bottom and top passivating layers for the flexible MXene devices
Photomasks (chrome on soda lime glass)	University of Pennsylvania		Our photomasks were produced in the University clean room using a Heidelberg DWL66+ laser writer system, however several vendors manufacture photomasks from provided design files.
Povidone-iodine solution	Medline	MDS093901	To help prevent infection around scalp incision
Printed Circuit Board (PCB)	Advanced Circuits		Used to interface between the MXene electrode array and the measurement electronics such as the potentiostat and the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on the provided design files.
RD6 Developer	Futurrex Inc.	RD6 Developer	Used to develop NR71-3000p negative photoresist following UV exposure
Reference 600 potentiostat	Gamry Instruments		Used to measure the electrodes' impedance to assess quality of the devices
Remover PG	MicroChem Corp.	G050200	Used to remove NR71-3000p following metal deposition to perform lift-off patterning
RHS2000 Stim SPI interface cable	Intan Technologies		A component of the neural recording system.
RHS2116 amplifier board	Intan Technologies		A component of the neural recording system.
Si wafers	Wafer World	2885	Substrate for fabrication
Spin Coater	Cost Effective Equipment		For coating wafers with resists and applying the Micro-90 and MXene layers. Most university clean rooms have spin coaters.
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 902	For positioning the rat for neurosurgery
Teflon-coated magnetic stir bar	Corning	REF: 1233W95	Used to stir during etching and intercalation
Titanium carbide, 99.5% (metals basis), particle size ~2 µm	Alfa Aesar	CAS: 12070-08-5	Used for MAX synthesis
Titanium powder, -325 mesh, 99% (metals basis), particle size < 44µm	Alfa Aesar	CAS: 7440-32-6	Used for MAX synthesis
Ultrasonic bath sonicator	Reynolds Tech		For removing metal and photoresist particles during lift-off processes to pattern metals.
UV vis spectrophotometer	ThermoScientific	Evolution 201	Used to determine concentration and observe absorption peak
Zetasizer, Particle Size Analysis	Malvern Panalytical	Nano ZS	Used to determine particle lateral size distibution