Sistemi di permeazione imitare gli odori controllati per l'allenamento olfattivo e il test sul campo

Riepilogo

Il controlled odor mimic Permeation System è un metodo semplice, portatile sul campo e a basso costo di erogazione degli odori per test olfattivi e formazione. È costruito con un odorante trattenuto su un materiale adsorbente e contenuto all'interno di un sacchetto polimerico permeabile che consente il rilascio controllato del vapore odorante nel tempo.

Abstract

Il Controlled Odor Mimic Permeation System (COMPS) è stato sviluppato per fornire un comodo metodo di test sul campo di erogazione degli odori a velocità controllate e riproducibili. I COMPS sono composti da un odorante di interesse su un materiale assorbente sigillato all'interno di un sacchetto polimerico permeabile. Lo strato permeabile consente un rilascio costante dell'odorante per un determinato periodo di tempo. La borsa permeabile viene ulteriormente conservata in una borsa secondaria impermeabile. La procedura di doppio contenimento consente l'equilibrazione dell'odore dal sacchetto permeabile ma all'interno dello strato esterno impermeabile, risultando in una fonte istantanea e riproducibile di vapore odorante al momento della rimozione dall'imballaggio esterno. I COMPS vengono utilizzati sia nei test olfattivi per scenari sperimentali che per l'allenamento di rilevamento olfattivo, ad esempio con canini di rilevamento. Comps può essere utilizzato per contenere una vasta gamma di odori (ad esempio, polveri di narcotici) e fornire un rilascio controllato degli odori associati. La disponibilità di odori da COMPS è espressa in termini di tasso di permeazione (cioè, la velocità del vapore odorante rilasciato da un COMPS per unità di tempo) ed è tipicamente misurata con mezzi gravimetrici. Il tasso di permeazione per una data massa o volume di odorante può essere regolato in base alle esigenze variando lo spessore del sacchetto, la superficie e/o il tipo di polimero. La concentrazione di odori disponibile da un COMPS può anche essere misurata con tecniche di analisi dello spazio di testa come la microesezione in fase solida con gascromatografia/spettrometria di massa (SPME-GC/MS).

Introduzione

L'olfatto è un meccanismo di rilevamento cruciale, ma spesso trascurato, utilizzato dalla maggior parte degli animali. Per molti è il meccanismo principale per localizzare il cibo, trovare un compagno o percepire il pericolo¹. Inoltre, le capacità olfattive di alcuni animali, in particolare i canini, sono regolarmente sfruttate dall'uomo per l'individuazione di contrabbando (ad esempio narcotici o esplosivi) o altri oggetti di interesse, come persone scomparse, specie invasive o malattie^2,3. Per la ricerca sull'individuazione canina o altri argomenti di ricerca sull'olfatto, gli investigatori spesso studiano il processo di olfatto e i punti di forza e i limiti del sistema olfattivo. Come tale, è generalmente auspicabile controllare il rilascio di un vapore odorante nell'ambiente per fornire in modo riproducibile quantità note di odorante durante il test. La mancata considerazione delle variazioni nella disponibilità di odori dovute a fattori quali la pressione del vapore o gli effetti ambientali spesso complica l'interpretazione e l'applicabilità dei^{dati 4}. Allo stesso modo è auspicabile fornire una quantità stabilita di odore durante gli scenari di allenamento per i canini di rilevamento. Ad esempio, studi di Hallowell et^al.

In ambienti di laboratorio, l'uso di apparecchiature analitiche come tubi di permeazione con forni controllabili, generatori di vapore o olfactometri può essere utilizzato per controllare l'erogazione degli odori. Tuttavia, questo tipo di apparecchiature non è pratico per l'uso durante gli scenari di test sul campo e di allenamento⁴. Il Controlled Odor Mimic Permeation System (COMPS) è stato sviluppato come metodo semplice, a basso costo e usa e getta per l'erogazione controllata degli odori che non richiede energia esterna. Pertanto, possono essere facilmente incorporati in una varietà di diversi scenari di test e formazione⁷. Le unità COMPS sono semplicemente composte da un odorante di interesse su un materiale assorbente sigillato all'interno di un sacchetto polimerico permeabile, conservato in un sistema di contenimento secondario. L'utilizzo di COMPS riduce la variabilità tra i test e migliora la coerenza durante gli esercizi di^{allenamento 8}.

La consegna degli odori o la disponibilità da COMPS è misurata in termini di tasso di permeazione, come determinato dall'analisi gravimetrica in termini di massa di vapore rilasciata nel tempo. I tassi di permeazione possono essere controllati da una serie di fattori, tra cui lo spessore del sacchetto polimerico, la sua superficie disponibile, il tipo di materiale assorbente (substrato) utilizzato e la quantità di odorante. Il tasso di permeazione è costante per un determinato periodo di tempo (ore o giorni) a seconda dell'odore utilizzato. Ciò consente una variabilità minima nella consegna degli odori durante i test o l'allenamento. Durante lo stoccaggio, COMPS raggiunge l'equilibrio all'interno del contenitore esterno impermeabile, risultando in una fonte istantanea di vapore odorante ad un tasso di permeazione noto.

I COMPS sono stati inizialmente progettati per contenere odori associati a materiali esplosivi e per essere utilizzati come imitazioni degli odori⁷. Come definito da Macias et al., un odore imita un materiale di interesse, come un esplosivo, fornendo i composti volatili dominanti, o odoranti, trovati nello spazio della testa di quel materiale senza la presenza del materiale madre^{stesso 8}. Per creare un odore imitare, è necessario determinare gli odori attivi del materiale genitore. Un odorante attivo, in questo scenario, è descritto come un composto volatile che un canino addestrato per il rilevamento di esplosivi rileva, credendo che ci sia un vero materiale esplosivo presente. Dopo aver identificato composti volatili dominanti nello spazio della testa di diversi materiali esplosivi, comps era pronto a rilasciare questi singoli odori ad un ritmo controllato per la durata delle prove sul campo di rivelazione olfattiva canina e a determinare l'odore attivo associato a diversi materiali esplosivi. Comps sono stati utilizzati con successo per questo scopo^{7,9 e da allora} sono stati utilizzati come imitazioni degli odori per ulteriori allenamenti di rilevamento di esplosivi.

macias et al. I ricercatori hanno utilizzato spessori variabili e aree superficiali di sacchetti di polietilene a bassa densità per regolare il tasso di permeazione del vapore piperonale. Questa serie di COMPS è stata quindi utilizzata per stimare la soglia di rilevamento piperonale per i canini addestrati per il rilevamento di narcotici⁸. Al contrario, in uno studio separato, gli spessori dei sacchetti COMPS sono stati regolati per ridurre al minimo la deviazione dei tassi di permeazione tra ciascun composto in una serie omologa, sebbene possedesse pressioni di vapore drasticamente variabili. Se in questo studio fosse stato utilizzato un singolo spessore del sacchetto, quei composti con pressioni di vapore più elevate avrebbero prodotto tassi di permeazione molto più elevati. Aumentando lo spessore del sacchetto per i composti a maggiore volatilità, i tassi di permeazioni sono stati regolati in modo che fossero simili per tutti i^{composti 4}. Entrambi gli studi dimostrano l'utilità e l'adattabilità del COMPS per controllare il rilascio di vapore. Studi simili che ottimizzano lo spessore del sacchetto polimerico e il materiale assorbente sono stati effettuati nella creazione di imitazioni degli odori per catinoni sintetici (cioè sali da bagno)^10,altri narcotici (tra cui eroina e marijuana¹¹⁾e composti dell'odore umano^12,13. In un ultimo esempio, Simon et al. Interi pezzi di corteccia d'albero infetta, invece degli odori estratti, sono stati collocati direttamente nel sacchetto polimerico per controllare il rilascio durante il test di olfatto canino¹⁴. COMPS può essere utilizzato per una varietà di scenari e i protocolli qui discussi sono stati scelti per dimostrare la diversità di questo strumento.

Protocollo

1. Montaggio del COMPS (Figura 1)

1. Per un composto pulito (liquido) su un substrato(figura 1A)
   1. Per impregnare il substrato con odorante, utilizzare una pipetta calibrata per aggiungere 5 μL di composto pulito a un cuscinetto di garza di cotone da 2 x 2 pollici o altro substrato preferito (vedi Tabella dei materiali).
   2. Piegare il cuscinetto di garza a metà e posizionare questo (o un materiale di substrato alternativo) in un sacchetto permeabile in polietilene a bassa densità da 2 x 3 pollici. Gli spessori del sacchetto suggeriti sono tra 1 MIL, per il tasso di permeazione più veloce, a 8 MIL, per un tasso di permeazione più lento.
      NOTA: Possono essere utilizzate variazioni nei materiali assorbenti, nelle dimensioni del sacchetto permeabile, nella chimica dei polimeri e nello spessore, ma queste modifiche influenzano il tasso di permeazione degli odoranti (vedi ulteriori discussioni nella sezione Risultati).
   3. Sigillare immediatamente il sacchetto di polimero chiuso con un sigillare termico, eliminando quanta più aria possibile dall'interno dei sacchetti.
   4. Conservare la borsa in un sacchetto esterno non permeabile, o se verrà utilizzata immediatamente, posizionare la borsa in una barca di pesata pulita in un cofano dei fumi (Figura 1B).
2. Per il materiale solido, non è necessario alcun substrato(Figura 1C)
   1. Pesare la quantità desiderata di materiale solido, che può essere un composto puro o materiale bersaglio effettivo, e posizionare in un sacchetto permeabile in polietilene a bassa densità (LDPE) da 2 x 3 pollici. Ancora una volta, lo spessore suggerito del sacchetto varia da 1 MIL a 8 MIL.
   2. Sigillare immediatamente il sacchetto di polimero chiuso, eliminando quanta più aria possibile dall'interno della borsa, e conservare o mettere da parte in una barca di pesare.

2. Analisi gravimetrica per determinare il tasso di permeazione COMPS

NOTA: Una temperatura ambiente costante è importante per misurazioni accurate e riproducibili, sia gravimetriche che headspace. Una temperatura costante deve essere mantenuta durante tutte le prove. Si consiglia di eseguire tutte le misurazioni analitiche alle temperature desiderate durante il test.

1. Per determinare il tasso di permeazione degli odori attraverso la borsa permeabile, posizionare un COMPS di nuova fabbricazione in una barca di pesata all'interno di una cappa aspirante.
2. Posizionare una barca di pesata pulita e separata su un bilanciamento analitico e azzerare il bilanciamento.
3. Rimuovere il COMPS dalla cappa dei fumi e posizionarsi sulla bilancia. Registrare la massa e tornare immediatamente al cofano dei fumi.
4. Continuare a registrare la massa del COMPS su incrementi di tempo regolari fino a quando la massa del COMPS non cambia più (±5%). A questo punto l'odore del COMPS è esaurito.
5. Come controllo negativo, creare un COMPS vuoto costituito solo dal materiale del substrato senza odori sigillati nel sacchetto permeabile. Trattare questo controllo negativo allo stesso modo del COMPS con odorante per garantire fluttuazioni minime di massa nel tempo.
6. Calcolare il tasso di permeazione dal COMPS.
   1. Traccia la massa del COMPS rispetto al tempo su un grafico X-Y in un software di analisi statistica appropriato.
   2. Adattare una linea di tendenza lineare solo alla parte lineare del grafico e visualizzare un'equazione su un grafico. La linea di tendenza NON deve essere impostata per includere l'origine. La pendenza della linea (cioè m in y = m+ b) è il tasso di permeazione in massa per unità di tempo.

3. Analisi dello spazio di testa mediante microesezione in fase solida con gascromatografia/spettrometria di massa (SPME-GC/MS) (opzionale)

1. Preparare un COMPS fresco seguendo le istruzioni di cui sopra e consentirgli di equilibrare in una barca a pesare aperta all'interno di una cappa aspirante per 30 minuti.
2. Rimuovere il COMPS dalla barca di pesatura, posizionarlo in un contenitore di campioni di metallo rivestito in epossidico da 1 pinta senza coperchio e metterlo in un contenitore metallico rivestito in epossidico da 1 gallone. I contenitori devono essere tenuti in una cappa aspirante per tutta la durata dell'esperimento.
3. Lasciare almeno 30 minuti per l'equilibrazione nel contenitore prima del campionamento.
4. Per il campionamento dopo l'equilibrazione, posizionare un coperchio con un foro di 1 cm precedentemente praticato in cima al contenitore esterno. Inserire una fibra SPME appropriata attraverso il foro sul coperchio per estrarre l'anale di interesse. Quando la fibra SPME non viene utilizzata, coprire il foro con pellicola di paraffina o simili. Il tempo di estrazione e il rivestimento in fibra dipenderanno dal tipo e dalla quantità di vapore di alita presente, nonché dalle dimensioni del contenitore di campionamento e dalle condizioni ambientali¹⁵.
5. Rimuovere la fibra SPME dopo il tempo di estrazione assegnato e posizionarsi nell'ingresso riscaldato di un GC/MS per il desorbimento termico e l'analisi.
   1. Eseguire il metodo GC/MS appropriato per il composto utilizzato in COMPS¹⁶.
6. Per la quantificazione, confrontare l'area di picco risultante con una curva^{di calibrazione esterna 16} e/o uno standard^{interno 17,} a titolo appropriato per il metodo e la progettazione sperimentale.
   NOTA: 1) In questo esempio sono stati utilizzati contenitori per campioni metallici rivestiti di epossidici, ma sarebbero adatti anche altri tipi di contenitori. Per confrontare direttamente la disponibilità di odori con le valutazioni olfattive sul campo, sarebbe meglio utilizzare lo stesso contenitore, pulito tra ogni prova, per entrambi gli esperimenti; 2) Per risultati riproducibili, tutti gli aspetti della procedura di campionamento devono essere mantenuti in tutti gli esperimenti di replicazione, compresi, a titolo oso ma non limitato, il tempo di estrazione dell'SPME, il tipo e le dimensioni del contenitore e le condizioni ambientali (temperatura e umidità).

4. Archiviazione COMPS

1. Posizionare un singolo COMPS in un sacchetto barriera metallizzato (3,5 x 4,5 pollici) e sigillare il calore per chiudersi, rimuovendo quanta più aria possibile dalla borsa prima della sigillatura(Figura 1B).
2. Conservare in condizioni ambientali o refrigerate fresche, ma non al di sotto o vicino al congelamento per evitare la formazione di condensa man mano che comps si scongela.
3. Se si testano più odori o tassi di consegna degli odori in un singolo esperimento, si consiglia il contenimento secondario per eliminare qualsiasi possibile contaminazione incrociata durante il trasporto e lo stoccaggio.
   1. Posizionare replicare più sacchi barriera ciascuno contenente comps individuali dello stesso alita e tasso di permeazione in un sacchetto o barattolo di vetro metallicizzato esterno più grande per lo stoccaggio e il trasporto.

5. Prove olfattive sul campo

NOTA: I test olfattivi possono essere eseguiti in molti modi diversi a seconda dell'animale sottoposto a test, dell'obiettivo dell'esperimento e delle condizioni ambientali. Il protocollo seguente descrive uno di questi tipi di test. Tutti i test sugli animali dovrebbero prima essere rivisti e approvati da un comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC).

1. Creare innanzitutto COMPS di controllo vuoto o negativo come descritto in precedenza. Rendere sufficiente in modo che ogni contenitore nello scenario di test contenga COMPS di riserva (2-3 a seconda del numero di animali coinvolti nell'esperimento). Confezionare tutti i COMPS vuoti insieme in contenimento secondario (ad esempio, una borsa metallizzata più grande o un barattolo di vetro con coperchio di tenuta).
2. Creare comps fresco in base alle esigenze per il protocollo di test sul campo previsto. Eliminare tutte le possibili fonti di contaminazione tra il COMPS e il sacchetto metallizzato. Questo può essere ottenuto cambiando regolarmente i guanti e pulendo la superficie di lavoro di laboratorio.
3. Conservare il COMPS per almeno 1 giorno prima dell'uso per consentire l'equilibrazione. Archiviare eventuali repliche nello stesso contenitore secondario. Tuttavia, comps diversi dovrebbero essere in contenitori secondari separati.
4. Per impostare una prova olfattiva canina di base, disporre più linee di almeno cinque contenitori identici (ad esempio lattine metalliche, scatole), con il numero di linee che dipendono dal numero di variabili testate.
   1. Impostare la versione di valutazione in modo che ogni riga contenga un contenitore con comps di destinazione e quattro con COMPS vuoto. Le linee di controllo positive, preparate allo stesso modo ma con un odore di destinazione noto, possono essere utilizzate come appropriato per l'esperimento, il training o lo scenario di test. Un controllo negativo aggiuntivo o una riga vuota devono contenere cinque COMPS vuoti e nessuna bersagli. Ordinare questa linea di controllo negativa, la linea di controllo positiva (se utilizzato) e le linee di test a caso e modificare l'ordine utilizzando un generatore di numeri casuali per ogni test olfattivo canino come pratico per lo scenario di test.
      1. Includere anche un odore/materiale distrattore per linea.
      2. Randomizzare l'ordine e la posizione degli odori bersaglio e distrattore in ogni linea per ogni canino sottoposto a test utilizzando un generatore di numeri casuali.
5. Per preparare i contenitori, rimuovere COMPS dai contenitori secondari ed esterni, posizionando solo il sacchetto permeabile nel contenitore di prova.
   1. Lasciare che il COMPS equilibra nel contenitore per un minimo di 30 minuti prima del test.
   2. Ripetere i passaggi per ogni COMPS utilizzato nel test, a partire dagli spazi vuoti, seguito da controlli positivi (se si utilizza), quindi testare gli odori, cambiando i guanti ogni volta.
      NOTA: Esempi dettagliati di scenari di test canini sono disponibili in Simonet^al.

Risultati

L'obiettivo primario dell'utilizzo di COMPS nei test/allenamenti olfattivi è quello di controllare il rilascio degli odori scelti e fornire una quantità controllata di odorante per tutta la durata della sessione di prova o allenamento. Il rilascio di odorante è misurato mediante analisi gravimetrica in termini di perdita di massa per unità di tempo. La figura 2 fornisce un esempio dei risultati gravimetrici della permeazione di tre COMPS identici preparati a partire da 5 μL di acido pen...

Discussione

I sistemi di permeazione odorimica controllata (COMPS) sono facilmente creati sigillando un odore di interesse in una borsa permeabile. Questo può essere fatto pipettando un composto liquido pulito su un materiale assorbente e quindi posizionando il materiale assorbente nel sacchetto; posizionando un composto puro e solido direttamente nella borsa⁴, come è stato fatto nel caso del piperonale^8; o posizionando il materiale bersaglio contenente odori multipli o sconosciuti i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 oz economy jars (70-450 finish)	Fillmore container	A16-08C-Case 12
7890A gas chromatograph / 5975 mass selective detector	Agilent
Analytical balance	Mettler Toledo	01-911-005
Ball regualr bands and dome lids	Fillmore container	J30000
Cotton gauze (2" x 2")	Dukal
Disposable weighing boats	VWR	10803-148
Epoxy-lined sample containers, 1 gallon	TriTech Forensics	CANG-E
Epoxy-lined sample containers, 1 pint	TriTech Forensics	CANPT-E
Low density polyetheylene bag	Uline	S-5373
Rtx-Volatiles (30 m x 0.32 mmID) column	Restek	10901
Silver metalized mylar barrier bag (3.5" x 4.5")	ESP Packaging	95509993779
Silver metalized mylar barrier bag (5" x 8.5" x 3")	ESP Packaging	95509993793
Solid phase microextration fiber assembly (PDMS/DVB/CAR)	Sigma-Aldrich	57328-U
Solid phase microextration holder	Sigma-Aldrich	57330-U
Tabletop Impulse Sealer	Uline	H-190	Heat sealer